方法論記事

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

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DOI：

10.3791/4218

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2012年8月14日

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1Raymond and Beverly Sackler Foundation, 2The Cancer Institute of New Jersey, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, 3School of Natural Sciences, Institute for Advanced Study, Princeton, New Jersey

この記事について

サマリー

我々は、神経内分泌癌細胞株を用いた3次元多細胞スフェロイドを成長させるシンプルなアガロースオーバーレイプラットフォームを提示します。このメソッドは、神経内分泌腫瘍細胞に治療薬の効果を調べるために非常に便利な方法を提供します。それはまた、私たちはがん治療のための人間の神経内分泌腫瘍のスフェロイドを確立するのに役立つ可能性があります。

要約

神経内分泌腫瘍では、（ネット）は年間100、000、個人ごとに2つの発生率と、まれな腫瘍であり、彼らはすべてのヒト悪性腫瘍の0.5％を占めています。1は、限局性疾患を呈する少数の患者の手術以外にも、あります全身療法のほとんど、またはまったく延命効果。したがって、優れたネットの生物学を理解し、特に切除不能または転移性神経内分泌腫瘍の患者さんのための新しい治療標的を定義するための優れた必要がある。 3D細胞培養は、 インビボで腫瘍組織の組織と微小環境でのモデリングで、その妥当性に起因する薬物のスクリーニングのための一般的な方法となっています。2,3次元多細胞スフェロイドが直接2Dから進んでよりタイムリーかつ安価な方法で貴重な情報を提供することができます動物（マウス）モデルへの細胞培養実験を行った。

NETパットのための新しい治療薬の発見を容易にするためにients、我々はヒトNET細胞株を用いたin vitroの3D多回転楕円体モデルで開発してきました。 NET細胞は非接着性アガロースでコーティングされた24ウェルプレートに播種し、播種後16から24時間のために非常にゆっくりと攪拌しながら、生理的条件下（5％CO 2、37℃）下でインキュベートされています。細胞は、第3または4日目に始まる多細胞スフェロイドを形成しています。スフェロイドは、薬物治療が開始される時点で、6日目 、することで、より球状になります。 NETスフェロイドに対する薬物治療の有効性は、位相差光学顕微鏡によるスフェロイドの形態、形状、サイズに基づいて監視されています。スフェロイドのサイズが自動的にアクティブな輪郭アルゴリズムに基づいてカスタム開発されたMATLABプログラムを用いて推定されています。さらに、我々は標準組織学的および免疫組織化学的手法を使用することができ、これらの3D回転楕円体上のHistoGel埋め込みを処理する簡単な方法を示しています。

プロトコル

1。 1％アガロースでコーティングされた24ウェルプレートの準備

  1. アガロースを滅菌するために250〜500ミリリットルボトル、オートクレーブで100ミリリットルの脱イオン水に1グラムアガロース（RPI、A20090-500）を追加します（121°C、15 PSI、オートクレーブマシンで15分）。 70°Cの水浴中に滅菌アガロースでボトルを転送します。アガロースは、それが約1時間かかり70°Cに冷却しているときに注ぎする準備ができました。すべての回でアガロース無菌を維持することを確認してください。
  2. 24ウェル平底プレート（Falcon、353047）を取得し、プレートを位相差顕微鏡下で撮像することができれば、24ウェル平底プレートのあらゆる種類の動作します。
  3. バイオセーフティキャビネット、それがうまく均等にカバーするようにするだけでなく周りに渦をアガロースでエッペンドルフリピーターピペットで各ウェルにアガロース200μlを分注します。アガロース200μlのは、スフェロイドは、一貫性のある球状の形状を形成することができるように凹面を形成することが適切である。未満で200μlのアガロースではないかもしれよく完全にカバーするが、以上200μlのアガロースが凹面、その上に成長したスフェロイドを形成しないことがあり、球状の形状を形成することはできません。
  4. アガロースでコーティングされた24ウェルプレートは、約10分で使用できるように準備が整いました。 （省略可能）前の播種細胞への培養液でアガロースを平衡化するための培地100μlを添加します。
  5. また、アガロースが完全に固化した後、各ウェルに100μlの増殖培地を追加し、滅菌シールテープ（Nunc社、236366）でプレートをシールします。これらのプレートは、最大1週間までは4℃で保存することができます。

