La Rete di Valutazione Preclinica dell'Ictus Modello Multilaboratorio dell'Ictus Tromboembolico con Trombolisi: TE-MCAo

L'ambito della nostra ricerca è sviluppare un modello di ictus tromboembolico con trombolisi controllata per l'uso in rigorosi test terapeutici preclinici multilaboratorio. Il nostro protocollo affronta l'assenza di un modello semplice e riproducibile di ictus tromboembolico che imiti la trombolisi clinica e supporti studi preclinici multicentrici. Per iniziare, smussare un tubo PE-50 smussato tagliando l'estremità ad angolo smussato.

Taglia la punta del punto bissellato usando microforbici. Dopo aver preparato il ratto anestetizzato per l'intervento, si effettua un'incisione verticale sulla parte interna della coscia, lunga circa 1,5-due centimetri lungo la piega naturale dell'intersezione inguinale con la gamba. L'incisione dovrebbe essere ortogonale rispetto al corso anatomico previsto dell'arteria femorale.

Con la dissezione contundente, sezionare con attenzione fino ai vasi femorali. Poi separi l'arteria femorale dalla vena e dal nervo che corrono nello stesso fascio. Scheletizzare l'arteria femorale il più prossimamente possibile, tracciando l'arteria fino alla sua origine retroperitoneale.

Posiziona in modo svolto un anello di seta 5-0 intorno all'arteria femorale e usa le code per fornire una delicata tensione all'estremità prossimale dell'arteria. Poi occluse distalmente l'arteria femorale con una legatura di seta 5-0 e si usano le code della sutura per fornire una leggera tensione distale con pinze emostatiche. A circa due terzi della distanza dal punto di sutura prossimale, si posiziona un pezzo di punto di seta sotto l'arteria e si realizza una piccola arteriotomia distale rispetto al punto sciolto usando microforbici.

Usando pinze affilate, solleva l'apertura superiore dell'arteriotomia e inserisci il catetere PE-50 smussato e smussato nell'apertura. Avanza il catetere prossimalmente il più possibile, in modo che l'anello allentato, una volta stretto, avvolga il catetere. Stringi delicatamente la sutura, assicurandoti che non occluse il catetere o si appoggi sulla smussatura.

Rilascia la morsa in gomma. Il catetere dovrebbe riempirsi immediatamente di sangue. Riempi tre tubi centrifughe da 1,5 millilitri e conservali a quattro gradi Celsius.

Una volta riempite le tute, rimuovere il catetere PE-50 dall'arteria femorale, legare l'estremità prossimale e chiudere l'incisione con suture 5-0 Prolene interrotte. Per preparare il trombo, trasferire 500 microlitri di sangue del donatore appena prelevato o conservato in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere un millilitro di cloruro di calcio per l'inversione dell'anticoagulazione. Poi aspira immediatamente il sangue dal tubo della microcentrifuga in un tubo PE-50 da 100 centimetri, usando una dolce aspirazione, e incuba il tubo a spirale in PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius per due ore in un forno da tavolo.

Dopo aver espulso il trombo in una piastra di Petri contenente PBS, tagliarlo in sezioni di circa sei centimetri usando una lametta. Aspirare delicatamente ogni trombo in un catetere PE-50 ed espellirlo completamente cinque volte per lavarlo. Lava nuovamente il trombo tirandolo delicatamente in un catetere PE-10 ed espellendolo completamente 15 volte.

Aggiungi 200 microlitri di blu al 4% in una piastra di Petri contenente 10 millilitri di PBS per creare la diluizione numero 1. Poi pipetta 400 microlitri di diluizione numero 1 in una piastra di Petri separata contenente 20 millilitri di PBS per creare la diluizione numero 2. Inserisci il coagulo nella soluzione più concentrata della piastra di Petri blu di Evans per un secondo, poi trasferiscilo nella piastra di Petri blu diluita di Evans.

Carica un trombo lavato in microcateteri prefabbricati senza emboli d'aria, utilizzando il metodo wet-to-wet. Una volta che il trombo è completamente carico, si estrude abbastanza trombo in modo che esattamente cinque centimetri rimangano nel microcatetere. Taglia l'eccesso con una lametta.

Segna il microcatetere a 16 millimetri dalla punta per delimitare l'estensione del catetere che deve essere avanzato intraluminalmente. I tromboemboli precaricati sono stati iniettati nell'arteria carotide interna di 135 soggetti in sei laboratori di ricerca per testare la fattibilità del modello di occlusione tromboembolica dell'arteria cerebrale media. L'imaging a risonanza magnetica è stato eseguito dopo tre giorni su 102 animali, indicando un tasso di completamento della scansione del 75%.

La perdita animale prima dell'imaging è stata coerente in tutti e sei i laboratori. Il volume medio delle lesioni in tutti i siti era del 13% dell'emisfero ipsilaterale, con una certa variazione tra i sei laboratori. Il nostro protocollo imita il trombosi e il trombolisi umani, riduce l'uso degli animali, standardizza la chirurgia e raggiunge una riproducibilità multicentrica affidabile.

Come risultato significativo della nostra ricerca, abbiamo creato un modello TE-MCAo riproducibile scalabile che è utilizzabile in più laboratori con risultati coerenti e un controllo di qualità strutturato. Questo modello può essere utilizzato costantemente sia in studi di ictus singoli che multilaboratori, migliorando lo screening terapeutico e accelerando la traduzione dei trattamenti cerebrali candidati.