Name: Sviluppo e valutazione di un modello di ratto di difetti della cartilagine a tutto spessore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Scopri un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore nel ratto per valutare trattamenti terapeutici. Questo metodo misura iperalgesia e cambiamenti istopatologici per studiare l'osteoartrite post-traumatica.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Zhejiang Natural Science Foundation (numero di sovvenzione LQ20H270009), dalla Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82074464 e 82104890), dalla Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (numero di sovvenzione 2020ZA039, 2020ZA096 e 2022ZB137) e dal Medical Health Science and Technology Project della Commissione sanitaria provinciale di Zhejiang (numero di sovvenzione 2016KYA196).

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Medical Standards and Ethics Committee della Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, che è conforme alla legislazione cinese sull'uso e la cura degli animali da laboratorio. Nel presente studio, sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di 6 settimane del peso di 150-180 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi la tabella dei materiali).
1. Definizione di un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore nei ratti
<ol><li>Dopo 1 settimana di acclimatazione al nuovo ambiente, dividere casualmente e equamente i ratti in due gruppi (n = 8 ratti / gruppo). I ratti nel gruppo sham avranno la chirurgia fittizia, mentre i ratti nel gruppo modello avranno la chirurgia sperimentale che prevede fori nel solco trocleare femorale. NOTA: Ogni gabbia deve essere coperta con imbottiture sterili di pannocchie (vedi la tabella dei materiali) per proteggere le dita dei ratti.</li>
	<li>Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di pentobarbital sodico (40 mg/kg). Quindi, premere delicatamente le dita dei ratti per confermare un'adeguata anestesia. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi dei ratti per prevenire la secchezza durante l'anestesia. NOTA: La chirurgia animale deve essere eseguita in una sala operatoria dedicata utilizzando strumenti chirurgici autoclavati. Gli operatori devono indossare camici da laboratorio puliti, maschere facciali, copricapo e guanti sterili durante l'intervento. Posizionare cuscinetti sterili sopra l'area chirurgica e sterilizzare tutte le attrezzature prima dell'uso. Fornire supporto termico durante tutta la procedura.</li>
	<li>Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina, radersi gli arti posteriori sinistro e destro e pulire l'area dell'articolazione del ginocchio con sapone chirurgico, seguito alternando soluzione antisettica povidone-iodio e alcol tre volte in condizioni sterili. Posizionare un drappo sterile sul ratto ed esporre solo l'articolazione del ginocchio disinfettata.</li>
	<li>Fare un'incisione di 1 cm con una lama di bisturi (numero 11) nel mezzo dell'articolazione del ginocchio del ratto dall'alto verso il basso e tagliare la capsula articolare e il tendine del quadricipite femorale lungo il bordo mediale della rotula dopo la dissezione superficiale. NOTA: Il tendine del quadricipite femorale è attaccato alla rotula e al condilo femorale durante la flessione dell'articolazione del ginocchio13. Il solco visto nella capsula articolare è il solco trocleare femorale, e il condilo femorale distale forma i condili mediali e laterali.</li>
	<li>Ruotare la rotula verso l'esterno e flettere la tibia e il perone con un angolo di 90° per esporre completamente la troclea del condilo femorale. Utilizzare una punta circolare da 1,6 mm di diametro (vedere la tabella dei materiali) verticale alla superficie della cartilagine a 4.000 giri/min per 10 s per creare un difetto della cartilagine a tutto spessore nella scanalatura trocleare femorale con una profondità di 0,1 mm. NOTA: Utilizzare soluzione salina in modo intermittente per ridurre al minimo il trauma termico al tessuto osseo circostante durante la procedura di perforazione.</li>
	<li>Pulire il sito chirurgico con batuffoli di cotone imbevuti di una soluzione salina allo 0,9%, sostituire la rotula, mantenere il ginocchio in una posizione di estensione e suturare l'incisione strato per strato con suture 4-0 non assorbibili (vedi Tabella dei materiali).<ol><li>Posizionare gli animali su cuscinetti riscaldanti con recumbency sternale, monitorarli fino al loro risveglio e poi riportarli nelle loro gabbie. Iniettare buprenorfina (0,05 mg/kg) per via sottocutanea ogni 8 ore tre volte dopo l'operazione per alleviare il dolore.</li>
	</ol></li>
	<li>Testare il comportamento correlato al dolore di tutti i ratti a 3 giorni, 10 giorni e 17 giorni dopo l'intervento, come descritto nel paragrafo 2.</li>
</ol>2. Soglia di prelievo meccanico (MWT)
NOTA: Il MWT del plantare posteriore bilaterale dei ratti è stato misurato con il classico metodo di misurazione del dolore del filamento di von Frey14.
<ol><li>Posizionare il ratto in una singola camera di plastica (17 cm x 11 cm x 13 cm) su una piattaforma di rete metallica (vedere la tabella dei materiali) e posizionare la base di rete metallica 50 cm sopra un tavolo. Misurare il MWT dopo 30 minuti di adattamento.</li>
	<li>Premere il filamento di von Frey (vedi la tabella dei materiali) perpendicolarmente sulla superficie plantare della zampa posteriore di ciascun ratto e piegare il pennello per circa 2 s, evitando la parte più spessa del centro della zampa posteriore.</li>
	<li>Aumentare gradualmente il peso dello stimolo dai 4 g più bassi fino a quando non si verifica una risposta positiva (ritiro della zampa o leccatura della zampa). NOTA: L'intervallo tra ogni stimolazione deve essere superiore a 1 minuto. Il MWT è definito come tre risposte positive in cinque stimolazioni; Registra il peso dello stimolo in grammi.</li>
	<li>Calcolare i valori medi per i gruppi sham e modello in base al peso minimo dello stimolo registrato in grammi.</li>
</ol>3. Analisi istopatologiche e immunoistochimiche
<ol><li>A 17 e 56 giorni dopo l'intervento chirurgico, anestetizzare i ratti con un pentobarbital sodico (i.p.) di 40 mg/kg e sacrificare tutti i ratti prelevando il sangue dal cuore. Isolare le ginocchia tagliando l'osso a metà femore e metà tibia e sezionare il tessuto muscolare circostante. Rimuovere le articolazioni del ginocchio per l'analisi istologica.</li>
	<li>Fissare le articolazioni del ginocchio in 20 ml di soluzione di paraformaldeide al 10% per 48 ore a temperatura ambiente, quindi decalcificarle con 20 ml di soluzione di EDTA al 10% in uno shaker orbitale per 8 settimane a 4 °C. Cambiare la soluzione EDTA ogni giorno.</li>
	<li>Tagliare l'articolazione del ginocchio per adattarla alle dimensioni della scatola di incorporamento. Incorporare le articolazioni del ginocchio disidratate in 100% paraffina15.</li>
	<li>Posizionare le articolazioni del ginocchio incorporate in paraffina sul supporto di un microtomo, regolare l'angolo e tagliare il campione di paraffina con una lama fino a quando la superficie non è piatta.</li>
	<li>Impostare lo spessore delle fette di paraffina a 3 μm e appiattire le fette a bagnomaria a 40 °C.</li>
