遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの</em

サマリー

遺伝的誘導フェイトマッピング（GIFM）マークと細かい空間的、時間的な制御を持つトラックの細胞 in vivoでと、特定の遺伝系統の細胞が開発し、成体組織に貢献する方法解明。ここに示さ落射蛍光と植分析のために運命マップE12.5マウス胚に必要なテクニックがあります。

要約

運命のマップは、前駆細胞が開発し、成体の組織に固有の構造と細胞型に寄与する方法を決定するために生体内で細胞をマーキングして追跡することによって生成されます。このコンセプトの進歩は、 私は遺伝系統に基づいて、運命のマップを作成するには、Fは、遺伝子発現、細胞の運命、およびin vivoでの細胞の挙動を結ぶ、M apping（GIFM）を食べたnducible G eneticです。

Xは、修正されたバクテリオファージのタンパク質、Creリコンビナーゼ（ クリアー^T）の空間的な発現を付与する遺伝子調節エレメントの遺伝子またはセットです。 クリアー^Tはクリアー^Tをレンダリングされた電子 strogen R eceptorのリガンド結合ドメインを含むGIFMエクスプロイトX -クリアーライン薬のタモキシフェンの存在下で細胞質に隔離。 loxP部位によって挟まれたDNA配列の間の核と仲介の再結合に移行しタモキシフェンリリースクリアー^T、の結合。 GIFMでは、組換えは一般的にGFPなどのレポーター遺伝子の前にカセットを停止両側にloxP部位の間で発生します。

マウスは、地域、または細胞型特異的クリアーと条件レポーターの対立遺伝子のいずれかを含むように飼育されています。レポーターの停止カセットは、レポーター遺伝子のさらなる転写を防止するため未処理マウスは、マーキングしていないだろう。我々は、レポーターからストップカセットを取り外す核にクリアー^Tリリースの時間的制御とその後の転座を提供するタイムアウト妊娠女性への強制経口投与でタモキシフェンを投与する。再結合に続いて、レポーターの対立遺伝子は構成的であるとheritably表明した。この一連のイベントは、彼らの遺伝的履歴が消えないように記録されるようにセルをマークします。組換えレポーターは、このように最初にクリアーの^Tを駆動するために使用される遺伝子発現から切り離され、一度で、高忠実度遺伝子系統のトレーサーとしての役割を果たします。

我々は、成体細胞型や組織への遺伝的系統の正常な発達と把握するの貢献を研究するためにマウスでGIFMを適用します。我々はまた、より良い人間の遺伝疾患の顕著な特徴を模倣する複雑な表現型を理解するために変異体の遺伝的背景のセルに従うことをGIFM使用。

実験的な手法を通じて、このビデオの記事では、ガイドの研究者をうまくGIFMを適用する。日胚でタモキシフェンを投与することによって、MGFPマウス（E）8.5落射蛍光実体顕微鏡で12.5日で解剖し、分析に続いて強制経口投与を介して、私たちは、よく特徴付けWnt1 -クリアー^{Tを用いる}方法を示しています。我々はまた、外植片の準備またはFACS分析のために運命マッピングされたドメインをマイクロ細かく分析し、全体のマウント蛍光イメージングのために成人の運命マップの脳を解剖する方法を示します。総称し、これらの手順は、研究者は、発生生物学と疾患モデルの重要な質問に対処することができます。

プロトコル

タモキシフェンの準備と強制経口投与手順（E8.5）

• 予め温めておいたコーン油にタモキシフェンを溶解することによりタモキシフェンの20 mg / mlのストック溶液を調製。
• 37ソリューションをインキュベート° C nutatorと断続的にボルテックスで2時間。
• 4の光、店舗° Cからタモキシフェン株式を保護し、一ヶ月までに使用。
• と遺伝子特異的クリアー^T対立遺伝子とレポーターの対立遺伝子の両方を運ぶ男性の、運命のマッピングの実験のために、スイスウェブスター女性（タコニックから購入した野生型）で構成される繁殖のペアを確立する。 MGFP男性（Ellisor 2009）、デモンストレーションの目的のために、我々はWnt1 -クリアー^Tを使用^しています。
• 膣栓の外観のために毎朝スイスウェブスターの女性を確認してください。膣栓が0.5日後に性交と見られている日の朝（0900）を指定し、この出発点に基づいて、タモキシフェン投与の日付を計算する。 （この実験では、胎生8.5が使用されていた）。
• タモキシフェンのストック溶液（4 mgのタモキシフェン）の200μlを描画するために動物給餌針（20G X 1-1/2）1 mlシリンジを使用してください。
• しっかりと首の首筋をつかんで、時間妊娠スイスウェブスターの女性を抑制し、後頭部を固定し、腹側が上を向いているように裏返しますする。
• 直線でボディを保つために無料の指の間に尾を保持する。
• 口の端に送り針を置き、ゆっくりと口の屋根に沿って針を導く。
• それは首をまっすぐに戻すと同時に傾斜ヘッドながら、ボディと平行になるように針を回転させる。
• 胃に向かって、食道の下方に針を導く。気管を入力しないように注意してください。針の抵抗、動物の咽頭反射が作動、またはマウスが闘争場合がある場合は、直ちに針を削除し、再度強制経口投与をしてみてください。
• 送り針が胃になると、胃にタモキシフェンを投与し、解剖の日まで彼女の家のケージにメスを返します。

