Rilevamento di alterazioni mirabili nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando il sequenziamento di nuova generazione
10 ottobre 2025
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento di nuova generazione automatizzato e accreditato ISO15189 per rilevare alterazioni genomiche mirabili in tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina per carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).
La mia ricerca scopre mutazioni genetiche nel cancro per migliorare la diagnosi e il trattamento. Per cominciare, registra le informazioni sul campione nel Laboratory Information Management System e compila il modulo di consenso informato per il test delle mutazioni geniche. Utilizzando lame microtomi usa e getta, tagliare sezioni dal cancro polmonare non a piccole cellule, campione formale e fisso di paraffina incorporata.
Successivamente esegui una colorazione di routine di ematossilina ed eosina per valutare il contenuto delle cellule tumorali. Per l'estrazione degli acidi nucleici, si utilizza un microtomo, si seziona il blocco formale e fisso in paraffina per ottenere un nastro, e si colloca il nastro in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Trasferire il tubo nella posizione designata in ingresso del campione sullo strumento di estrazione automatico.
Successivamente, usa uno strumento di estrazione automatica con un kit di estrazione automatica. Sostituire i passaggi manuali di pipettura con un sistema automatico di estrazione di acidi nucleici a sfera magnetica. Poi seleziona il programma C1102 sullo strumento.
Scegli il tempo di incubazione del campione di de-ceratura come 16 ore e imposta il volume eluciano a 100 microlitri. Usa la spettrofotometria per verificare la purezza del DNA. Successivamente si utilizza un kit di rilevamento con coloranti fluorescenti specifici per la sequenza per eseguire un test fluorometrico e una misurazione precisa della concentrazione di DNA.
Per preparare DNA genomico frammentato tramite ultrasonicazione, mescolare 200 nanogrammi di DNA genomico in 50 microlitri di tampone a basso tris-EDTA. Posiziona il tubo del campione in un rack pre-raffreddato, mantenuto a otto gradi Celsius. Imposta i parametri dello strumento secondo il protocollo e avvia la frammentazione del DNA.
Per avviare la preparazione automatica della libreria, premi il pulsante di accensione per attivare il sistema e attendi il completamento dell'inizializzazione. Naviga nelle impostazioni del programma, seleziona run protocol e scegli il protocollo BurningRock HS. Imposta il tipo di campione su DNA di alta qualità, la quantità di nanogrammi in input a 50, i cicli pre-PCR a 12 e i cicli post-PCR a 12. Poi clicca su Esegui per procedere.
Successivamente inserisci la cartuccia preconfezionata del reagente nello slot designato dello strumento, che convaliderà automaticamente il posizionamento e lo stato del reagente. Dopo aver caricato i campioni, premi start per avviare l'esecuzione autonoma. Osserva gli indicatori LED sul sistema per monitorare i progressi.
Dopo la fine del programma, clicca su OK per confermare e il sistema trasferirà automaticamente la biblioteca finale nel tubo della biblioteca, completando così la preparazione della biblioteca. Misura la concentrazione sia della pre-biblioteca che della libreria totale utilizzando la fluorometria. Diluire la libreria di sequenziamento a 1,6 picomolar e 1300 microlitri per le operazioni di sequenziamento.
Controlla l'ambiente di sequenziamento mantenendo una temperatura e umidità interna. Controllo completo della qualità dei dati di output dello strumento verificando la qualità di base sopra Q 30 e filtro passaggio di densità di cluster. Il flusso di lavoro ottimizzato per la rilevazione ha identificato in modo affidabile diverse alterazioni genomiche clinicamente attuabili in campioni tumorali rappresentativi.
I risultati del sequenziamento hanno mostrato un EGFR ad alta frequenza p. Mutazione missense L858R, accompagnata da una significativa amplificazione del numero di copie del gene EGFR. È stata osservata un'amplificazione moderata del gene MET e una bassa amplificazione del gene BRAF.
Il campione ha mostrato un carico di mutazione tumorale intermedia e uno stato stabile dei microsatelliti. Tutti i loci genici mirati, inclusi ALK, BRAF, KRAS e ROS1, hanno raggiunto un tasso di rilevamento del 100% in quattro esperimenti replicati. Ogni mutazione è stata rilevata in modo coerente in tutti e quattro gli esperimenti ripetuti, con valori di abbondanza attesi rimasti all'interno dell'intervallo normale di fluttuazione; NJS fornisce un profilo genetico compressivo per il cancro ai polmoni non a piccole cellule rilevando contemporaneamente geni comuni, rari e nuovi.
