このプロトコルでは、原核微生物のシングルセル分析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製作、セットアップ、および基本的な操作が紹介されています。工業的に関連性のある微生物を原理の証明として分析し、従来の方法では不可能だった特定の期間の成長率、形態、表現型の不均一性についての洞察を可能にしました。
この記事について
サマリー
要約
このプロトコルでは、最近導入されたマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製造、実験セットアップ、および基本的な操作について詳しく説明します。PLBRは、単一細菌およびマイクロコロニーの分析に利用して、細胞増殖、形態、ストレス応答、単一細胞レベルでの代謝物またはタンパク質産生など、バイオテクノロジーおよび微生物学的に関連する問題を調査することができます。このデバイスは、摂動研究のための一定の環境条件を可能にする連続的な媒体の流れを特長としていますが、さらに、高速な媒体変化や、任意の所望の環境状況を模倣するための振動条件を可能にします。シングルユースデバイスを作製するために、サブマイクロメートルサイズのSU-8構造を含むシリコンウェーハが、迅速なポリジメチルシロキサンキャスティングのための複製型として機能しました。チップを切断、組み立て、接続し、時空間細胞解析の強力なツールであるタイムラプスイメージングに適した高解像度の全自動顕微鏡にセットしました。ここでは、バイオテクノロジープラットフォーム生物であるコリネバクテリウム・グルタミカムをPLBRに播種し、細胞増殖と細胞内蛍光を数時間にわたって追跡し、フローサイトメトリーなどの従来の解析方法では不可能だった単一細胞レベルでの時間依存的な集団不均一性を解明しました。デバイス製造に関する洞察に加えて、さらに、前培養の準備、細菌のローディング、トラップ、および単一細胞とコロニーのPLBR培養が実証されています。これらのデバイスは、厳密な環境制御の下で単一の細菌の時間依存現象を分析するための微生物学的研究に新たな次元を追加します。シンプルで比較的短い製造プロセスにより、この技術はあらゆるマイクロ流体ラボに容易に適応でき、特定のニーズに合わせて簡単に調整できます。
概要
タイムラプス顕微鏡は、生体内の生細胞を研究するための強力なツールです1。一方、熱誘起フォーカスドリフト補正を含む市販の全自動顕微鏡プラットフォームは、がんやニューロン細胞の研究から組織工学、単一酵母または細菌細胞の動的研究に至るまで、時間依存現象を研究するための生物学的研究に一般的に適用されています2-6。
通常、透明なウェルプレート、寒天パッド、または単に顕微鏡スライドを適用して、タイムラプスイメージング中に細胞培養環境を提供します7。これらの単純なシステムは、特定の研究には適していますが、環境条件に対する制御が非常に限られており、より複雑な摂動や明確に定義された高速な媒体変化を許容しません。大量生産によって製造された使い捨てマイクロ流体チップデバイスは、最近市場に導入されましたが、ほとんどがより大きな真核細胞タイプ向けに調整されています4。成長を追跡することは可能ですが、正確な細胞の捕捉、コロニーサイズ、成長方向、細胞除去能力など、明確に定義された成長調査は限られています。細菌細胞を3D環境で培養するマイクロ流体の生息地とリアクターが開発されてきた8-10は、シングルセルレベルでの定量的研究を扱う際に欠点があります。全体的な集団の不均一性を解析することはできますが、増殖は単分子膜に限定されないため、多くの細胞パラメータを単一細胞の分解能で正確に決定することはできません。
この制限は、明確に定義されたチャネルと生息地での細胞の培養を可能にするマイクロシステムの開発を引き起こしました。細胞は単一細胞の分解能で平坦な単層で成長し、特に培地供給と環境条件を厳密に制御します6,11,12。細菌細胞の培養のためのマイクロ流体システムの例は、ほとんど実証されていません12-14.細菌は通常、非常に速い増殖速度を示し、特に顕微鏡検査に細胞単分子膜が必要な場合には、数マイクロメートル以下の範囲のマイクロ流体構造を必要とします。Keymer他微細加工された景観における大腸菌株の成長と広がりを実証しました15,16。彼らは集団動態に興味を持っていたため、シングルセルの分解能では調査しませんでした。
私たちはピコリットルバイオリアクター(PLBR)13を開発しました。これは現在、成長17や単一細胞レベルでの蛍光結合生産性分析などのさまざまなバイオテクノロジーパフォーマンス指標の調査に適用されています18,19。本マイクロ流体デバイスは、約1ピコリットルの所定培養量での環境反応器制御と、連続的な単一細胞観察を同時に可能とする。一方または両側が媒体供給チャネルに対して開いているオープン単層ボックスシステム11,14と比較して、PLBRは制御された捕捉および培養を可能にする。この設計により、隣接する複数のコロニーが1つの大きな集団を形成するリスクなしに、細菌の長期培養が可能になります。さらに、高さ1μm(細胞径順)の培養領域を組み込んで、細菌の増殖を細胞単層に限定しています。対照的に、供給チャネルは10倍深くなり、油圧抵抗を最小限に抑えます。