	<li>Incollare le fette su vetrini, metterle in una macchina da forno a 45 °C (vedere la tabella dei materiali) fino a quando non sono asciutte e conservarle a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deceratura e reidratazione: decerare le fette in forno a 60 °C per 4 ore, quindi posizionare le fette successivamente in xilene al 100% (tre volte), etanolo al 100% (due volte), etanolo al 95%, etanolo all'80% e etanolo al 75% per 5 minuti ogni volta.</li>
	<li>Colorazione con ematossilina ed eosina (H & E)<ol><li>Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Macchiare le fette con ematossilina allo 0,5% (vedi Tabella dei materiali) per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non vi è alcun residuo di ematossilina sulle superfici delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in alcool cloridrico all'1% per 3 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in acqua ammoniacale all'1% per 10 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Macchiare le fette con eosina (vedi Tabella dei materiali) per 1 minuto e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di eosina sulle superfici delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di resina neutra (vedi Tabella dei materiali) a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione Safranin O/Fast Freen (SO)<ol><li>Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Macchiare le fette con 0,05% Fast Green (vedi la tabella dei materiali) per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui Fast Green sulla superficie delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in una soluzione di acido acetico all'1% per 10 s e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Macchiare le fette con il 2,5% di SO (vedi Tabella dei materiali) per 2 minuti, quindi lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di SO sulle superfici delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione blu toluidina (TB)<ol><li>Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in una soluzione all'1% TB (vedere la tabella dei materiali) per 2 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non vi è alcun residuo di blu di toluidina sulla superficie delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione Masson<ol><li>Decerare, reidratare e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di Bouin (vedere la tabella dei materiali) a goccia sulle fette, colorarle a 37 °C per 2 ore e lavarle con acqua distillata due volte fino a quando il colore giallo sulla superficie delle fette scompare.</li>
		<li>Macchiare le fette con blu celestite (vedere la tabella dei materiali) per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di blu celestite sulle superfici delle fette.</li>
		<li>Macchiare le fette con ematossilina per 3 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non vi è alcun residuo di ematossilina sulle superfici delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in etanolo acido per 5 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Macchiare le fette con Ponceau fuchsin (vedi la tabella dei materiali) per 10 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di Ponceau fuchsin sulle superfici delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in acido fosfomolibdico (vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti, quindi immergerle in soluzione TB per 5 minuti e lavare le fette con acqua bidistillata fino a quando non ci sono residui di TB sulla superficie delle fette.</li>
		<li>Immergere le fette in una soluzione acida debole per 2 minuti e lavare le fette con acqua distillata due volte per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Osservare tutte le fette al microscopio in un ambiente in doppio cieco per determinare il grado di degenerazione della cartilagine articolare secondo il sistema di punteggio di Mankin16.</li>
	<li>Immunoistochimica<ol><li>Decerare e reidratare le fette di routine e lavare le fette con PBS per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in una soluzione di citrato di sodio e porre le fette in forno a 60 °C per 4 ore per riparare l'antigene. Lavare le fette con PBS tre volte per 3 minuti ciascuna.</li>
		<li>Immergere le fette in una soluzione Triton X-100 allo 0,3% per 10 minuti e lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Bloccare l'attività della perossidasi endogena aggiungendo una soluzione di H 2O2 al 3% in metanolo a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Incubare le sezioni con siero di capra al 5% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame non specifico. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di anticorpi primari diluiti con PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; e anti-MMP13, 1:100; vedere la tabella dei materiali) a ciascuna fetta e incubarli per una notte a 4 °C. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Incubare ogni fetta con 100 μL di anticorpo secondario PBS-diluito (1:100) (capra anti-coniglio o capra anti-topo, vedere la Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare le fette due volte con PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB; vedere la tabella dei materiali) a ciascuna fetta.</li>
		<li>Osservare e registrare il tempo di comparsa di un colore marrone al microscopio; La reazione cromogenica trasforma i siti dell'epitopo in marrone17. Trattare il resto dei campioni con lo stesso tempo di reazione registrato.</li>
		<li>Dopo che le fette diventano marroni, lavare le fette due volte con acqua distillata due volte per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Colorare nuovamente le fette con ematossilina per 1 minuto e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in acido cloridrico per 3 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in acqua ammoniacale all'1% per 10 secondi e lavare le fette con acqua bidistillata per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere le fette in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene al 100% (tre volte) successivamente per 1 minuto ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di resina neutra a ciascuna fetta e sigillarla con un coprifoglio.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+mediates+fibrosis+in+injured+joints+by+regulating+collagen+type+I+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).</li>
<li>Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+cartilage+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Animal models for cartilage regeneration and repair.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+regeneration+by+activated+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Medicines%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells.</a> Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo studio descrive un modello animale per imitare i difetti clinici della cartilagine praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti (Figura supplementare 1). Dopo la lesione della cartilagine, l'eccitabilità o la reattività dei nocicettori periferici è migliorata, il che può comportare una diminuzione della soglia del dolore e il miglioramento della reattività alla stimolazione18. Negli studi preclinici, la modellazione dei difetti della cartilagine i...

