Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

手順の概要
細胞死を測定するための典型的な51Cr放出アッセイには、次の手順が含まれます。
<ol><li>まず、標的細胞にNa2[51Cr]O4で標識される。これは、アッセイ中のエフェクター細胞と区別する。</li>
	<li>標的細胞が標識している間に、エフェクター細胞が集められ、シリアル希釈技術を用いて、エフェクター細胞の減少滴定が丸底96ウェルアッセイプレートに生成される。</li>
	<li>標的細胞標識の終わりに、細胞が最初に洗浄され、次に一連のエフェクター細胞希釈を既に含むアッセイプレートに一定数の細胞が追加されます。</li>
	<li>次に、標的エフェクター細胞ミックスを一定期間インキュベートし、標的細胞との十分な細胞相互作用を可能にし、細胞リシスを媒介する。</li>
	<li>最後に、培養上清を採取し、チューブに集化する。51Cr量は、ガンマカウンタを用いて定量される。</li>
	<li>最後に、データが収集され、ターゲット細胞の「パーセンテージ特定細胞リシス」を計算するために使用されます。</li>
</ol>1. 51Crでターゲットセルを標識する
<ol><li>開始するには、標的細胞を、(ここでヒト黒色腫細胞株WM793)を、単一細胞懸濁液に調製する。</li>
	<li>これを行うには、まず組織培養フラスコから培中を取り除きます。</li>
	<li>次いで、1X PBSの5mLで細胞を洗浄する。</li>
	<li>プレートに1mLのトリプシンを2分間添加して細胞をトリプシン化する。</li>
	<li>フラスコを軽くタップして、フラスコ表面からセルを緩めます。</li>
	<li>フラスコに 5 mL の RPMI メディアを追加し、メディアを上下にピプテしてセルを取り外します。</li>
	<li>セル懸濁液を15mLの円錐管に集め、1200rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離します。上清をデカント。</li>
	<li>ペレットに10mLのメディアを追加し、メディアを上下に優しくピプテリングして細胞を懸濁液に入します。</li>
	<li>血球計を用いて細胞濃度を決定する。</li>
	<li>1x106セルを新しい15 mL円錐管に移します。</li>
	<li>1200 rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離し、上清をデカントする。</li>
	<li>簡単に残された媒体の小容量で細胞ペレットを再中断するためにチューブを渦。</li>
	<li>51 Crの100μCiをWM793ターゲット細胞懸濁液に直接追加します。 注:特定の放射能に専用のラボスペースを設置する必要があります。さらに、すべてのステップの間に51Crの安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護および51Crが付いているサンプルが保管されている場所を示す適切な看板がある必要があります。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも必要です。
</li>
	<li>チューブに小さな放射性テープを追加して、チューブが放射性であることを示します。</li>
	<li>リードシールドを使用してチューブを37°Cのインキュベーターに入れ、1時間インキュベートして15~20分ごとにチューブをフリックし、クロムの標的細胞取り込み量を増やします。</li>
	<li>インキュベーション期間の後、5mLのFBSで標的細胞を洗浄し、余分な51Crを除去する。</li>
	<li>1200rpmで細胞を5分間遠心分離し、放射性FBSを適切な廃棄物容器に洗浄します。</li>
	<li>ペレットを再度中断し、FBSでもう一度洗います。ガイガーカウンターを使用して、組み込まれた放射能のペレットを確認してください。</li>
	<li>ペレットを10mL完全培地で再ステージングし、105セル/mLの細胞濃度を達成した。 注:51Cr標識後の細胞計数ステップは、安全上の理由からここで大きく省略されている。WM793細胞濃度は、51Cr標識以前と同じであると仮定することができる。
</li>
</ol>2. エフェクターセルの準備
<ol><li>様々なエフェクター細胞を用いることができるのは、ヒトまたはマウスT細胞およびNK細胞などである。この例では、PBMCは、標準密度勾配遠心分離(5x106の濃度)によって全血から単離され、使用された。</li>
	<li>まず、96ウェルの丸底プレートの行の1つのウェル(ここでは行A、表1を参照)に100 μLの組織培養培地を追加します。ここでは、エフェクター細胞は追加されなく、標的細胞からの「最小/自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」として機能します。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> 表1:51Cr放出アッセイレイアウト:行A-標的細胞(104細胞/100μL)を媒体のみでインキュベートした(「最小/自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」を生成する)。異なるエフェクタを含む行B から C ウェル:ターゲット セル (E:T) 比(50:1 ~ 1.5:1) 。行H-標的細胞(104細胞/100μL)を1%NP-40でインキュベート(NP-40は標的細胞をlyss)し、「最大または合計51Cr放出」を生成する。すべてのE:T比は、すべての実験条件に対して三重で試験される。列1-3-非刺激 PBMC およびカラム4-6- CpG 刺激 PBMC。
<ol start="3"><li>次に、PBMCの2Xシリアル細胞希釈(各実験条件に対して三重に)を生成し、5x10 5〜15,625細胞/100μLの培ブレン(ここではB~G行)のエフェクター細胞濃度を得る。 注:この例では、開始エフェクタ:ターゲットセル(E:T)比は50:1です。ただし、この比率は実験の詳細に応じて調整できます。
</li>
	<li>これらのウェルにエフェクターセルを追加しないことで、最後の行を空のままにしておきます(ここでは行H)。(この行は、「合計カウント/分、または (c. p. m)」または「最大51Cr リリース」を生成するために使用されます。</li>
	<li>ターゲットセルを追加する準備ができるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。</li>
</ol>3. アッセイに51Cr標識WM793ターゲットセルを追加する