開頭術：

• Intracardially 4％PFAで成人の運命マッピングされたマウスを灌流し、ちょうど肩の上に脊柱を介してカットしてハサミで頭部を削除します。
• 頭皮を切ってとスカルを公開するために、頭（尾に尾側）の背側正中線に沿ってメスを実行します。
• メスを使用して、頭蓋骨の側面と後部に沿ってから余分な組織や筋肉を削り取る。
• 鉗子、穿刺だけで嗅球への吻側と細かいハサミの先端に対応するために小さな穴を作成正中線で頭蓋骨を持つ。
• この穴に素晴らしいはさみを挿入し、嗅球の外側約長さの切開を内側にします。このカットは、鼻の骨や前頭骨の交差点で頭蓋骨を切断し、はさみのための良好なアクセスを提供します。
• 基盤となる組織の損傷を防ぐために、離れて脳からの角度、はさみのヒントをように注意しながら頭蓋骨の矢状縫合（背側正中線）に沿ってカット。
• ゆっくりと鉗子と皮離れて脳を露出させる内側の切開に沿って骨と頭蓋骨を把握する。頭蓋骨が小さな部分で、オフチップ以上のセクションに離れて壊れる可能性があります。前頭葉、頭頂葉、頭頂間、および後頭の骨のすべてを削除するには、鉗子を使用し続ける。
• 両側に球状の骨をつまんでparaflocculiを（小脳のレベルでの脳の側縁に沿って位置）包む骨をクラック。ゆっくりと骨を引き離します。
• 上下逆さまに頭を回して（下に背側）と脳神経を切断し、頭蓋骨から脳を解放するために鉗子を使用する。

全体のマウント顕微鏡：大人の脳

• GFPは、蛍光解剖スコープを使用してマーキングするために成人の脳を評価する。
• PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に脳を転送する。

全体のマウント顕微鏡：E12.5胚

• 蛍光解剖スコープを使用してGFPマーキングのための全体のマウントの胚を評価する。
• PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に全部マウントして正のGFPであるものを転送します。
• 各胚から尾の小片をオフに挟まないように鉗子を使用して、組織全体のマウント解析から見たときの結果を確認するために、両方の対立遺伝子のPCR（Ellisor 2009）を使用してPCRチューブおよび遺伝子型の各ピースを置きます。

顕微解剖およびE12.5胚から腹側中脳の外植片の準備

• 子宮チェーンとIDから解剖以下ホールマウント蛍光、細胞培養皿の氷冷滅菌PBSに転送胚によって運命にマップされた胚のentification。
• 細かいハサミを使用して、rhombomere 1〜尾横切断胚の頭部の部分を、削除してください。
• 次に、間脳を介して冠状カットで頭の吻側部を削除してください。これは、背側と腹側の組織の間の導管中脳胞の形態を通じて第四脳室にチューブ状の構造を公開します。
• 慎重に、"オープンブック"の準備を作成し、完全にチューブを開いて、吻側に尾側、背側正中線に沿ってはさみ第四脳室へのヒント、およびスニップを挿入します。中脳の二つ背側半分が横方向に配置される間、腹側中脳は、現在、内側に公開されます。
• もっときっぱりとレイアウトする組織のためのために、腹側中脳の下に残りのすべての非神経組織を削除します。なる必要がある場合は、外植片の背側"翼"だけでなく、平らになりますように吻側および尾側の面にノッチを作る。外植片は、今、"背側中脳の翼を表している蝶、、とrhombomere 1尾のようになります。
• さらにFACS解析や細胞培養実験の腹側中脳を単離するために、組織の外側（背側面）を取り外します。