La cartilagine articolare è un tessuto altamente differenziato e denso costituito da condrociti e matrice extracellulare1. Lo strato superficiale della cartilagine articolare è una forma di cartilagine ialina, che ha una superficie liscia, basso attrito, buona resistenza ed elasticità ed eccellente tolleranza alle sollecitazioni meccaniche2. La matrice extracellulare comprende collagene proteoglicano e acqua, e il collagene di tipo II è il principale componente strutturale del collagene, in quanto rappresenta circa il 90% del collagene totale3. Poiché non esistono vasi sanguigni o nervi nel tessuto cartilagineo, manca la capacità di auto-ripararsi dopo l'infortunio4. Pertanto, i difetti della cartilagine causati da traumi sono sempre stati una malattia articolare intrattabile nelle cliniche; Inoltre, questa malattia articolare tende a colpire i giovani e l'incidenza globale è in aumento 5,6. L'articolazione del ginocchio è il sito più comune di difetti della cartilagine, e i difetti qui sono accompagnati da dolori articolari, disfunzione articolare e degenerazione della cartilagine articolare, che alla fine porta all'artrosi del ginocchio (kOA)7. I difetti della cartilagine dell'articolazione del ginocchio comportano oneri economici e fisiologici per i pazienti e influenzano seriamente la qualità della vita dei pazienti8. Questa malattia rappresenta una sfida clinica importante e urgente senza soluzioni imminenti. Attualmente, la chirurgia è il cardine del trattamento per i difetti della cartilagine, ma il suo esito a lungo termine rimane insoddisfacente9.
I difetti clinici della cartilagine alla fine portano al kOA e, quindi, i modelli animali di kOA sono comunemente usati per lo studio patologico dei difetti della cartilagine e dello sviluppo di farmaci. La creazione di modelli animali è importante per comprendere il processo fisiopatologico di riparazione dei difetti cartilaginei che possono essere utilizzati per osservare la rigenerazione della cartilagine e l'alterazione tra fibrocartilagine e cartilagine ialina10. Tuttavia, i modelli animali kOA comunemente usati, come i modelli chirurgici di transezione del legamento crociato anteriore (ACLT), destabilizzazione del menisco mediale (DMM), ovariectomia (OVX) e Hulth, di solito richiedono una modellazione a lungo termine e consentono solo valutazioni patologiche e del dolore, il che pone limiti all'efficienza dello sviluppo del farmaco11. Oltre ai modelli chirurgici, anche i modelli chimici, come il monoiodoacetato (MIA) e l'iniezione di papaina, provocano difetti della cartilagine, ma il grado del difetto non può essere ben gestito e le condizioni sono lontane dalla realtà clinica11. La collisione è un altro approccio ai difetti della cartilagine modello negli animali più grandi, ma questo metodo dipende dall'uso di strumenti specifici e viene applicato raramente12.
In sintesi, i modelli di kOA esistenti non sono ideali per studiare la patogenesi dei difetti della cartilagine o sviluppare nuovi farmaci ed è necessario un modello specifico e standardizzato per i difetti della cartilagine. Questo studio ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale nei ratti. Sono stati condotti l'osservazione grossolana, i test sul comportamento del dolore e l'analisi istopatologica per la valutazione del modello. A differenza di altri modelli animali di kOA, questo modello ha scarso effetto sulle condizioni generali dei ratti. Questo approccio modellistico è accessibile, può essere ben gestito e supporta la comprensione della progressione dai difetti della cartilagine al kOA e lo sviluppo di terapie efficaci. Questo modello può anche essere utilizzato per testare terapie che prevengono il kOA curando i difetti nelle articolazioni pre-osteoartritiche.