<ol><li>インキュベーション期間の後、インキュベーターから標的細胞を除去し、5mLのFBSで洗浄し、余分な51Crを除去する。</li>
	<li>指定された遠心分離機を使用して、1200 rpmで5分間細胞を遠心分離する。</li>
	<li>FBS洗浄(放射性上清)を適切な廃棄物容器に取り出します。</li>
	<li>FBSの新鮮な5 mLでペレットを再中断することによって洗浄工程を繰り返します。</li>
	<li>細胞を1200 rpmで5分間遠心分離します。</li>
	<li>最後に、ペレットを10mLの完全培地で再中断する。</li>
	<li>51CrラベルWM793細胞懸濁液(105セル/mL)を使い捨て試薬貯蔵所に注ぎます。</li>
	<li>次いで、これらの標識標的細胞の100μLを、96ウェルエフェクター細胞板の各ウェルに、マルチチャネルピペットを用いて加える。</li>
	<li>次に、エフェクター細胞を欠いている井戸の列に1%NP-40(水中)の100 μLを加えます(ここでは行H)。1% NP-40は標的細胞をlyseし、したがって、これらのウェルは、「合計カウント/分、または(c.p.m)」または最大51Cr放出を決定するためのコントロールとして機能します。</li>
	<li>プレートの両側にガス透過性テープの小片を追加してプレートに蓋を固定し、51Crが含まれていることを示すために蓋に放射性テープの一部を置きます。</li>
	<li>簡単に言えば、1200 rpmでプレートを遠心分離します。実験プレートが 1 つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス プレートを追加します。 注:放射性サンプルを取り扱うには、遠心分離機を使用することが重要です。
</li>
	<li>遠心分離機からプレートを取り出します。</li>
	<li>プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、プレートの上に小さな鉛シールドを施し、安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞リシスを可能にする。 注:インキュベーション期間は、使用されるエフェクター細胞および使用される殺戮の潜在的なメカニズムに応じて4〜18時間に変化しうる。
</li>
</ol>4. 上清の収穫
<ol><li>インキュベーション期間の終わりには、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。</li>
	<li>次に、収穫フレームをプレート上に置き、綿栓ごとに小さなフィルターディスクが設置されていることを確認します。これにより、無細胞の上清のコレクションが保証されます。</li>
	<li>今、ゆっくりと穏やかに井戸に綿のプラグを押します。</li>
	<li>約10秒後、綿栓の圧力を解放し、綿のプラグをチューブストリップに移します。</li>
	<li>これらのチューブをそれぞれ二次 FACS チューブに入れます。</li>
	<li>最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、各条件で放出される51Crの量を定量するためにサンプルを実行します。サンプルは通常1分間測定され、「カウント/分」を容易に決定することができます。</li>
	<li>慎重に、チューブがカウンターにロードされた順序を記録します。</li>
</ol>5. データ分析
<ol><li>ここでは、最初の3列に非刺激PBMCを追加し、CpG刺激型PBMC(CpG ODN、24時間(1μg/mL))をカラム4-6に添加した。表 2 を参照してください。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>私</td>
			<td colspan="2">A1,A2,A3の平均</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>自発的な午後</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">平均 B1,B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td colspan="2">C1,C2,C3の平均</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td colspan="2">D1,D2,D3の平均</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td colspan="2">E1,E2,E3の平均</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">F1,F2,F3の平均</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">G1,G2,G3の平均</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td colspan="2">H1,H2,H3の平均</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>最大 c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>アンスティム PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-スティム PBMC</td>
			<td>E:T比</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 51Cr リリースアッセイ データ:'1 分あたりのカウント' / 'c. p. m' データ値、平均 c. p. m 値、および計算されたパーセント特定の lysis 値。
<ol start="2"><li>収集されたデータ(1分あたりのカウント、すなわちc.p.m)は、サンプルが元のプレートにレイアウトされたのと同じ方法でスプレッドシートのセルに入力されました。</li>
	<li>まず、三位一体の平均を算出した。表2-細胞I3〜P3、非刺激PBMCおよび細胞I6~P6について、CpG刺激PBMCについて。</li>
	<li>平均が決定されると、各条件に対する特定のリシスの割合は、以下の式を使用して計算された。 <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>特定のリシスの割合は、各条件について計算した(表2 -細胞J4からO4、未刺激PBMCおよびJ7からO7、非刺激PBMCについて)。</li>
</ol>