2。単一細胞懸濁液の調製

  1. すべての実験は、バイオセーフティキャビネットに標準的な無菌技術を使用して行われ、指定されない限り、すべての文化は、空気中5％CO 2で37℃の加湿インキュベーター中で栽培されています。
  2. ヒト膵臓NET BON-1細胞を10％ウシ胎児血清（FBS、インビトロジェン社とのDMEM/F12（Invitrogen社、10565）に保持されます100ミリメートルx 20 mmの滅菌組織培養皿で16000から044）培地（コーニング、430167）。
  3. 単BON-1細胞を70〜80％コンフルエントに達したときに、培地を除去しています。細胞はPBSで2回洗浄し、1ミリリットルTrypLE（Invitrogen社、12604）37℃で5分間インキュベーションした℃を追加することによって、皿から外れていTrypLEはトリプシンに似ていますが、15歳で安定しています - 30°Cと同様に4℃すべての細胞がシャーレから剥離されていることを確認するために顕微鏡下で確認してください。
  4. トリプシン処理細胞に9 mlの増殖培地を追加し、さらに単一の細胞懸濁液を確実にするために上下に数回の細胞をピペットピペットを使用しています。
  5. 細胞をフィルタリングするために70μmのセルストレーナー（フィッシャー、22363548）を使用します。
  6. 細胞を収集し、グアバPCA-96ベース·システム（Millipore）を用いて細胞数を実行します。
  7. 10％FBS増殖培地にフェノールフリーDMEM/F12にmlあたり5000細胞の懸濁液を準備します。

3。スフェロイド培養

  1. 単一のオーバーレイを200μlアガロースでコーティングされた24ウェルプレートに細胞懸濁液と蒸発を防ぐために滅菌シールテープで24ウェルプレートをシールします。

注： - 播種する細胞の数は、6日目でのスフェロイドのサイズに基づいて経験的に決定されるべきである。スフェロイドの300から400μmの直径は、薬物治療を開始するための理想的なサイズになり、1,000 BON-1とH727細胞が播種されています。

- 3D細胞の生存率は約10日目（データは準備中原稿、図示しない）でドロップを開始しますので、我々は6日後の薬物治療を開始することはお勧めできません。

  1. 空気中5％CO 2の37℃の加湿インキュベーター中で一晩40未満rpmの非常に低速攪拌でオービタルシェーカー上でBON-1細胞と上記アガロースでコーティングされた24ウェルプレートを配置します。その後の文化が成長を維持するために安定したプラットフォームにこれらのプレートを移動します。
  2. 上記プレートの各ウェルに200μlの増殖培地を追加します。の3日ごと。スフェロイドを邪魔しないでください。井戸の側にピペットチップをタッチしてウェルに培地の流れをダウンさせることで各ウェルの壁を通って培地を追加しようとする。
  3. 顕微鏡下で24ウェルプレートでスフェロイド形成を監視することができます。