<table><tbody><tr><td>3,3 '-diaminobenzidina &nbsp;</td>Fornitore verificato - <td>Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZLI-9019</td><td>Il colorante per la colorazione IHC</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-collagene III</td><td>Novus</td><td>NB600-594</td><td>Anticorpo primario per l'anticorpo IHC</td></tr><tr><td>Anti-Collagene II</td><td>Abcam (UK)</td><td>34712</td><td>Anticorpo primario per l'anticorpo IHC</td></tr><tr><td>Anti-Collagene I</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Anticorpo primario per la soluzione IHC</td></tr><tr><td>Bouin</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Il colorante per la colorazione Masson</td></tr><tr><td>blu Celestite Shanghai</td><td>Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Il colorante per la colorazione Masson</td></tr><tr><td>Imbottiture di pannocchia &nbsp;</td><td>Xiaohe Technology Co., Ltd&nbsp;</td><td></td><td>Lettiere per animali</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861006</td><td>Il colorante per la colorazione HE</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>Il colorante per la colorazione SO</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo</td><td>di capra ZSGQ-BIO (Pechino, Cina)</td><td>PV-9002</td><td>Anticorpo secondario per l'anticorpo anti-coniglio di capra IHC</td></tr><tr><td></td><td>ZSGQ-BIO (Pechino, Cina)</td><td>PV-9001</td><td>Anticorpo secondario per l'ematossilina IHC</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3163</td><td>Il colorante per la colorazione HE</td></tr><tr><td>Masson</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Il colorante per la colorazione Masson</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>Rwd Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Attrezzatura per chirurgia</td></tr><tr><td>MMP13</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>69926</td><td>Anticorpo primario per IHC</td></tr><tr><td>Centro modulare per l'inclusione dei tessuti</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>EC 350</td><td>Produrre blocchi di paraffina</td></tr><tr><td>Resina neutra</td><td>Hangzhou Zhengbo Fornitore verificato - Biotecnologia Co., Ltd.</td><td>ZLI-9555</td><td>Guarnizione per</td></tr><tr><td>sutura non assorbibile</td> IHC <td>Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.</td><td>4-0</td><td>Attrezzature per chirurgia</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico&nbsp;</td>Fornitore verificato - <td>Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.</td><td>WBBTN5G</td> Acido fosfomolibdico <td>animale anestetizzato</td></tr><tr><td></td><td>Fornitore verificato - Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Il colorante per la colorazione Masson</td></tr><tr><td>Ponceau fuchsin</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Il colorante per la colorazione Masson</td></tr><tr><td>Microtomi rotanti e scorrevoli</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>HM325</td><td>Sezioni di paraffina precise</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255</td><td>Il colorante per la colorazione SO</td></tr><tr><td>Lama per bisturi</td><td>Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.</td><td>11</td><td>Attrezzature per chirurgia</td></tr><tr><td>Soluzione di citrato di sodio (20x)</td><td>Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.</td><td>HK1222</td><td>Recupero dell'antigene per</td></tr><tr><td>ratti IHC Sprague Dawley (SD)</td><td>&nbsp; Fornitore verificato - Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.</td><td>SD</td><td>Sperimentale animale</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 5 Jr</td><td>Sakura (Giappone)</td><td></td><td>Processore di infiltrazione sottovuoto</td></tr><tr><td>Toluidina Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Il colorante per la colorazione della TB</td></tr><tr><td>Von Frey filamento</td><td>UGO Basile (Italia)&nbsp;</td><td>37450-275</td><td>Attrezzatura per test MWT</td></tr><tr><td>Piattaforma in rete metallica&nbsp;</td><td>Shanghai Yuyan Strumenti Co., Ltd.</td><td></td><td>Attrezzatura per il test MWT</td></tr></tbody></table>