小型化されたバッチ栽培システム20と比較して、現在のシステムは、連続的な培地の流れにより、一定の環境パラメータでの栽培を可能にします。さらに、媒体の組成、温度、流量、ガス交換などの環境パラメータは、簡単に制御でき、数秒で変更できます。これにより、例えば栄養素の利用可能性やストレス刺激に関する環境変化に対する細胞の応答を特異的に調査することができます。培地の量を減らすこと、すなわち数マイクロリットルの範囲に限ることに対する需要は、研究者が新しい研究、例えば、これらの特定の環境条件下での細胞応答を解明する大規模実験の上清を用いたタイムラプスイメージング中の細胞の摂動など、新しい研究を行うことを可能にしている17。ピコリットルバイオリアクターは、生物物理学的条件を厳密に制御し、高精度シリンジポンプとタイムラプスイメージング用の自動明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡を使用して操作する堅牢なシステムを研究者に提供します。ここでは、デバイスの設計、製造、および例示的なアプリケーションを含む完全なプロトコルを報告します。
プロトコル
1. ウェーハ製造
- CADソフトウェアを使用して、入口、出口、メインチャネル、およびPLBR(図1A)を含むマイクロ流体デバイスを設計します。
- このプロトコル(図2)で提示された設計は、2つのシードインレット、2つの異なる基板を混合するためのグラジエントジェネレータ、1つのアウトレット、およびPLBRの6つのアレイで構成されています。各アレイには5つのPLBRが含まれており、1つのマイクロ流体デバイス内に30の並列PLBRがあります。
- 目的のチップレイアウトを含むリソグラフィーフォトマスクを作成します(図1B)。フォトマスクは、サブミクロンの分解能を持つ電子ビーム描画によって社内で製造されました。使用されたマスクは、5 in2ガラスプレート上のクロム層で構成されていました.
注:クリーンルームクラス100以上の条件下で、次の手順をすべて実行します(プロセスフローチャートを図3Aおよび3Bに示します)。 - 4インチのシリコンウェーハをピラニア(硫酸と過酸化水素の比率10:1)とフッ化水素酸で数分間洗浄します(注意:危険な化学物質)。脱イオン水(DI)で約10秒間すすぎます。
- ウェーハを200°Cで20分間脱水します。
- ウェーハ(1層目)に1μm SU-8 2000.5フォトレジストをスピンコートします(4mlレジスト、スピン10秒、v=500rpm、a=100rpm/sec、スピン30秒、v=1,000rpm、a=300rpm/秒)。
- コーティングされたウェーハを95°Cのホットプレートに置き、余分な溶媒を排出します(65°Cで1.5分、95°Cで1.5分、65°Cで1分、理想的には2つのホットプレートを使用します)。
- 1層目のフォトマスク(ここではピコレータリアクタのトラップ領域)とウェーハをマスクアライナーの内側に挿入し、ウェーハを350〜400nm(真空接触、64 mJ /cm²、t = 3秒、I = 7 mW /cm²)にさらします。
- SU-8の重合を開始するには、95°Cのホットプレートで露光後ベークを実行します(65°Cで1分、95°Cで1分、65°Cで1分)。注:この手順の後、SU-8層の構造を確認できます。
- ウェーハをSU-8現像槽に1分間入れ、ウェーハを新しいSU-8現像液を入れた2番目の容器に数秒間移します。
- ウェーハをイソプロパノールですすぎ、SU-8現像液を除去し、ウェーハスピナーの窒素流を使用してウェーハを乾燥させます。
- ウェーハを150°Cで10分間ハードベークします。
- ウェーハ(2層目)に9 μm SU-8 2010フォトレジストをスピンコートします(4 mlレジストを分注し、v = 500 rpm、a = 100 rpm/秒で10秒間スピン、v = 4,000 rpm、a = 300 rpm/秒で30秒間スピンします)。
- SU-8 を塗布したウェハを 95 °C のホットプレートに置き、余分な溶媒を排出します (65 °C で 15 分、95 °C で 45-60 分、65 °C で 10 分)。注:シワや泡には注意が必要です。ウェーハを95°Cまで高速に加熱すると、蒸発した溶媒が小さな気泡に封入される可能性があります。
- 目的のレイアウトのフォトマスク(ここでは栄養素供給用のメインチャネル)とウェーハをマスクアライナーに挿入し、350〜400 nm(ハードコンタクト、64 mJ /cm²、t = 10秒、I = 7 mW /cm²)に露光 します
- 95°Cのホットプレートで露光後ベークを行い、SU-8の重合を完了させます(65°Cで5分、95°Cで3分30秒、65°Cで3分)。注:この手順の後、SU-8層の構造を確認できます。
- ウェーハをSU-8現像槽に45秒間入れ、ウェーハを新しいSU-8現像液を入れた2つ目の容器に移し、60秒間現像します。
- ウェーハをイソプロパノールで20秒間すすぎ、SU-8現像液の残留物を取り除き、加圧窒素を使用してウェーハを乾燥させます。