4。薬物治療

  1. スフェロイドは、6日目で、直径300から400μm程度に達したときに、3D回転楕円体は、薬で治療されています。これは、薬物治療のために0日目と表記されています。
  2. 6日目で、プレートの各ウェルには培地400μlの周りが含まれています。薬物治療は、各ウェルに1×の最終濃度であることを確認するために、治療の各用量の3倍希釈系列は、十分な8が複製するためには、15 mlのコニカルチューブに5 mlの増殖培地中で薬剤の在庫から作られています。
  3. 24ウェルプレートの各列でのスフェロイドは、車両、用量1、2、3、4、5のように分類されます。 4（参照1つの24ウェルプレートに治療の各用量のために複製されますがあります表1）。我々は通常、少なくとも少なくとも8治療の各用量のreplicateを作る2 24ウェルプレート、の3Dスフェロイドを扱う。
  4. °C、封止テープ上のすべての縮合がうまく入ることを確認するために、4℃で5分間800rpmで24ウェルプレートスピンダウンする。 3D回転楕円体のフローティング機能により、各ウェルの培地は、スフェロイドの妨害を避けるために削除されません。
  5. 慎重に各ウェルの壁に沿って適切なウェルに各用量の上記のメイド治療の200μlを加える。
  6. シーリングテープで24ウェルプレートを密封し、空気中5％CO 2を37℃の加湿インキュベーター内で培養をインキュベートします。
  7. 必要に応じて、72から96時間後の治療法のそれぞれの用量で各ウェルでスフェロイドを撤退。

5。 3Dスフェロイド培養を監視する

  1. tの各ウェルにおける薬物治療の後に、選択した各時間点（0、24、48、72時間）で、スフェロイド彼を24ウェルプレートは、5倍対物レンズを用いてツァイスAxiovert 200/M-based位相差顕微鏡で撮像されています。

注：画像はμmとピクセルの間にキャリブレーションスケーリングを持つ任意の光学顕微鏡で撮影することができます。スフェロイドが迅速に10倍を目的とイメージング分野を脱却するために5倍の目標は理想的です。

  1. 回転楕円体分析は、生の画像とツァイスAxioVisionの4.8.2ソフトウェアを使用して手動で実行することができます。
  2. また、カスタム開発されたMATLABプログラムは自動的に/半自動的に回転楕円体のサイズを見積もるために使用されます。自動プログラムが正確に与えられた画像中の楕円の輪郭を見つけると自動的に（L）メジャーとマイナー（W）軸を測定するための動的輪郭アルゴリズム4を実装しています。同じアルゴリズムの半自動バージョンでは、ユーザーは強力なアーティファクトが存在するときにプログラムを開始する手助けすることができます。すべての画像からTIFFまたはJPEGファイル形式としてエクスポートする必要がありますプログラムによって読み取られるRAW画像。回転楕円体の体積は0.5×長さ×幅2と推定されています。

6。 NET 3DスフェロイドのHistoGelエンベディング

  1. 10月24日スフェロイドは、2時間10％ホルマリンで固定し、PBSで2回洗浄し、24ウェルプレートから採取した50％で洗浄し、15分間70％エタノール二回、それぞれ、HistoGelを埋め込むための準備ができました。また、彼らは数ヶ月間、4℃で70％エタノール中で保存することができます。
  2. 冷たいHistoGel（サーモフィッシャーサイエンティフィック、HG-4000-012）のチューブが水で満たされたビーカーに入れられます。ビーカーを1分間電子レンジで加熱したり、ゲルが完全に液化されるまで、すべての回で同じ水で満たされたビーカー内に保持されます。
  3. 上から70％エタノールでスフェロイドは、爪楊枝を使って生検cryomold（ティッシュテック、サクラファインテック、4565）に転送されます。すべてのスフェロイドが転送されていることを確認します。スフェロイドは、バイオの底に沈むように分放置PSYはcryomold。キムワイプで生cryomoldの液体を取り除くため、その間、非常に穏やかに使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを用いて生検cryomoldの下部中央にスフェロイドをプッシュしよう。このステップでは、解剖顕微鏡下で行われやすいかもしれません。
  4. 温めHistoGelの薄層が生cryomoldの下部に球状体を安定させるために生検cryomoldに追加され、一方、つまようじは非常に穏やかに生cryomoldの下部中央に回転楕円体を維持するために使用されています。生cryomoldの下部に球状体を安定させるためだけに十分なすぎるHistoGelを追加しますが、しないでください。
  5. スフェロイド/ HistoGelは、室温またはHistoGelが固化されるまで1〜2分間放置します。その後、温めHistoGelで生cryomoldの残りの部分を記入してください。
  6. それは約10分間室温で固化することができます。
  7. 直前の生cryomold、LEAからスフェロイド/ HistoGelブロックを飛び出るまで無傷のスフェロイド/ HistoGelブロックを飛び出ることができます1分間、4℃で、それを簡単お好み検索。スフェロイド/ HistoGelブロックはその後バイオラップのピース（Surgipath、01090）に包まれた組織および生検カセット（フィッシャーサイエンティフィック、15から182-701D）に配置されます。組織生検カセットは、70％エタノールでコンテナに格納されます。その後パラフィン包埋組織のためのルーチンの処理手順が遵守されています。5
  8. パラフィンブロックは、3μmの厚い層のスライドに区分することができます。スライドは、組織変更を決定するためにヘマトキシリン​​とエオシンで染色することができ、また、免疫組織化学染色に使用することができます。

