この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
失明は、米国で約340万人に影響を与え、今後数年間で増加すると予想される。最近1、遺伝子治療や幹細胞移植は、網膜変性疾患に起因する失明を治療するための重要な治療手段となっています。そのような虹彩色素上皮細胞移植などの加齢黄斑変性症（AMD）に対する自家移植のいくつかの形態、有望な結果を生成しており、ヒトでの臨床試験は、遺伝子や幹細胞治療の他の形態のために始めている。2これらはRPE65遺伝子の交換を含むレーバー先天性黒内障とスタルガルト病で、ヒト胚性幹（ES）細胞を用いたRPE細胞移植患者における治療3-4現在の遺伝子治療ベクター及び網膜疾患患者の治療に利用できる幹細胞が存在すること、それは確認することが重要である適用する前に、動物モデルにおいて、これらの潜在的な治療法ヒトでの研究でそれらをING。マウスは眼の遺伝子治療用ベクターと幹細胞移植の治療効果をテストするための重要な科学的なモデルとなっている。このビデオの記事では5月8日 、私たちは、網膜下腔への遺伝子治療ベクター又は幹細胞を注入する手法を提示マウス眼周囲組織への損傷を最小限に抑えることができます。
プロトコル
1。網膜下注入用デバイスを組み立てる
- ガラス毛細管の直径100μmの針を購入したりします。これは、サッター、P-97ピペットプラーまたは他の類似の装置を使用して手動で行うことができます。それが所望の直径（100μm程度）に達するまで、キャピラリーチューブの端を加熱し、プルアップされます。直径の小さい針が遺伝子治療ベクターを使用することができますが、これは、細胞または目に損傷を与えることなく、細胞注入のための推奨径である。鋼針に比べ、ガラスキャピラリーニードルは網膜破損を引き起こすことなく、注射液および網膜下腔へのアクセスの可視化を可能にするために、非常に細かいですが、鈍先端を持っています。 70％エタノールを使用して必要に応じてこれらのプルアップ針をクリーニング後、滅菌容器に保管してください。所定の位置に針を保持するためにテープで15センチメートル滅菌組織培養皿は、注射針が覆われており、無菌環境を保つために1つの方法です。この時点で、COMPL手続きが行われる手術室の中にセットアップをETE。それは、この手順はバリア施設内で行われている場合は特に、無菌のままにするために、すべての回で手術室にすべての機器を維持するのが最も簡単です。
- 注射針にシリコーンを吸引除去し、針の内壁に沿ってコーティングを残すためにシリコーンを取り出します。シリコーンコーティングは、特に内側のガラス毛細管壁を突き刺すような針の穴を介して細胞やウイルスの通過を最大化します。
- （チューブから針を取り除く）を....
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結果
マウス眼の描画は硝子体内注射し、網膜下の両方の外科的処置（矢印、 図1）の場所を表示する矢印で、参考のために標識された主要な構造体で示されています。そのようなlacZのレンチウイルスベクター（ 図2）のような遺伝子治療ベクターは、これらの場所を使用して注入することができる。さらに、このようなマウス胚性幹細胞（ 図3）などの幹細胞は、また、マウスの眼のこれらの部 位に移植することができる。
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（1×10 8 TU / mlで、Lentigenコーポレーション、 図2A）により駆動されるlacZレポーター遺伝子を運搬するレンチウイルスベクターの1μlをC57BL/6Jマウスの網膜下腔に注入した。目は鈍的切開によって生後6週で摘出し、1 mg / mlのX-gal溶液（5mMのK 3のFe（CN）6、2mMのM.......
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ディスカッション
このビデオ技術は、正常に網膜下注入外科手術を完了し、遺伝子治療ベクター又は幹細胞を効率的に眼疾患を治療するために必要な場所に配置されていることを確実にする手順について説明します。それはこれらの細胞の周辺に遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織を置くので、この技術は、そのようなRPEまたは光受容体として網膜細胞のターゲティングを可能にします。従来の方法は、流体が硝子体腔内に配置され硝子体内注射を、関与しており、これらの特定の領域を標的とするために、網膜を通って移行する必要があります。硝子体内注射は、すべてのウイルス粒子が正しい場所に移行されますので、ターゲットの光受容体またはRPEという遺伝子治療ベクターの伝達を低減します。さらに、幹細胞は病気のRPEまたは感光体を交換し、ますます人気が高まっており、これらの分化した細胞は、サブ以内に移植しなければなりません網膜の空間。5
これは網膜剥離や周囲の目への損傷の可能性を低減するとともに、治療効果を持たせるために、遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織の正確な位置を保証するため、この手順で重要なステップは、網膜下腔.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
孝行長崎から実験支援;;失明を防ぐための研究本研究は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しています。 KJWはNIH助成5T32EY013933と5T32DK007647-20でサポートされています。 VBMは、NIHの助成金K08EY020530によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 名前 | 会社 | カタログ | 注釈 |
| 0.8から1.10 x 100 mmのキャピラリチューブ（ガラス） | キンブルグラス株式会社 | 34502 99 | |
| /ブラウンマイクロピペットプラー燃える | サター·インストゥルメント | P-97 | ナリシゲマイクロフォージを代わりに使用できます。カタログ＃MF-900 |
| Sigmacote | シグマアルドリッチ | SL2-25ML | シリコーン |
| Dubeccoのリン酸、塩化カルシウム、塩化マグネシウムと緩衝生理食塩水 | GIBCO-Invitrogen社 | 14040-133 | |
| 安全ロク3/4G 25×12 "、血のコレクションセット | BDバキュテイナー | 367298 | |
| 1ミリリットルサブQ 265/8Gスリップチップシリンジ | ベクトン·ディッキンソン | 309597 | |
| 0.5から10μlのフィンピペットIIの可変ボリュームピペッター | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1から200μlのナチュラル面取りヒント | 米国サイエンティフィック株式会社 | 1111-1700 | |
| Discovery.V8ステレオ顕微鏡 | ツァイス | MC1500 | |
| 60ミリメートル×15 mmのスタイル処理されたポリスチレン細胞培養皿 | コーニングインコーポレイティッド | 430166 | |
| Vannasストレートはさみ | シュトルツ眼科 | E3383 S | |
| 繊細な鋸歯を有する湾曲したドレッシング鉗子 | シュトルツ眼科 | E1408 | |
| 15度マイクロサーナイフ | Wils眼科株式会社に | 091204 | |
| ケタミン | Ketaset III | NADA＃45から290 | |
| キシラジン | ロイド研究所 | NADA＃139から236 | |
| ブピバカイン（Marcaine） | アストラゼネカ | N / A | |
| ブプレノルフィン | シグマアルドリッチ | B9275 |
参考文献
- Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
- Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
- Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E.....
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再版と許可