- 最後に、ウェーハを150°Cでハードベークします。その結果、最終的なウェーハ(図1C)が得られ、PDMS成形のマスターモールドとして使用されます。
- プロファイラー(表面形状測定機)の測定(図3C)を実行して、SU-8構造の高さを検証します。注:構造の高さが不正確であると、培養中に細胞の非効率的な捕捉や細胞の損失につながる可能性があります。
2. ポリジメチルシロキサンチップの製造
注:以下のすべての手順は、粉塵粒子が製造手順に干渉するのを防ぐために、理想的には層流条件下で実行する必要があります(プロセスフローチャートを図4に示します)。
- ポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースと硬化剤の混合物を10:1の比率で調製します。不透明に見える均質な溶液が得られるまで、慎重に混合します。希望の層の高さ(ここでは3 mm)に必要なだけ準備します。
- PDMS混合物をわずかな真空下で約30分間、すべての気泡が消えるまで脱気します。
- 適切なSU-8ウェーハを装着した成形装置(またはシャーレ)を作製し、PDMS混合物を注ぎます(図1D)。
- PDMSをオーブンで80°Cで3時間焼きます。
- PDMSスラブをウェーハから慎重に剥がします。清潔で鋭利なメスを使用して、スラブを単一のチップに切ります。
- チップをn-ペンタン浴で90分間洗浄し、続いて2回のアセトン洗浄浴(各90分)で洗浄します。チップを一晩乾燥させて、溶剤の残留物を取り除きます。注意:PDMSの洗浄はドラフトの下で行ってください。注:n-ペンタン洗浄中、モノマーとダイマーは硬化したPDMSから除去され、洗浄手順中にチップサイズが一時的に2倍になる場合があります。
- マイクロ流体PDMSチップは、最終実験まで近くの容器に保管してください。
- 実験の直前に、チューブとPDMSチップを接続するために使用されるコネクタよりもわずかに小さい直径のニードル(またはホールパンチャー)を使用して、PDMSチップに入口と出口の穴を開けます。
- マイクロ流体PDMSチップをイソプロパノールで慎重に洗浄し、スコッチテープを使用して、構造化されたPDMS側に付着する可能性のあるほこりの粒子を取り除きます。チップに粒子が見えなくなるまで、スコッチテープを数回使用します。
- 170 μmの薄いスライドガラスをアセトンとイソプロパノールで順次洗浄します。最後に脱イオン水で洗浄し、加圧窒素で乾燥させます。
- プラズマ活性化の前に、プラズマクリーナーを温め、約300秒間プラズマを流してください。
- ボンディングする前に、PDMSとガラスチップを位置合わせします。最後に、PDMSチップをスライドガラスに慎重に置きます(図1E)。PDMSとガラスは数秒で接着します。注:ボンディングプロセス中にピンセットでPDMSチップの上部を押し込まないでください。これは、水路や小さな構造物のいわゆる屋根の崩壊につながる可能性があります。
- 結合を強化するために、最終的なPDMSガラスチップを80°Cで10秒間ベークします。
3. 細菌培養の準備
注:すべての栽培は、栽培中に干渉する可能性のある望ましくない粒子の蓄積を防ぐために、滅菌ろ過された培地で準備する必要があります。
- 目的の生物(ここではC. glutamicum ATCC 13032)を含む寒天プレートを使用し、1つのコロニーを20 mlの新鮮なBHI培地に接種し、ロータリーシェーカー(120 rpm)で30°Cで一晩(≈ 8〜14時間)インキュベー トします。
- 10 μlのプレカルチャーを目的の培地(ここではCGXII21)に移し、マイクロ流体培養中に使用し、ロータリーシェーカー(120 rpm)で細胞を30°Cで一晩成長させます。
- 所望の量の細胞懸濁液(実験の開始に応じて10〜500μl)を、マイクロ流体細胞培養中に使用する目的の培地(ここではCGXII21)に移します。注:最善は、初期の対数期の細胞を播種に使用することです。C. glutamicumの培養では、播種に最適な光学密度(OD600)は0.5〜2でした。
- 1 mLの細菌培養物を滅菌済みの2 mLチューブに移します。注:これは、振とうフラスコとマイクロ流体培養の間の移動時間を最小限に抑えるために、マイクロ流体PDMSチップが組み立てられた直後に行う必要があります。通常、転送時間は約15分であり、酸素制限や温度変化によって引き起こされる代謝への影響を防ぐために、できるだけ短く保つ必要があります。
4. 実験的なセットアップ
注:すべてのステップは倒立顕微鏡で実行されます。
- 実験の2時間前に顕微鏡インキュベーターを起動して、システムをウォームアップします。注:顕微鏡には、温度を制御し、必要に応じてガスの流れを制御するために、フルサイズのインキュベーターを装備する必要があります。チップシステムにはメディアが継続的に注入されるため、追加の湿度制御は必要ありません。
- インキュベーターシステムを開き、目的の対物レンズを選択し、必要に応じて対物レンズに液浸油を加えます。
- チップをチップホルダーの内側に取り付けます。必要に応じて、ステージ操作中に欠けが動かないように、ガラスプレートを粘着テープで固定します。