7。代表的な結果

ヒト膵神経内分泌腫瘍細胞株BON-1（シェルオーバーグ、ウプサラ大学、スウェーデンVerto研究所に提供されます）、QGP-1（日本ヒューマンサイエンス振興財団、大阪、日本）、ヒト肺神経内分泌腫瘍の細胞株H727（ATCC）があったagaros上に成長させた電子コーティングされた24ウェルプレート。 図1に示すように、3種類の細胞株は、異なる形態を示しています。 BON-1とH727細胞は3次元スフェロイドを形成した。顕微鏡下で、H727細胞はBON-1細胞よりも、より強固でコンパクトな回転楕円体を示した。我々は、H727細胞は細胞間接着の増加能力を持っていると仮定し、結果としてより緊密な接合を形成しています。 QGP-1細胞は、スフェロイドとはみなされない大規模なブドウのような多孔質の塊を、示しています。近年では膵神経内分泌腫瘍研究の金利上昇に起因する、BON-1細胞は、数字の残りのために使用されています。アガロースでコーティングされた24ウェルプレート上でBON-1細胞を播種した後、多細胞スフェロイドの形成は、通常、第3または4日目で発生し、スフェロイドは、6日目で丸くなる。栄養と酸素の制限により、スフェロイドの高密度コアの細胞は10日目の周りに死ぬことを開始し、17日で、スフェロイドが原因な大きさにかそこらで崩壊し始める私の例壊死性コアの放出。スフェロイドは、通常、直径1,000μmまで成長することができます。 図2は、BON-1 3Dスフェロイドの形成、成長、崩壊のセクションを示しています。

スフェロイドは、300から400μmであり、細胞の周りにいたときの薬物治療が開始された高い生存率を（投稿準備中）保持されます。 6日目の3D回転楕円体は、薬物治療の開始点として選ばれました。これは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、NET細胞の増殖およびアポトーシス促進効果を示したことが報告されている。6我々は、（TSA）は、3D NETスフェロイドに対する薬物治療の効果を説明する例として。 図3Aが示すヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンAを選んだTSAの治療の時に3D回転楕円体の形態は、 図3Bは、TSA（シグマ、T8552）治療時に3D回転楕円体の体積を示しています。個々の回転楕円体のサイズは、お客さまによって自動的に推定されたトムが開発したMATLABのコンピュータプログラム。4マニュアルの描画手順が与えられたイメージに近いエッジにしたスフェロイドを取得するために追加されました。少なくとも8回転楕円体は、各時点でTSA治療の投与量当たりで測定した。各3D回転楕円体の体積は0.5×長さ×幅2として算出した。車両の相対図3A及び図3Bに見られるように、図に示すように、TSAのすべての用量は、BON-1 3Dスフェロイドの増殖阻害をある程度実証した。中でも、125 nMおよびTSAの250 nMの濃度が強く、3D回転楕円体の成長を抑制し、96時間の時点で細胞死につながった。

