Rilevamento di alterazioni mirabili nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

La mia ricerca scopre mutazioni genetiche nel cancro per migliorare la diagnosi e il trattamento. Per cominciare, registra le informazioni sul campione nel Laboratory Information Management System e compila il modulo di consenso informato per il test delle mutazioni geniche. Utilizzando lame microtomi usa e getta, tagliare sezioni dal cancro polmonare non a piccole cellule, campione formale e fisso di paraffina incorporata.

Successivamente esegui una colorazione di routine di ematossilina ed eosina per valutare il contenuto delle cellule tumorali. Per l'estrazione degli acidi nucleici, si utilizza un microtomo, si seziona il blocco formale e fisso in paraffina per ottenere un nastro, e si colloca il nastro in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Trasferire il tubo nella posizione designata in ingresso del campione sullo strumento di estrazione automatico.

Successivamente, usa uno strumento di estrazione automatica con un kit di estrazione automatica. Sostituire i passaggi manuali di pipettura con un sistema automatico di estrazione di acidi nucleici a sfera magnetica. Poi seleziona il programma C1102 sullo strumento.

Scegli il tempo di incubazione del campione di de-ceratura come 16 ore e imposta il volume eluciano a 100 microlitri. Usa la spettrofotometria per verificare la purezza del DNA. Successivamente si utilizza un kit di rilevamento con coloranti fluorescenti specifici per la sequenza per eseguire un test fluorometrico e una misurazione precisa della concentrazione di DNA.

Per preparare DNA genomico frammentato tramite ultrasonicazione, mescolare 200 nanogrammi di DNA genomico in 50 microlitri di tampone a basso tris-EDTA. Posiziona il tubo del campione in un rack pre-raffreddato, mantenuto a otto gradi Celsius. Imposta i parametri dello strumento secondo il protocollo e avvia la frammentazione del DNA.

Per avviare la preparazione automatica della libreria, premi il pulsante di accensione per attivare il sistema e attendi il completamento dell'inizializzazione. Naviga nelle impostazioni del programma, seleziona run protocol e scegli il protocollo BurningRock HS. Imposta il tipo di campione su DNA di alta qualità, la quantità di nanogrammi in input a 50, i cicli pre-PCR a 12 e i cicli post-PCR a 12. Poi clicca su Esegui per procedere.

Successivamente inserisci la cartuccia preconfezionata del reagente nello slot designato dello strumento, che convaliderà automaticamente il posizionamento e lo stato del reagente. Dopo aver caricato i campioni, premi start per avviare l'esecuzione autonoma. Osserva gli indicatori LED sul sistema per monitorare i progressi.

Dopo la fine del programma, clicca su OK per confermare e il sistema trasferirà automaticamente la biblioteca finale nel tubo della biblioteca, completando così la preparazione della biblioteca. Misura la concentrazione sia della pre-biblioteca che della libreria totale utilizzando la fluorometria. Diluire la libreria di sequenziamento a 1,6 picomolar e 1300 microlitri per le operazioni di sequenziamento.

Controlla l'ambiente di sequenziamento mantenendo una temperatura e umidità interna. Controllo completo della qualità dei dati di output dello strumento verificando la qualità di base sopra Q 30 e filtro passaggio di densità di cluster. Il flusso di lavoro ottimizzato per la rilevazione ha identificato in modo affidabile diverse alterazioni genomiche clinicamente attuabili in campioni tumorali rappresentativi.

I risultati del sequenziamento hanno mostrato un EGFR ad alta frequenza p. Mutazione missense L858R, accompagnata da una significativa amplificazione del numero di copie del gene EGFR. È stata osservata un'amplificazione moderata del gene MET e una bassa amplificazione del gene BRAF.

Il campione ha mostrato un carico di mutazione tumorale intermedia e uno stato stabile dei microsatelliti. Tutti i loci genici mirati, inclusi ALK, BRAF, KRAS e ROS1, hanno raggiunto un tasso di rilevamento del 100% in quattro esperimenti replicati. Ogni mutazione è stata rilevata in modo coerente in tutti e quattro gli esperimenti ripetuti, con valori di abbondanza attesi rimasti all'interno dell'intervallo normale di fluttuazione; NJS fornisce un profilo genetico compressivo per il cancro ai polmoni non a piccole cellule rilevando contemporaneamente geni comuni, rari e nuovi.

Le nostre future ricerche si concentreranno sulla combinazione della patologia molecolare con l'intelligenza artificiale per esplorare nuovi biomarcatori per il cancro ai polmoni.