- サンプルを顕微鏡の中央に置き、PLBRアレイに焦点を合わせます。
- 入口と出口を適切なチューブで接続します(図1F)。チューブを廃棄物リザーバーに接続します。代表的なチップを図4Dに示します。
- シリンジをポンプに挿入し、メディアの流れを開始します。培地、緩衝液、または必要に応じてコーティング液を使用し、マイクロ流体チャネルを約1時間すすぎます注:コーティング液は、非特異的な細胞接着を防ぐためにチャネル壁をコーティングするために使用されます。
- 大腸菌の場合、0.1%のBSA溶液を使用してチャネル壁をコーティングします。C. glutamicum の場合、コーティングは必要ありません。コーティング手順の後、チップを培地で洗い流してから細胞播種します。
- 細胞播種や培養を行う前に、漏れが発生していないこと、温度が一定であることを確認してください。
5. マイクロ流体デバイスへの細菌細胞の播種
- チューブに接続された適切なシリンジで目的の細菌溶液が利用可能であることを確認してください。
- バッファーまたはコーティング溶液を切断し、セル懸濁液をチップに接続します。デスボリューム、望ましくない気泡を最小限に抑え、実験時間を短縮するために、シリンジだけでなく、針全体とチューブを交換してください。
- 細胞懸濁液を200 nl/minの体積流量でチャネルに注入し、ほとんどのPLBRが所望の量の細胞で満たされるまで(図5A)。注:最適な播種結果は、細菌株、OD600、およびプレカルチャーの増殖培地によって異なります。これらのパラメータは、トラップ効率と、十分な数のセルが反応器構造にトラップされるまでの時間を増やすように適合させる必要があります。C. glutamicumの場合、典型的にはOD600 0.5-2の細胞懸濁液が使用された。大腸菌の場合、OD600は0.5〜1でした。
- 充填されるPLBRの数が少ない場合は、流量を800〜1,200 nl/minに増やします。
- 細胞懸濁液を取り外し、増殖培地をチップに接続します(図5B)。媒体交換中に気泡が発生しないようにしてください。新鮮な成長培地で100 nl/minで灌流します。
6. タイムラプスイメージング
- タイムラプスイメージング用の特定のPLBRを選択します。通常、PLBRは、実験の開始時に単一の母細胞を含むものが選択されます。1回の実験で調査できる関心領域の数は、目的のフレームレートと顕微鏡のセットアップによって異なります。
- PLBRの数に応じて適切なフレームレートを選択します。マイクロスコープがタイムラプスインターバルで必要な量のROIを処理できることを確認してください。
- 適切なフィルター セット (ここでは YFP) を選択します。ステージ移動中やタイムラプス測定のたびに自動的にシャッターを閉じ、発色団の漂白を防ぎます。
- タイムラプス顕微鏡シーケンスを設定し、実験を開始します。
- すべてのPLBRが生い茂った後、実験を中止し、マイクロ流体PDMSチップを破棄して、実験を評価できます。
7. 分析
注:次の手順または手順の一部は、手動で実行することも、ImageJなどの画像分析プログラムによって実行することもできます。
- 培養が必要なすべての基準(母細胞の数、母細胞の位置など)を満たす関心のあるPLBRを決定します。
- 1つのマイクロコロニーの増殖速度を決定するには、各時間枠の細胞数をカウントします。
- 時間 vs. ln (セル番号) をプロットして、最大成長率を計算します。プロットの傾きは、[1/時間]単位の成長率を表します(図6を参照)。
- 蛍光データ解析は、実施する実験に大きく依存します。このレポートでは、異なる同質遺伝子マイクロコロニー間のコロニー間および細胞間の不均一性を示すために、例を選択しました(図7を参照)。
結果
デバイスの作製
マイクロ流路PLBRシステムは、高解像度顕微鏡観察に適した薄いガラスチップ上に、PDMSの1層を接合して作製されます。作製工程は主に2つのステップで構成されます。まず、複製用マスターの作製を行い（図1A、1B、 および1C）および、2点目にチップ作製（図1D、1E、 および 1F）。プロトコルに従い、標準的なフォトリソグラフィ微細加工技術を用いてマスターモールドを作成します。クリーンルーム設備のない研究室では、市販のカスタムSU-8マスターモールドを入手することができます。反復的なPDMS成形を用いて（図1A、1B、 および1C数百個の使い捨てチップを製造することが可能です。PDMS成形およびチップの組み立てはあらゆる研究室で実施でき、クリーンルーム施設は必要ありませんが、層流クリーンベンチなどの作業環境が望ましいです。
プロセスは、マイクロ流体チップシステムの設計から始まります。通常、マイクロ流体チップの設計にはCADソフトウェアが使用されます（図1A）。CAD設計後、サブミクロン分解能を持つ電子ビーム描画装置を用いてマスクを作成します（図1B）。本研究では、SU-8ウェハのリソグラフィに使用する5 inのクロムマスクを作成しました。最終的なシリコン-SU-8ウェハをPDMS成形に使用します（図1D）。ベーキング工程の後、PDMSスラブをチップ状に切り出し、ガラススライド上に不可逆的に接合します（図1E）。最後に、チューブを接続します（図1F）。