ここで説明するアッセイは、様々なエフェクターおよび標的細胞が求められる質問に応じて使用することができるので、かなりの柔軟性を有する。例えば、エフェクター細胞特異性は、異なる標的細胞またはエフェクター細胞殺傷のメカニズムを使用して決定することができ、特定のタンパク質に欠乏した細胞を使用するか、またはタンパク質特異的阻害剤を使用して決定することができる。51Cr放出アッセイの大きな問題は、標的細胞による高い自発的放出率の可能性である。単独で培養した場合(エフェクター細胞を含まない)、標的細胞による51Crの自発的放出は、理想的には、標的細胞による全放出(「最大」)の30%以下であるべきである。より高い自発的放出率は、不健康な標的細胞を使用すること、健康状態の悪さ(例えば、細胞株の拡張培養)または過度に長い標識期間に起因する可能性がある。

細胞死に対するアッセイ:細胞毒性能のクロム放出アッセイ

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

ソース: フランシス V. シャアスタッド1,2, ホイットニー・スワンソン2,3,トーマス・S・グリフィス1,2,3,4 1ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455 2ミネソタ大学免疫学センター,ミネアポリス,MN 55455 3ミネソタ大学泌尿器科,ミネアポリス,MN 55455 4ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455
免疫系の細胞の主な機能の一つは、ウイルスに感染しているか、腫瘍細胞に変換を受けた標的細胞を除去することです。免疫細胞の細胞傷害性を測定するためのインビトロアッセイは、長年にわたり実験室で定番となっています。これらのアッセイは、T細胞、NK細胞、または抗原特異的または非特異的な方法で標的細胞を殺す他の免疫細胞の能力を決定するために使用されている。死のリガンド(例えば、ファスリガンドまたはTRAIL)、サイトカイン(例えば、IFNgまたはTNF)、または細胞傷害性顆粒(すなわち、フェクター細胞によって発現されるペロフィン/グランザイムB)は、標的細胞死を誘発することができるいくつかの方法である。近年の腫瘍免疫療法研究の爆発的な増加に伴い、患者の転帰を改善するために免疫細胞の細胞傷害活性を高める薬剤を見つけることに関心が高まっています。逆に、一部の疾患は、免疫細胞細胞傷害活性の過度の活性によって顕著であり、その結果、これらの応答を緩和する薬剤を同定する努力をもたらす。したがって、ユーザーが任意の数の異なるエフェクター細胞、標的細胞、および/または応答修飾子を実験設計に容易に統合できるアッセイを有することは、エフェクター細胞および/の細胞傷害性を迅速に評価する貴重な手段として役立つことができる。またはターゲット セルの応答性。
これらのインビトロアッセイは、異なる細胞集団の混合を含むだけでなく、エフェクターおよび標的細胞の両方の比較的少ない数を使用する。したがって、アッセイの必要性の1つは、標的細胞を容易に検出および定量することができる方法で標識し、ユーザがエフェクター細胞によって媒介される「比的なリシスのパーセント」を決定できるようにすることである。放射能-特に、Na2 51 CrO4の形態のクロム51(51Cr)は、標的細胞内の細胞タンパク質を迅速かつ非特異的に標識する安価な方法である(1)。