NET 3D回転楕円体の組織を理解するために、H＆Eおよび免疫組織化学（IHC）染色は、17日間培養した3D回転楕円体で行われた。 図4Aは、キーである、HistoGel埋め込 ​​むための3次元回転楕円体を処理する方法を示しています3D spherのパラフィン包埋のためのステップ OIDは、 図4Bは、H＆E染色、切断されたカスパーゼ3の免疫組織化学的染色（アポトーシス細胞のマーカー）、17日間培養した3D回転楕円体上でのKi-67（増殖細胞のマーカー）抗体を示し、 。 3D回転楕円体のコア内の細胞はほとんど壊死/アポトーシスであり、外層細胞が活発に増殖している。

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図1。 NET 3Dスフェロイドの形態。3つのヒト神経内分泌腫瘍細胞株からの3次元回転楕円体はアガロースでコーティングされた24ウェルプレート上に形成されている。千BON-1、H727とQGP-1細胞をアガロースでコーティングされた24ウェルプレートに播種し、プロトコルで説明するように正常な生理的条件で増殖させた。これらは、10日間培養したQGP-1のBON-1とH727または細胞凝集体の3次元回転楕円体のイメージです。

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図2。 BON-1 3Dスフェロイドの増殖の追跡 BON-1 3Dスフェロイドの増殖の追跡：3Dスフェロイドの形成、成長、崩壊。プロトコルに詳述したように、1,000 BON-1細胞をアガロースでコーティングされた24ウェルプレート上に播種されています。細胞は一晩生理的条件でオービタルシェーカー上で10％FBSを標準DMEM/F12培地で栽培され、その後安定した台の上に移動し、同じ条件で栽培。 3D細胞の追跡成長は、めっき後の最初の5時間イメージング細胞毎時間、続いて、その後ツァイスAxiovertを持つすべての1-3日は、5倍の対物レンズを用いて位相差顕微鏡を200/M-basedた。第一塊に集約細胞は、その後多集約し、小スフェロイド、大きなスフェロイドを形成し、最終的にスフェロイドが崩壊する。

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図3。 BON-1のTSA処理3Dスフェロイド（）TSA処理時に3D回転楕円体の画像。治療群：V - 車両（0.0025％DMSO）、D1-用量1（15.​​625 nMのTSA）、D2-用量2（31.25 nMのTSA）、D3：量3（62.5 nMでTSA）、D4：用量4（125 nMのTSA ）D5：用量5（250 nMのTSA）。治療の時間：0 H - 治療法は日に6次元スフェロイド開始した時点、治療開始後24 H、48 H、72 H、96 Hは時間のポイントです。 3Dの回転楕円体は、以前のように各時点で撮像した。 TSA処理時に3D回転楕円体（B）の成長。 （A）で3D回転楕円体の主要な（L）とマイナー（W）軸が治療のたびにポイントが（0、24、48、72および96時間）でMatlabのプログラムによって自動的に推定した。 3D回転楕円体の体積は0.5×長さ×幅2と推定された。グラフ内の回転楕円体の体積は8の平均値は複製され、エラーバーは8複製する上でベースを算出した。

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表1。24ウェルプレート上の薬物治療のレイアウト

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図4A。 HistoGel埋め込 ​​みのための3Dスフェロイドを処理するメソッドのイラスト。HistoGel埋め込 ​​みと3D回転楕円体（）HistoGel埋め込 ​​み次元スフェロイドを処理する方法の概要の免疫組織化学染色のための3D回転楕円体を処理する方法。 3D回転楕円体は、その後HistoGel /スフェロイドブロックはバイオラップ青に包まれ、パラフィン包埋のために黄色の生検カセットに移し、生cryomoldで同じレベルにあるとHistoGelにカプセル化された。