図2にマイクロ流体システムの詳細な設計を示します。このシステムは、2つの播種入口、異なる基質または培地を混合するための勾配発生器、および1つの出口で構成されています。メインチャネルの寸法は 50 µm x 10 µm (W x H) です。各デバイスは、5つのPLBRを含む6つのPLBRアレイで構成されています。これにより、1つのマイクロ流体デバイス内に30個の並列化されたリアクターが配置されることになります。
図3は、レプリケーションマスターの作製工程を示しています。プロトコルで詳述している通り、SU-8リソグラフィによって第1層のSU-8層を作製します（図3A）。第2層についても同様の手順を適用します（図3B）。チャネルの形状を確認するため、プロフィロメーターを用いてPLBRおよびメインチャネルの高さを測定しました。図3Cに示す例では、第1層（培養層）を測定しています。ここでは、層の高さが1,200 nmで均一であり、BHI培地におけるC. glutamicumの培養に適していることが示されています。
図4は、PDMSの混合（図4A）から始まり、成形工程（図4B）、そして最終的な接合ステップ（図4C）に至るPDMS成形手順を示しています。図4Dは、厚さ170 µmのガラスプレート、入口および出口を備えたPDMSチップ（高さ3 mm）、およびチューブに接続された鋼製針を組み込んだ最終的なマイクロ流体チップを示しています。実験後、チップは廃棄可能であり、広範な洗浄は必要ありません。さらに、組み立てと取り扱いが容易であり、複雑で困難な充填手順も必要ありません。
装置の原理
図5にリアクターシステムの動作原理を示します。細胞をマイクロ流体デバイスに注入すると、個々の細胞が細胞壁の相互作用のみによってPLBR内部にトラップされます。チャネルとPLBRの流体抵抗の差により、PLBR内部では最小限の流れしか発生しません。PLBRへの播種後（図5A）、細菌溶液から増殖培地へ変更することで、増殖および観察フェーズが開始されます（図5B）。PLBRが過成長した後（図5C）、通常は実験を停止し、タイムラプス画像を解析します。PLBR内のトラッピングメカニズムおよび流速プロファイルの詳細については、Grünberger et al.13 を参照してください。
増殖速度解析
本システムは、増殖、形態、または蛍光シグナルなどの異なる生物学的パラメータに関して、さまざまな細菌種の研究に適用できます。最初の例として、工業的に重要な生産生物であるC. glutamicumを標準的な培養条件下（T=30 °C、CGXII培地21）で培養しました。図6Aは、3つのアイソジェニックなマイクロコロニーから得られた増殖曲線を示しています。PLBRが満たされるまで指数関数的な増殖が維持されており、栄養制限が発生していないことがわかります。図6Bは、増殖するC. glutamicumコロニーの4つのDICタイムラプス顕微鏡画像を示しています。
蛍光分析
単一細胞蛍光顕微鏡観察において、研究者はしばしば特定の蛍光タンパク質（例えばGFPやその誘導体）を利用し、目的の特定の表現型を測定可能な出力（蛍光信号）に結びつけます。蛍光ベースのタイムラプス研究におけるPBLRの適用可能性を実証するため、Ptacプロモーターの制御下でプラスミドコード化されたYFP-TetR融合タンパク質を産生するC. glutamicum株（pEKEx2-yfp-tetR）18,22の蛍光放出を調査しました。低濃度の誘導剤（IPTG）存在下では、Ptacからの発現により、同系細菌集団において顕著な細胞間変動が生じることが知られています。1つの前培養から開始し、複数の同系マイクロコロニーについて増殖と単一細胞蛍光を追跡しました。Figure 7に見られるように、異なるマイクロコロニー間での表現型の不均一性と、1つの母細胞から始まったコロニー内での単一細胞レベルでの不均一性が観察されました。あるコロニー（Figure 7B、PLBR 1）では蛍光放出がほとんど見られませんでしたが、PLBR 2の細胞はPtacプロモーターからの基底的なyfp-tetR発現により低い蛍光放出を示しました。PLBR 3では、他のコロニーと比較して蛍光放出がかなり強く、集団の幅広い分布が観察されました。この例は、タイムラプス蛍光顕微鏡研究におけるPBLRの適用可能性を証明しています。単一細胞の蛍光をある一時点でのみ決定できるフローサイトメトリーと比較して、本システムでは細胞の追跡が可能であり、多くの世代にわたって単一細胞の蛍光をリアルタイムで研究することができます。
図 1. PLBRチップ製造プロセスの概要。マスターモールドの作製：（A）設計、 (B) リソグラフィーマスクの作製、 および (C) ウェハー製造から開始。PDMS-ガラスチップの製造：（D）PDMS成形に続き、(E) ガラスとPDMSのボンディング、および (F) 最終的なチップ組み立てを行う。