sviluppo e valutazione di un modello di ratto di difetti della cartilagine a tutto spessore

Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects

I difetti della cartilagine dell'articolazione del ginocchio causati da traumi sono una lesione articolare sportiva comune nella clinica e questi difetti provocano dolori articolari, movimenti alterati e, infine, artrosi del ginocchio (kOA). Tuttavia, c'è poco trattamento efficace per i difetti della cartilagine o addirittura kOA. I modelli animali sono importanti per lo sviluppo di farmaci terapeutici, ma i modelli esistenti per i difetti della cartilagine sono insoddisfacenti. Questo lavoro ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti, e il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici sono stati utilizzati come esperimenti di lettura. Dopo l'intervento chirurgico, la soglia di ritiro meccanico è diminuita, i condrociti nel sito danneggiato sono stati persi, l'espressione della metalloproteinasi MMP13 della matrice è aumentata e l'espressione del collagene di tipo II è diminuita, coerentemente con i cambiamenti patologici osservati nei difetti della cartilagine umana. Questa metodologia è facile e semplice da eseguire e consente un'osservazione grossolana immediatamente dopo l'infortunio. Inoltre, questo modello può imitare con successo i difetti clinici della cartilagine, fornendo così una piattaforma per lo studio del processo patologico dei difetti della cartilagine e lo sviluppo di farmaci terapeutici corrispondenti.