短い標識および総アッセイ時間は、標的細胞の数および/または表現型の有意な変化の可能性を減少させ、アッセイの結果に影響を与える可能性がある。エフェクター細胞の細胞傷害活性の結果として標的細胞の膜完全性が失われた場合、標的細胞内の51Cr標識細胞タンパク質が培養上清に放出され、定量。インビトロでの免疫細胞の機能を調べるアッセイと同様に、実験の性能向上を考慮すべき重要な考慮事項が数多くあります。最も重要な特徴の1つは、健康なエフェクター(最大細胞傷害活性のために)および標的(最大応答性および最小限の自発的死/51Cr放出)細胞を使用することである。エフェクターと標的細胞接触が必要である(細胞接触を促進するために丸底96ウェルプレートの一般的な使用につながる)(2)。最後に、データ分析は、正および負の制御ターゲット細胞集団を含めることに依存します。
以下のプロトコルは、Europiumを用いて非放射性バージョンが最近開発されたが、エフェクター細胞の集団の細胞傷害性を測定するための標準的な51Cr放出アッセイを行うための手順を概説する。51名Crは強力なγ放射エミッタです。したがって、このアッセイの使用には、適切な放射線安全訓練、専用の実験室スペース、ガンマカウンター、および放射性サンプルの処分が必要です。
このアッセイにおけるイベントの一般的なシーケンスは次のとおりです: 1) 51Cr ラベル付きターゲットを準備します。2)エフェクターセルを準備し、ターゲット細胞が標識している間にプレートに追加します。3)プレートにラベル付きターゲットを追加します。4)インキュベートプレート;5)上清を収穫;6)カウンターでサンプルを実行した後にデータを分析します。サンプルは一般的に三つ編みで調製され、微妙なピペッティングの違いを考慮して平均化されます。
適切なPPEは、このアッセイのために重要です。具体的には、ユーザーはラボコートと手袋を着用する必要があります。研究室や施設に基づき、安全メガネが必要となる場合があります。すべてのステップの間に安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護があるべきである。最後に、51Crを使用するための専用のラボスペースと機器が確保され、51Crのサンプルがどこに保管されているかを示す適切なサイネージと、可能な限りスペースを調査するためのガンマプローブを装備したガイガーカウンターが必要です。汚染。
本研究室では、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)、(CpG刺激対非刺激)が黒色腫細胞を殺す能力を決定し、ヒト黒色腫細胞株WM793をモデル化し、クロム放出アッセイを用いて行う。

この例では、CpGで刺激されたエフェクター細胞(図1、黒い円)は、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が増加するにつれて、より効果的に標的細胞を殺した。この増加は、非刺激型PBMC(白色円)では観察されず、標的細胞リシスの観察増加にCpG刺激が必要であることを示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505fig1.jpg"> 図1:51Crアッセイ散散散図:ヒトPBMCによる腫瘍活性、非刺激(白い円)およびCpG(黒い円)による刺激後、異なるエフェクターで試験:標的細胞比(E:T)比(範囲から範囲.50:1 から 1.5:1)。