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図4B。 H＆E染色と日-17 3次元スフェロイドの免疫組織化学的染色（B）H＆E染色、免疫組織化学的Ki-67の染色と17日、3D回転楕円体の切断カスパーゼ3。 Paraffinに埋め込まれた切片をスライドには、脱パラフィンしたと抗原の検索は、CCI（セル·コンディショニング·ソリューション、Verana医療システム、＃711-065-152）を用いて行った。ウサギポリクローナルKi-67抗体（Abcam.＃Ab833）と、切断されたカスパーゼ3抗体（セルシグナリングテクノロジー、＃9661）を室温で1時間、それぞれ1:75と1:200の濃度で適用した。抗ウサギ二次抗体（ジャクソンImmunolab、＃711-065-152）は発色検出キットDABMap（ベンタナメディカルシステムズ、＃760から124）、続いて室温で1時間1:500で適用されました。スライドをヘマトキシリン​​で対比し、脱水とキシレンから封入する前にクリアされました。

ディスカッション

我々はアガロースでコーティングされた24ウェルプレートを用いたヒト神経内分泌腫瘍細胞からの3次元多細胞スフェロイドを形成するための、シンプルで信頼性が高く、再現可能な方法を実証した。この手法の成功は、セルの固定の番号から6日目で均質な大きさと均一な形状を持つ単一のスフェロイドを取得する機能があります。重要なステップは、めっき後の最初の16から24時間NETの細胞を用いたプレートのゆっくり攪拌します。また、このメソッドは、一般的なヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト結腸腺癌細胞株HT-29、ヒト非小細胞肺癌細胞株H1299とヒト胚腎臓細胞株HEK-293に適用することができます。彼らはすべての治療薬の画面（データは示さず）のための統一とコンパクトな3Dスフェロイドを形成することができます。いくつかの方法は、3D回転楕円体を生成することが報告されていますが、7月10日方法は、特殊なプレートや試薬を必要としないここで報告し、その結果、シンプルで費用対効果です。私たちの未発表データdemonstrat単層2次元のセルと比較した場合、アガロース上に成長させたNET 3D回転楕円体は、幾何学的および分子生体 NET異種移植腫瘍における模倣した電子。これは、他のヒト癌細胞株で作られた3D回転楕円体について報告されているものと似ています。3D細胞培養モデルの11,12制限は、それが完全に任意の薬剤または治療的処置の in vivoでの有効性のテストで置き換えることができないということですので、 3D回転楕円体は、この面でのin vivoで腫瘍内と異なっている、血管腫瘍のようなものです。それにもかかわらず、このメソッドはいくつかの側面における in vivo、in vitroでからNET治療薬のギャップと評価を埋めるのに役立ちます。

多細胞スフェロイドにおける免疫蛍光染色は、浮動小数点3D回転楕円体と共焦点顕微鏡の限界の大きなサイズとジオメトリーのために実行することは非常に困難である。ここでは、パラフィン包埋のためにHistoGelを処理する方法を示しています3D回転楕円体のシリアル切片スライドの免疫組織化学的染色を可能にして、埋め込む。また、私たちのカスタム開発されたMATLABプログラムは、正確かつ再現性、スフェロイドの大きさを推定する効率的な薬効を監視するのに役立ちますし、NET患者のための薬の開発におけるハイスループットスクリーニングに組み込まれる可能性があります。

開示事項

利害の衝突が宣言されません。

謝辞

私達は誠意をこめて、MATLABのプログラムとニュージャージー病理組織学的機能と顕微鏡施設のがん研究所と彼女の助けを博士Wenjinチェンに感謝します。我々はまた、彼らのコメントと提案についてのレビューに感謝します。本研究では、レイモンドとビバリー·サックラー研究財団によってサポートされています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
名 会社 カタログ番号 コメント
DMEM/F12メディアギブコ 10565-018
TrypLE ギブコ 12604
24ウェルプレートファルコン 353047
70mMのセルストレーナーフィッシャー·サイエンティフィック 22363548
滅菌シールテープヌンク 236366
トリコスタチンA シグマ T8552
オービタルシェーカーフィッシャー·サイエンティフィック 11-402-12

参考文献

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3D HistoGel MATLAB

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