代表的な結果：

このGIFM実験では、Wnt1発現細胞は永久にとheritably E8.5にWnt1 - CreERTでタモキシフェンを投与することにより、胚発生中にマークされています。MGFPの胚。その後、これらの顕著な細胞はWnt1由来細胞は、開発全体の神経構造に貢献する方法を決定するために全体のマウントの蛍光とセクション免疫組織化学を介して可視化しています。全体のマウント蛍光はMGFPレポーターの膜結合型GFPのコンポーネントに依存し、従って細胞の情報だけでなく、Wnt1由来神経突起の包括的なビューを提供します。主に中脳、後脳後部と脊髄でのE12.5展示GFPの蛍光でE8.5、Wnt1 - CreERTmGFP胚（図1A）でのタモキシフェン投与で、例えば。高倍率で、微細な神経細胞の突起は、中脳、体壁、四肢、および頭蓋顔面領域の神経支配見られている。この発達段階では、胚が透明で、内部のGFP標識は容易とに識別です。しかし、脳の発達として、成熟した組織の密度は、内部の脳の構造から発生するGFPの蛍光をあいまいにしています。したがって、E8.5でのタモキシフェン投与で、わずかなGFP標識は、全体のマウント蛍光（図1C、はめ込み）による成人の上丘で観察される。また、一部の軸索突起（図示せず）後脳の腹側表面に沿って走ること見られている。これとは対照的に、タモキシフェンがE9.5で投与されている場合、実質的なGFP標識は、全体の下丘（図1B、挿入図）を通じて行われます。全体のマウントの蛍光の増加は、E9.5でWnt1発現細胞は背側中脳の表面的な地域に、より大きく寄与するまたはE8.5からWnt1発現細胞よりも、この領域内に複数のプロセスを拡張することを示している可能性があります。関係なく、全体のマウントでこの違いは、蛍光は開発中のWnt1発現の動的な性質を反映しており、GIFMが成熟した大人に胚から別個の細胞集団を追跡するために使うことができる方法を示しています。

Wnt1 - CreERTから免疫組織化学、運命マッピングされた組織切片で、MGFPの動物は、細胞レベルで分析される。 GFP、β-ガラクトシダーゼ（β- gal）に対する抗体は、神経構造と細胞タイプへWnt1系統の微細細胞の寄与を決定するために組織特異的バイオマーカーの様々な組み合わせで使用されています。 E12.5においてE8.5でのタモキシフェン投与と組織の分析で、二重陽性細胞（GFP +とβ- galを+は）腹側中脳（図1B）を介して走ることの突起を持つ中脳と後脳全体に観察される。成人の脳で、E8.5でマークWnt1系統は腹側被蓋野のドーパミン作動性細胞集団の近くでだけでなく、優れたと下丘を含む多くの脳の構造を生じさせると黒質（図1D）（参照してくださいまたゼルバス2004）。対照的に、E9.5でマークWnt1 -系統は、ドーパミン作動性細胞集団（図1F）の近傍のニューロンにだけでなく、下丘を生じさせる。

図1 Wnt1 -運命のマッピングのための代表的な結果。：

MGFP胚及びE8.5（AD）で（マーク）マップされた成人の脳の運命、ホールマウントとWnt1 - CreERTにおける免疫細胞化学結果の例とE9.5（EF）。 A. Wntシグナル1 -クリアー、主に中脳でのE12.5展示GFPの蛍光でMGFP胚（MB）、後方後脳（ヘモグロビン）と脊髄（Sp）を。 B.マーク細胞が可視化し、この1 -μmの厚さの光学部（40倍目標、Zシリーズの買収）に示すように、免疫組織化学により細胞レベルで分析した。 （nβ- gal）のβ-ガラクトシダーゼ核抗体標識（赤）とGFPの抗体標識（緑）は腹側中脳に示すように運命にマップされた細胞を示す。ここでは、組換え細胞がため、条件付きMGFPレポーターの性質の（nβ- GAL + / GFP +）ダブルポジティブです。 C.ホールマウント蛍光顕微鏡では大人の上丘（SC）（挿入図）でのかすかなGFPの蛍光を明らかにする。低倍率（5倍）顕微鏡で大人のセクションでE8.5でマークWnt1系統の評価は、Wnt1の系統が（IC）（SC）スーペリア、下丘（C）を含む中脳の構造を生じさせることがわかります。 D.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 E.は、容易に全体のマウント蛍光（挿入図）で中脳の下丘で観察される実質的なGFPの標識E9.5の結果でマーキング。低倍率（5倍）顕微鏡（E）で見られるような大人のセクション（β- galの+、赤）にE9.5でマークWnt1の系統は、下丘（背後部中脳）に集中している。 F.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 Wnt1の系統は腹側中脳への貢献に持続する間E8.5対E9.5でマークWnt1由来のニューロンが徐々に、背側中脳への貢献を制限されます。

ディスカッション

我々が証明したというGIFMシステムは、細胞プロセスのさまざまな問題の広い範囲に答えるために使用することができます。例えば、異なるCreをドライバで改変マウスは、任意の細胞型、組織または興味の遺伝系統を対象とするために使用することができます。タモキシフェンは、任意の胚または出生後の時点で投与することができるので、さらに、組換えは、関連する発達段階をターゲットとすることができます。このシステムの空間的および時間的な制御は、特定の遺伝子を発現する細胞は、興味だけでなく、開発中の細胞の遊走およびパターニングイベントの構造や地域に貢献する方法を調査するのに最適です。

単に免疫組織化学（図1）によって細胞をマーキングし、可視化に加えて、GIFMの方法論は様々なアプリケーションに使用することができます。条件的ノックアウト対立遺伝子とGIFMを組み合わせることにより、遺伝の機能喪失は、時間的および空間的に同時にレポーターの対立遺伝子でマークされている関連する細胞集団、をターゲットとすることができます。また、運命にマップされた動物から採取した組織は、物理的に別個の集団にレポーター遺伝子または特定の...