ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

Summary

脳腫瘍開始細胞（BTICs）、幹細胞特性を有する異種腫瘍内の希少な細胞の同定は、ヒトの脳の腫瘍の病因に新たな洞察を提供しています。我々はBTICsを濃縮するために、特定の培養条件を改良しており、我々は日常的に、さらに、これらの集団を豊かにするためにフローサイトメトリーを使用しています。単一細胞RT-PCR法による自己再生アッセイおよび転写産物の解析が続いてこれらの単離された細胞で行うことができます。

Abstract

脳腫瘍は、通常、神経系マーカーの多様な表現形態学的に多様な細胞で構成されています。幹細胞の特性を備えた腫瘍内の細胞の唯一の比較的小さな部分と呼ばれる脳の腫瘍開始細胞（BTICs）は、複数の系統に沿って分化、自己複製、及びin vivoで腫瘍を開始する能力を持っています。私たちは、もともと人間の脳の腫瘍の様に通常の神経幹細胞（NSC）のために使用され、この培養方法は、具体的に幹細胞様集団を選択することがわかった培養条件を適用しています。無血清培地（NSC）は未分化幹細胞状態の維持を可能にし、bFGFおよびEGFの添加は、マルチ強力な増殖を可能にする、自己再生、拡張可能tumorspheres。

さらに各腫瘍のBTIC人口を特徴付けるために、我々は、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーを評価します。我々はまた、より具体的なcharacterizため興味のある集団を並べ替えることもできation。自己再生アッセイは、96ウェルプレートにソート単一BTICs上で実行されます。tumorspheresの形成は37℃インキュベーションに続いて℃で幹細胞または前駆細胞の存在を示しています。特定の集団の複数のセル番号は、自己再生能力を分析するために、希釈分析を制限するための異なるウェルに並べ替えることができます。我々はまた、単一細胞RT-PCR法を使用して、特定の細胞集団内で異なる遺伝子発現を調べることができます。

次のプロトコルはBTIC集団、ならびにtumorspheresの解離のために豊かにするために、プライマリヒト試料の解離および培養のための私達の手順について説明します。また、フローサイトメトリー分析やソート、自己複製アッセイ、および単一細胞RT-PCRのために染色するためのプロトコルも含まれています。

Introduction

脳腫瘍は、ヒトでは知られている最も積極的かつ異種の癌の一つです。彼らの早期発見と診断が現代のニューロイメージング技術によって促進されてきたが、我々はまだ、特にびまん性、侵襲性のもの、あるいは脳の奥深くに位置するもののために、多くの脳腫瘍の治癒を目指した治療法を欠いている。

脳腫瘍は、彼らの非常に積極的かつ頻繁に不治の性質に起因する小児におけるがん死亡の主要な原因を表す。神経膠芽腫（GBM）の、大人の中で最も一般的な原発性脳腫瘍は、その一様に致命的な予後¹の恐れ、最も積極的なヒトの癌の一つです。この高度悪性星細胞腫（WHOグレード4）は、通常成人の大脳半球に発生し、また、幼い子供や乳児に発生する可能性があります。その成長は、迅速かつ浸潤であり、診断病理学的特徴は、核多形性、微小血管の増殖、壊死^2,3が含まれ^ています。 adul用新たに診断されたGBMのtsは、生存期間の中央値はほとんどすべての治療法に一般的に貧しい応答で、12ヶ月の¹を超えて拡張しません。私たちは、体性幹細胞とがん細胞が共有する多くの機能と遺伝的類似性があることに留意し、正常な脳の発達を調節する分子経路はしばしば癌で異常調節されていること。脳腫瘍の研究に幹細胞生物学のパラダイムを適用することで、我々は将来に向かってin vitroで⁴とで増殖、自己再生および分化の幹細....

Protocol

1。脳腫瘍組織の文化

1. 37℃の水浴中に15 mlの人工CSF（ACSF- 表1参照）と場所に200μlの解凍リベラーゼ（ロシュ·ダイアグノスティックス）を追加します。リベラーゼTMは、一次組織サンプルと同様に、培養tumorspheresを解離させるために使用されるタンパク質分解酵素の混合物である。トリプシン-EDTAとは異なり、リベラーゼ法は表面抗原CD133を保持します。約0.5cm ³の組織サンプルのために、私たちはリベの200μlを使用しています。組織が小さい場合には、我々は100 ulを使用しています。
2. 室温に塩化アンモニウム溶液（幹細胞技術）を持参。塩化アンモニウム溶液は優しく、他の細胞への影響を最小限に抑えながら赤血球を溶解する。これは、固定液を含んでいません。
3. 無菌の生物学的安全キャビネットでは、オフピペットその後、組織を洗浄する検体容器、渦巻きにACSF 5mlを加える。このステップでは、赤血球（RBC）を除去するのに役立ちます。
4. 無菌100mmペトリdiと脳腫瘍組織を転送SH。
5. 細かいハサミやメスや鉗子を使用して、スラリーの整合性に組織を分解。
6. リベで予め温めACSFを含むチューブに10ミリリットルの正規ピペットまたは鉗子および転送の断片を使用してサンプルを収集します。
7. インキュベーターシェーカー上に置いてください（30 rpm....

Discussion

白血病²¹内の作業に基づいて、がん幹細胞仮説^10、乳癌^11、脳腫瘍^4,5、腫瘍内の細胞の唯一の比較的小さな部分と呼ばれるがん幹細胞は、広範囲に増殖する能力と自己を持っていることを示唆している - 新たにする。腫瘍細胞のほとんどは、彼らは、腫瘍の表現型の署名になる細胞に分化するように増殖し、自己複製する能力を失う。腫瘍を維持することができる脳腫瘍細胞集団でキーを見つけることは、脳の腫瘍形成のメカニズムへの洞察を与えるだろうと私たちが起源の細胞にまでさかのぼることができます。

幹細胞は、機能の多系統分化^{22から24を}示す自己再生細胞として定義されています。原発性脳腫瘍の組織は、以前tumorspheresとして神経幹細胞を分離するために設立され、幹細胞の増殖に有利な培養条件下で栽培されている ^{25。神経幹細胞培地（NSC）は未分化幹細胞状態の維持を可能にし、bFGFおよびEGFの添加は、マルチ強力な、6,26を自己複製と拡張可能な幹細胞の増.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号
午前1時01 DMEM：F12	インビトロジェン	11320-082
N2サプリメント	インビトロジェン	17502-048
1M HEPES	Wisent	330から050-EL
グルコース	インビトロジェン	15023-021
N-アセチルシステイン	シグマアルドリッチ	A9165-25G
神経生存因子-1（NSF-1）	ロンザClonetics社	CC-4323
上皮成長因子（EGF）	シグマアルドリッチ	E9644
塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）	インビトロジェン	PHG0261
白血病阻害因子（LIF）	ミリポア	LIF1010
真菌性抗生物質/	Wisent	450から115-EL
リベラーゼTM	ロッシュ	05 401 119 001
塩化アンモニウム溶液	電池技術を食い止める	07850