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

このビデオでは、クロム放出アッセイの実施方法と、エフェクター細胞の細胞傷害性の可能性を決定する方法を観察します。免疫細胞は、がんやウイルス感染細胞などの潜在的に有害な細胞を体内から特定し、除去する役割を担っており、これは免疫反応の不可欠な部分です。T細胞やNK細胞など、いくつかの免疫細胞は、標的細胞を特定し、それらの標的細胞のタンパク質分解、溶解、および死を誘導するタンパク質を分泌する能力である細胞傷害電位として知られる特性を持っています。細胞傷害性の可能性を定量化することは、免疫細胞の活性化と効力を測定するために重要であり、この目的のためにクロム放出アッセイが一般的に使用されています。この方法により、特定の種類の免疫細胞がさまざまな条件下で誘発する細胞毒性を比較できるため、がん免疫療法や免疫関連疾患の研究に有用です。まず、がん細胞と同様に、標的細胞を放射性同位元素であるクロム51とインキュベートし、これを細胞に取り込む。次に、これらの放射性標識細胞を、エフェクター細胞とも呼ばれる目的の単離免疫細胞と丸底の96ウェルプレートで共培養し、2つの細胞タイプ間の相互作用を促進します。アッセイの全体的なセットアップには、特定の数の標的細胞を異なる濃度の免疫細胞でインキュベートし、適切なコントロールとともにインキュベートすることが含まれます。共培養により、エフェクター細胞は標的細胞内でアポトーシスおよび溶解を誘導し、その結果、細胞内クロム51が上清に放出されます。次に、事前に最適化された時点で、放出されたクロムを含む上清がすべてのウェルから回収されます。51価クロムは放射性であるため、自然に放射性崩壊を起こしてガンマ線を放出します。アッセイプレート内のすべてのウェルからの上清中のガンマ線レベルは、標的細胞の溶解の定量化可能な出力を表しています。これはガンマカウンターを使用して測定され、免疫細胞の細胞傷害性を決定するために使用されます。まず、標的細胞、この例ではヒト黒色腫細胞株WM793を、単一細胞懸濁液に調製する。これを行うには、まず組織培養フラスコから培地を取り出し、5ミリリットルの1X PBSで細胞を洗浄します。PBSをデカントし、1ミリリットルのトリプシンをプレートに約2分間加えます。フラスコを軽くたたいてフラスコ表面の細胞をほぐし、5ミリリットルのRPMI培地をフラスコに加えます。培地を上下にピペットで動かして細胞を採取し、この懸濁液を15ミリリットルの円錐管に加えます。チューブを遠心分離機に1200RPMで5分間置きます。次に、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、チューブから培地を取り出します。チューブの底を静かにフリックして細胞ペレットを乱し、チューブに10ミリリットルの培地を追加します。次に、培地をゆっくりと上下にピペットで動かし、細胞を懸濁液にします。次に、血球計算盤を使用して細胞濃度を決定し、元の細胞懸濁液の2ミリリットルを新しい15ミリリットルのコニカルチューブに移します。チューブを遠心分離機に入れ、細胞を1200RPMで5分間ペレット化します。遠心分離後、余分な培地をチューブから廃棄物容器に注ぎます。チューブを短時間ボルテックスして、細胞ペレットを残された少量の培地に再懸濁します。次に、この特定の放射能専用のラボスペースに移動して、Chromium 51を使用する準備をします。すべてのステップでChromium 51を安全に保管および使用するために十分な鉛シールドが必要であり、Chromium 51のサンプルが保管されている場所を示す適切な標識が必要です。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも、汚染の可能性に備えてスペースで機能させるために必要です。放射能を適切に使用するための設定が完了したら、100マイクロキュリーのChromium 51を直接標的細胞懸濁液に加えます。次に、サンプルとチューブが放射性になったことを示すために、チューブに放射性テープの小片を追加します。チューブを鉛シールド付きの摂氏37度のインキュベーターに入れ、15〜20分ごとにチューブをフリックしながら1時間インキュベートします。標的細胞が標識している間に、エフェクター細胞の単一細胞懸濁液を調製します。この例では、ヒト末梢血単核細胞(PDMC)を、標準密度勾配遠心分離法により全血から5×10〜6分の1の濃度に単離した。このエフェクター細胞懸濁液を使い捨て試薬リザーバーに移し、次いでこの懸濁液の200マイクロリットルを96ウェル丸底プレートの列Bの各ウェルに加える。次に、プレートのC列からGの各ウェルに100マイクロリットルのRPMIを加えます。次に、最初に列Bのウェル内の細胞を100マイクロリットル除去し、これを列Cに追加することにより、さまざまなエフェクター細胞番号を持つPBMCの段階希釈の実行を開始します。次いで、100マイクロリットルの細胞をC列からD列に移すことにより、エフェクター細胞をさらに希釈し、連続希釈を続けます。行Gに達したら、ウェルから100マイクロリットルを移動して、その列の各ウェルに100マイクロリットルの最終容量を残します。