Le nostre future ricerche si concentreranno sulla combinazione della patologia molecolare con l'intelligenza artificiale per esplorare nuovi biomarcatori per il cancro ai polmoni.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento di prossima generazione automatizzato, accreditato ISO15189, per la rilevazione di alterazioni genomiche targettabili nei tessuti di cancro del polmone a cellule non piccole (NSCLC) fissati in formalina e inclusi in paraffina. Il processo include la registrazione del campione, il sezionamento e l'estrazione degli acidi nucleici.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Oncologia
- Genomica
- Patologia
Sfondo
- Il cancro del polmone a cellule non piccole (NSCLC) è un tipo comune di cancro del polmone.
- L'identificazione delle alterazioni genomiche è cruciale per le terapie mirate.
- I tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono spesso utilizzati nella ricerca sul cancro.
- I flussi di lavoro automatizzati possono migliorare l'efficienza e l'accuratezza nei test genomici.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un flusso di lavoro di sequenziamento affidabile per campioni NSCLC.
- Migliorare la rilevazione delle alterazioni genomiche targettabili.
- Garantire la conformità agli standard ISO15189.
Metodi utilizzati
- Registrare le informazioni sui campioni nel Sistema di Gestione delle Informazioni di Laboratorio.
- Tagliare sezioni dai campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina utilizzando lame di microtomo.
- Effettuare colorazione di routine con ematossilina ed eosina per valutare il contenuto di cellule tumorali.
- Estrarre gli acidi nucleici utilizzando uno strumento di estrazione automatizzato.
Principali risultati
- Estrazione riuscita di acidi nucleici dai campioni NSCLC.
- Dati genomici di alta qualità ottenuti per alterazioni targettabili.
- Il flusso di lavoro ha dimostrato la conformità all'accreditamento ISO15189.
- Capacità diagnostiche migliorate per il trattamento NSCLC.
Conclusioni
- Il flusso di lavoro di sequenziamento automatizzato è efficace per NSCLC.
- La conformità agli standard ISO15189 migliora l'affidabilità dei risultati.
- Questo protocollo può essere adattato per altri tipi di cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Comprehensive detection of actionable genomic alterations in non-small cell lung cancer (NSCLC) is critical for precision oncology and portfolio advancement. Automated, ISO15189-certified next-generation sequencing (NGS) workflows enable high-confidence identification of mutations, fusions, and amplifications, supporting robust target validation and risk-adjusted decision-making. Standardized, reproducible NGS processes reduce technical variability and accelerate translational research integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise identification of driver mutations and gene amplifications for functional target validation.
- Supports biological de-risking by detecting both common and rare genomic alterations in NSCLC samples.
- Facilitates predictive confidence in target selection through rigorous quality control and replicate concordance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genomic profiles for downstream compound screening and biomarker assay development.
- Standardizes sample processing and library preparation to ensure reproducibility and quantitative reliability.
- Automated workflows minimize human error, supporting scalable and high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant biomarkers for translational continuity in NSCLC research.
- Enables risk-adjusted advancement by providing comprehensive mutation and amplification data for preclinical models.
- Supports integration of molecular pathology and emerging biomarker discovery for future translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This NGS workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by delivering high-fidelity genomic data from clinical NSCLC samples.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification through comprehensive mutation detection.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative genomic outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-quality, statistically validated readouts for cross-condition comparison and decision support.
- Translational Research: Ensures biomarker alignment and continuity from discovery through preclinical validation in NSCLC.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for ongoing molecular profiling across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and rigorous QC.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable genomic data for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of NSCLC and other oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular pathology, NGS instrumentation, and bioinformatics analysis.
- Demands access to automated extraction and library preparation systems with validated protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample input, QC thresholds, and data interpretation.
- Must adapt protocols for varying tumor cellularity and FFPE sample quality.
- Turnaround time and technical complexity remain practical considerations for clinical and translational deployment.