図2. PLBRチップの設計。 (A) マイクロ流体チップ全体のCAD図面；(B) 選択したレイアウト箇所の拡大図：このレイアウトには、2つの培地入口 (a1)、混合路を備えた勾配発生器 (a2)、および6つの並行PLBRアレイ (b1) が含まれている。b2 は、幅 100 µm の流路に組み込まれた1つのPLBRを示している。PLBRの内径は 40 µm であり、栄養路の幅は 2 µm である。播種入口の長さは 40 µm である。ピンク色は第1層（トラッピングおよび培養領域）を、青色は第2層（流体輸送）を表している。
図 3. 2層ウェハー作製プロセスの概略図。 (A) トラップ構造を含む第1層の作製；(B) 流路、入口および出口を含む第2層の作製；(C) 第1層の代表的な表面プロファイル。この例では、第1層の高さは1,200 nmであり、複合培地でのC. glutamicumの培養に使用される。
図 4. デバイスの作製と代表的なチップ。PDMS成形プロセスの概略図：(A) PDMSの混合および脱泡；(B) PDMSの成形；(C) モールドからの剥離、切断、およびチップの接合。最終的なチップ（Royal Society of Chemistryの許可を得て転載13）：(D) 2つの入口と1つの出口を持つPDMSチップの写真；(E) 5つのPLBRをそれぞれ含む6つの並列アレイのCAD画像；(F) 1つのPLBRのSEM画像。
図 5. PLBRシステムの動作原理。(A) シーディング相、(B) 細菌マイクロコロニーの増殖相、(C) オーバーフロー相。Royal Society of Chemistryの許可を得て転載13。 http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H。
図 6. C. glutamicum WT マイクロコロニーの成長速度の決定。 (A) 3つのPLBR培養の成長プロットと、それから得られた指数曲線（Royal Society of Chemistryの許可を得て転載）13。 http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H。 (B) 成長するC. glutamicum コロニーのタイムラプス画像。
図 7. PBLRに基づく個体群の不均一性解析。 誘導剤IPTG不在下で、Ptacプロモーターの制御下でyfp-tetR融合タンパク質を発現するC. glutamicum（pEKEx2-yfp-tetR）を示す。（A）実験ワークフロー；（B）コロニー間および細胞間の不均一性を示す3つの同系マイクロコロニー；（C）各マイクロコロニー内における単一細胞蛍光の分布。
図 8. 異なるPLBRの走査電子顕微鏡画像。捕捉効率の最適化のための播種入口を示すSEM画像。(A) 大きな播種入口 (B) 小さな播種入口 (C) より大きな「オープン」播種入口 (D) 2つの播種入口。
| ステップ | 問題 | 考えられる原因 | 溶液 |
| ウェハー作製 | ソフトベイク中のSU-8における気泡の混入 | 急速な昇温 | ～で焼成する 95 °C および 65 °C 数回 |
| ウェーハ作製 | 消失および破損したSU-8構造体 | 不適切な作製手順；SU-8構造における機械的ストレス | ベイク時間や露光時間などのパラメータを最適化する |
| ウェハ製造 | SU-8層が薄すぎる、または厚すぎる、あるいは層の厚さが不均一な場合 | スピンコーティング中の問題点 | スピンコーターのパラメータとウェハチャックを確認してください。 |
| チップボンディングおよびアセンブリ | 崩壊するPLBR | PDMSボンディングパラメータが最適ではない | ボンディング後の出力、プラズマ処理時間、およびベーキング時間を調整する。 |
| チップボンディングおよびアセンブリ | PLBR内における汚染構造物および粒子 | チップが適切に洗浄されていなかった | 表面クリーニングのための粘着テープの適用 |
| チップボンディングおよびアセンブリ | 不十分なPDMS-ガラス接合 | ボンディングパラメータの不適切、または洗浄不足 | 酸素プラズマの設定を確認する |
| マイクロ流体実験 | 液漏れ | 入口/出口孔が適切にパンチされていなかった | 穴あけ工程の最適化 |
| マイクロ流体実験 | 充填時の多数の微小PDMS粒子 | 穴が適切に穿孔されなかった | 穴あけ工程の最適化 |
| マイクロ流体実験、生物学的側面 | 細胞増殖なし | 洗浄手順による溶媒残留物 | 細胞をロードする前にチップをより十分にフラッシュするか、またはボンディング前に溶媒を蒸発させてください。 |
| マイクロ流体実験、生物学的側面 | 増殖速度の変更 | さまざまな理由 | 前培養の状態および温度を確認する |
| マイクロ流体実験、生物学的側面 | 培養中の細胞形態の変化 | 栄養制限または温度シフト | インキュベーターと流量を確認する |
| マイクロ流体実験、技術的側面 | タイムラプス顕微鏡観察における位置のドリフト | 温度変動 | 振動がなくなるまで、実験前に温度プロファイルを確認してください。 |
| マイクロ流体実験、技術的側面 | 培養中の細胞の消失 | リアクター上部までわずかに充填 | 反応器高さの最適化 |
| マイクロ流体実験、技術的側面 | トラッピングなし | リアクター高さの不足 | リアクター高さの最適化 |