次に、100 マイクロリットルの組織培養培地を列 A のウェルに追加して、この列にエフェクター細胞を追加すべきではないため、ターゲット細胞からの Chromium 51 の自発的な放出のコントロールとして機能します。次に、標的細胞を追加する準備ができるまで、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。インキュベーション期間後、インキュベーターから標的細胞を取り出し、5ミリリットルのFBSで洗浄して、余分なクロム51を取り除きます。次に、チューブを指定された遠心分離機に入れ、1200rpmで5分間回転させます。放射性FBS洗浄液を適切な廃棄物容器に移し、ペレットを新しい5ミリリットルのFBSに再懸濁して洗浄ステップを繰り返します。チューブを指定された遠心分離機に入れ、細胞を再び1200rpmで5分間回転させます。2回目の洗浄を取り外し、ガイガーカウンターを使用してペレットに放射性能が取り込まれていないか確認します。最後に、ペレットを10ミリリットルの完全培地に再懸濁し、Chromium 51で標識された標的細胞懸濁液を使い捨て試薬リザーバーに注ぎます。次に、これらの標識標的細胞を100マイクロリットルを96ウェルエフェクター細胞プレートの各ウェルに加えます。次に、100マイクロリットルの1%NP-40をH列のウェルに加え、各列のすべての標的細胞を溶解します。これらのウェルは、1 分あたりの総カウント (cpm) を決定するためのコントロールとして使用されます。プレートが準備されたので、プレートの両側に小さなテープを追加して蓋を固定し、蓋に放射性テープを貼ってクロム51が含まれていることを示します。次に、放射性サンプルを処理するようにマークされた遠心分離機にプレートを置きます。実験プレートを1枚だけ使用する場合は、遠心分離機にバランスプレートを追加します。遠心分離機を1200rpmに設定し、プレートを速度を上げます。速度を上げたら、マシンを停止します。プレートを遠心分離機から取り外します。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに置き、プレートに小さな鉛のシールドを施して安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞を溶解させます。インキュベーション期間の終わりに、プレートの端の周りのテープを慎重にはがし、蓋を外します。次に、収穫フレームをプレートに置き、各綿プラグに小さなフィルターディスクが所定の位置にあることを確認します。次に、綿のプラグをゆっくりとそっとウェルに押し込みます。約10秒後、コットンプラグの圧力を緩め、コットンプラグをチューブストリップに移します。これらのチューブをそれぞれセカンダリーFACSチューブに入れます。最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、サンプルを分析して、各条件で放出されるクロム51の量を定量します。チューブがカウンターにロードされた順序を注意深く記録します。ここでは、刺激されていないPBMCが最初の3レーンに追加され、CPG刺激PMBCがレーン4から6に追加されました。この例では、サンプルが元のプレートにレイアウトされたのと同じ方法で、1分あたりのカウントがスプレッドシートのセルに入力され、トリプリケートの平均が計算されました。たとえば、最初の条件では、セル A1、A2、および A3 がセル I3 で平均化されました。平均が決定されると、この式を使用して、各条件の特定の溶解の割合を計算できます。例えば、エフェクタ細胞と標的細胞の比率が50対1の非刺激細胞の特異的溶解率を計算するために、自発的CPM(この例では1164.67)を実験CPM(1129)から差し引いた。67. 次に、この数値を最大CPMと自発CPMの差で除算し、100を掛けてパーセント特異的溶解を求めることができる。これは、条件ごとに計算されます。次に、これらのデータをグラフ化して、EとTの比率と、非刺激PBMCとCPG刺激PBMCの両方の特異的溶解率との比較を示すことができます。この例では、CPGで刺激されたエフェクタ細胞は、エフェクタ細胞と標的細胞の比率が増加するにつれて、より効果的に標的細胞を殺傷した。この増加は、刺激を受けていないPBMCでは観察されず、標的細胞溶解の観察された増加にはCPG刺激が必要であることを示しています。

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chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

このコレクションは、免疫細胞のラベリングとソーティングを含む免疫学研究室での主要な技術をカバーしています。また、免疫細胞と抗体の増殖方法、およびELISAを含む免疫活性の一般的な分析法についても説明します。最後に、免疫組織と細胞試料の染色とイメージングについてもデモ表示します。

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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