In questo lavoro, è stato stabilito un modello di ratto di FTCD praticando fori nel solco trocleare femorale e rilevando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici. Come mostrato nella Figura 1, 3 giorni dopo la modellazione, rispetto al gruppo sham, il MWT dei ratti nel gruppo modello è stato significativamente ridotto, suggerendo iperalgesia causata dalla FTCD. A 17 giorni dalla modellazione, la soglia di ritiro meccanico dei ratti nel gruppo modello è rimasta a ...

Questo protocollo stabilisce un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti e misurando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici.

Sviluppo e valutazione di un modello di ratto di difetti della cartilagine a tutto spessore

Cartilage defects of the knee joint caused by trauma are a common sports joint injury in the clinic, and these defects result in joint pain, impaired ...

Ciò che questo protocollo non solo imita l'insorgenza e lo sviluppo di FTCD clinici, ma fornisce anche un modello animale affidabile per valutare i trattamenti terapeutici contro FTCD. Ma questa tecnica è facile da eseguire e consente l'osservazione della crescita immediatamente dopo l'infortunio. Questa tecnica può imitare con successo i difetti clinici della cartilagine fornendo una piattaforma per lo studio del processo patologico dei difetti della cartilagine e lo sviluppo di farmaci terapeutici corrispondenti.Questo metodo potrebbe essere applicato per studiare i difetti traumatici della cartilagine, vale a dire l'artrosi post-traumatica. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta è importante flettere la tibia e il perone con un angolo di 90 gradi per esporre completamente la cocleare del condilo femorale e mantenere la punta del trapano perpendicolare alla superficie della cartilagine. Inizia posizionando un ratto anestetizzato sul tavolo operatorio in posizione supina.Posizionare un drappo sterile sul ratto, esponendo l'articolazione del ginocchio rasata e disinfettata. Utilizzando una lama di bisturi numero 11 fare un'incisione verticale di un centimetro nel mezzo dell'articolazione del ginocchio. E tagliare la capsula articolare e il tendine del quadricipite femorale lungo il bordo della rotula mediale.Quindi, ruotare la rotula verso l'esterno e flettere la tibia e il perone con un angolo di 90 gradi, Per esporre il condilo femorale. Utilizzando una punta circolare da 1,6 millimetri, creare un difetto della cartilagine profondo 0,1 millimetri nel condilo femorale. Pulire il sito chirurgico con batuffoli di cotone imbevuti di soluzione salina allo 0,9% e sostituire la rotula.Quindi mantenendo il ginocchio in una posizione estesa sutura l'incisione strato per strato utilizzando suture 4-0 non assorbibili. Per misurare la soglia di prelievo meccanico o MWT dei ratti, posizionare l'animale in una singola camera di plastica su una piattaforma di rete metallica. Posizionare la base in rete metallica a 50 centimetri sopra un tavolo.Iniziare la misurazione MWT dopo 30 minuti di adattamento. Quindi, premere il filamento Von Frey perpendicolarmente sulla superficie della fioriera della zampa posteriore del ratto. Quindi piegare il pennello per due secondi evitando la parte più spessa della porzione centrale della zampa.Aumentare gradualmente il peso dello stimolo da 4 grammi, fino a quando non si verifica una risposta positiva come il ritiro della zampa o il leccare. 3 giorni dopo la modellazione dei ratti nel gruppo modello hanno mostrato una riduzione del MWT rispetto al gruppo sham. Suggerire iperalgesia nel gruppo modello.Il MWT del gruppo modello è rimasto basso anche dopo 17 giorni. Indicativo della durata della sensibilità al dolore. La colorazione istopatologica del gruppo sham ha mostrato una chiara superficie articolare e cartilaginea intatta, una distribuzione uniforme dei condrociti e un'alta espressione del collagene di tipo II.Al contrario, il gruppo modello dimostra superfici cartilaginee depresse, perdita di condrociti, aumento dell'espressione della metalloproteinasi della matrice MMP13 e diminuzione dell'espressione del collagene di tipo II. La cosa più importante da ricordare è che la rotula deve essere ridotta prima della sutura.

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