表1. トラブルシューティングこの表は、実験作業における重要な側面、よくある間違い、および考えられる解決策をまとめたものである。
ディスカッション
細菌の単一細胞分析用の複数の(PLBR)を含むマイクロ流体PDMSデバイスの製造、実験セットアップ、および関連する操作手順について説明しました。
ソフトリソグラフィ技術を使用した微細加工により、さまざまなサイズや細菌の形態に合わせてデバイスの寸法を迅速に調整できます。現在、さまざまな微生物の培養と培養スループットに関して、ピコリットルバイオリアクターを最適化しています。トラップ効率を高めるために、反応器の形状も最適化されています。 図 8 は、現在検証されている 4 つの新しい PLBR デバイスを示しています。すべての図で、播種チャネルは幅と形状に関して再設計されました。実際には、これは閉じ込められる細胞の数に影響を与えるようですが、さらなる調査が必要です。追加のオーバーフローチャネルを組み込むことで、トラップ効率に関する大幅な改善も達成され、リアクターを通る対流が増加し、より多くのセルがトラップされます。ただし、同時に、培養中に細胞が洗い流されるリスクが高まります。
この装置は、単一細胞レベルでの成長と生産プロセスを調査するために何十年にもわたって使用されてきたマクロスケール培養に代わる興味深いものです。ただし、いくつかの重要な要件があります。複数のピコリットルバイオリアクターを並行してモニタリングするには、焦点ドリフト補正を備えた高解像度で完全に電動化された顕微鏡セットアップが必須です。さらに、測定全体を通じて所望の培養温度を一定に保つために、インキュベーションシステムが必要です。
デバイス製造の成功率は95%です。主な問題は、非効率的なPDMSガラス接着、PDMS屋根の崩壊、または流体漏れに関連しています(発生するほとんどの問題のトラブルシューティングについては 、表1 を参照してください)。実験作業は部分的に非無菌条件下で行われますが、流体システムは閉じているため、実験中に汚染が見られることはめったにありません。PDMSマイクロ流体デバイスは光学的に透明であるため、高解像度の in vivo イメージングに使用できます。PDMSは用途に最適と思われますが、疎水性分子に対する親和性が高いため、全細胞生体触媒プロセスで広く使用されている溶媒の使用が制限されています。ただし、プロトコルをこの種のアプリケーションに適応させるための適切なコーティングが利用可能です。
提案されたPLBRは、さまざまな種類の細菌の細胞および細胞内イベントの時空間解析に適しています。現在のアプローチの主な利点は、従来の方法とは対照的に、マイクロコロニーの成長を直接定量化できることにあります。さらに、PLBRは、定義された一定の条件下での培養を可能にします。このシステムは、少量の試薬や材料の使用を容易にするため、安価でカスタマイズ可能で、高スループットに適しているという利点があります。従来の方法では、微生物の培養を分析する際には、母集団全体の平均値が考慮されます。さらに、既存の方法では手動サンプリングが必要であり、サンプルの劣化につながり、測定に誤差が生じる可能性があります。PLBRは、微生物学におけるバイオプロセス開発と集団不均一性解析に新しい視点を提供します。PLBRは、バイオプロセス開発におけるさまざまなアプリケーションにとって有望なツールであり、細胞間の不均一性 の分析、細胞系統内の特定の細胞クラスターの分析、微生物産生株のスクリーニング、細胞表現型のリアルタイム調査など、さまざまな研究分野に適用できます。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、技術者のAgnes Müller-Schröer氏の貴重な貢献に感謝します。この研究の一部は、Forschungszentrum Jülich GmbHのHelmholtz Nanoelectronic Facility(HNF)で行われました。著者は、寛大な支援とサポートに感謝しています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| シリコンウェーハ直径100mm、P / BOR <100 | >Si-MAT, Silicon Materials, ドイツ | ||
| フォトレジスト SU-8 2000.5 | Micro Resist Technology GmbH, ドイツ | ||
| フォトレジスト SU-8 2010 | Micro Resist Technology GmbH, ドイツ | ||
| SU-8 Developer mr DEV- 600 | Micro Resist Technology GmbH, ドイツ | ||
| ポリジメチルシロキサン (PDMS) シルガード 184 シリコーンエラストマーキット | ダウコーニング;Farnell GmbH、ドイツ | ||
| ディスペンシングニードル Precision Tips 27 G;ID = 0.2 mm、OD = 0.42 mm | Nordson EFD Deutschland、ドイツ | ||
| ガラスプレート D263 T eco、30 mm x 25 mm x 0.17 mm | Schott AG、ドイツ | ||
| ホールパンチャー AKA 5130-B-90 | ハリス ユニコア | ||
| チューブ タイゴン S-54-HL、ID = 0.25 mm、OD = 0.76 mm | サンゴバン;VWR International GmbH、ドイツ | ||
| 使い捨て注射器–Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | 552-183143 | |
| Syringes, 1 ml sterile glass syringes | INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Germany | ||
| Chemicals | |||
| (NH4)2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Urea | Carl Roth GmbH + Co. Co.KG、ドイツ | ||
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG、ドイツ | ||
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG、ドイツ | ||
| MgSO4•7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ | ||
| MOPS | Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ | ||
| FeSO4•7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ | ||
| MnSO4•H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ | ||
| ZnSO4•7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ | ||
| CuSO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ | ||
| NiCl2•6H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG (ドイツ | ||
| CaCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG ドイツ | ||
| Biotin | Carl Roth GmbH + Co. KG ドイツ | ||
| カテク酸 | Carl Roth GmbH + Co. KG | ||
| BHI | ベクトン、ディキンソン | ||
| Cells | |||
| Corynebacterium glutamicum ATTC 13032 | DSMZ;ライプニッツ研究所DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
| Escherichia coli MG 1655 | DSMZ;ライプニッツ・インスティテュートDSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
| Equipment | |||
| Wafer Cleaner SSEC 3300 | Solid State Equipment LLC | ||
| Spin Coater SPIN150 -NPP | SPS Europe B.V. | ||
| マスクアライナー MA-6 | カール・スース | ||
| ホットプレート HP30A - 2 | トーリーパインズ 科学 | ||
| 研究所用オーブン Memmert UN 200 | Memmert | ||
| プラズマクリーナー FEMTO | Diener Electronics、ドイツ | ||
| neMESYS シリンジポンプ | Cetoni GmbH、ドイツ | ||
| マグネチックスターラー CB 162 | スチュアート | VWR 442-0304 | |
| 顕微鏡ニコンエクリプチTi | コン顕微鏡 | ||
| incubuator | ペコンGmbH、ドイツ | ||
| 遠心分離機minispin plus"ブラックライン」 | Eppendorf | 9776501 | |
| Photometer BioPhotometer plus | エッペンドルフ | 6132000008 | |
| シェイクフラスコシェーカー/インキュベーター 3031 | GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH、ドイツ | ||
| プロファイラー、Dektak 150スタイラスプロファイ | ラーVeeco |
参考文献
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