方法論記事

微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

DOI：

10.3791/50560

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2013年12月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Juelich GmbH

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、原核微生物のシングルセル分析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製作、セットアップ、および基本的な操作が紹介されています。工業的に関連性のある微生物を原理の証明として分析し、従来の方法では不可能だった特定の期間の成長率、形態、表現型の不均一性についての洞察を可能にしました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、最近導入されたマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製造、実験セットアップ、および基本的な操作について詳しく説明します。PLBRは、単一細菌およびマイクロコロニーの分析に利用して、細胞増殖、形態、ストレス応答、単一細胞レベルでの代謝物またはタンパク質産生など、バイオテクノロジーおよび微生物学的に関連する問題を調査することができます。このデバイスは、摂動研究のための一定の環境条件を可能にする連続的な媒体の流れを特長としていますが、さらに、高速な媒体変化や、任意の所望の環境状況を模倣するための振動条件を可能にします。シングルユースデバイスを作製するために、サブマイクロメートルサイズのSU-8構造を含むシリコンウェーハが、迅速なポリジメチルシロキサンキャスティングのための複製型として機能しました。チップを切断、組み立て、接続し、時空間細胞解析の強力なツールであるタイムラプスイメージングに適した高解像度の全自動顕微鏡にセットしました。ここでは、バイオテクノロジープラットフォーム生物であるコリネバクテリウム・グルタミカムをPLBRに播種し、細胞増殖と細胞内蛍光を数時間にわたって追跡し、フローサイトメトリーなどの従来の解析方法では不可能だった単一細胞レベルでの時間依存的な集団不均一性を解明しました。デバイス製造に関する洞察に加えて、さらに、前培養の準備、細菌のローディング、トラップ、および単一細胞とコロニーのPLBR培養が実証されています。これらのデバイスは、厳密な環境制御の下で単一の細菌の時間依存現象を分析するための微生物学的研究に新たな次元を追加します。シンプルで比較的短い製造プロセスにより、この技術はあらゆるマイクロ流体ラボに容易に適応でき、特定のニーズに合わせて簡単に調整できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タイムラプス顕微鏡は、生体内の生細胞を研究するための強力なツールです1。一方、熱誘起フォーカスドリフト補正を含む市販の全自動顕微鏡プラットフォームは、がんやニューロン細胞の研究から組織工学、単一酵母または細菌細胞の動的研究に至るまで、時間依存現象を研究するための生物学的研究に一般的に適用されています2-6。

通常、透明なウェルプレート、寒天パッド、または単に顕微鏡スライドを適用して、タイムラプスイメージング中に細胞培養環境を提供します7。これらの単純なシステムは、特定の研究には適していますが、環境条件に対する制御が非常に限られており、より複雑な摂動や明確に定義された高速な媒体変化を許容しません。大量生産によって製造された使い捨てマイクロ流体チップデバイスは、最近市場に導入されましたが、ほとんどがより大きな真核細胞タイプ向けに調整されています4。成長を追跡することは可能ですが、正確な細胞の捕捉、コロニーサイズ、成長方向、細胞除去能力など、明確に定義された成長調査は限られています。細菌細胞を3D環境で培養するマイクロ流体の生息地とリアクターが開発されてきた8-10は、シングルセルレベルでの定量的研究を扱う際に欠点があります。全体的な集団の不均一性を解析することはできますが、増殖は単分子膜に限定されないため、多くの細胞パラメータを単一細胞の分解能で正確に決定することはできません。

この制限は、明確に定義されたチャネルと生息地での細胞の培養を可能にするマイクロシステムの開発を引き起こしました。細胞は単一細胞の分解能で平坦な単層で成長し、特に培地供給と環境条件を厳密に制御します6,11,12。細菌細胞の培養のためのマイクロ流体システムの例は、ほとんど実証されていません12-14.細菌は通常、非常に速い増殖速度を示し、特に顕微鏡検査に細胞単分子膜が必要な場合には、数マイクロメートル以下の範囲のマイクロ流体構造を必要とします。Keymer他微細加工された景観における大腸菌株の成長と広がりを実証しました15,16。彼らは集団動態に興味を持っていたため、シングルセルの分解能では調査しませんでした。

私たちはピコリットルバイオリアクター(PLBR)13を開発しました。これは現在、成長17や単一細胞レベルでの蛍光結合生産性分析などのさまざまなバイオテクノロジーパフォーマンス指標の調査に適用されています18,19。本マイクロ流体デバイスは、約1ピコリットルの所定培養量での環境反応器制御と、連続的な単一細胞観察を同時に可能とする。一方または両側が媒体供給チャネルに対して開いているオープン単層ボックスシステム11,14と比較して、PLBRは制御された捕捉および培養を可能にする。この設計により、隣接する複数のコロニーが1つの大きな集団を形成するリスクなしに、細菌の長期培養が可能になります。さらに、高さ1μm(細胞径順)の培養領域を組み込んで、細菌の増殖を細胞単層に限定しています。対照的に、供給チャネルは10倍深くなり、油圧抵抗を最小限に抑えます。

小型化されたバッチ栽培システム20と比較して、現在のシステムは、連続的な培地の流れにより、一定の環境パラメータでの栽培を可能にします。さらに、媒体の組成、温度、流量、ガス交換などの環境パラメータは、簡単に制御でき、数秒で変更できます。これにより、例えば栄養素の利用可能性やストレス刺激に関する環境変化に対する細胞の応答を特異的に調査することができます。培地の量を減らすこと、すなわち数マイクロリットルの範囲に限ることに対する需要は、研究者が新しい研究、例えば、これらの特定の環境条件下での細胞応答を解明する大規模実験の上清を用いたタイムラプスイメージング中の細胞の摂動など、新しい研究を行うことを可能にしている17。ピコリットルバイオリアクターは、生物物理学的条件を厳密に制御し、高精度シリンジポンプとタイムラプスイメージング用の自動明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡を使用して操作する堅牢なシステムを研究者に提供します。ここでは、デバイスの設計、製造、および例示的なアプリケーションを含む完全なプロトコルを報告します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ウェーハ製造

  1. CADソフトウェアを使用して、入口、出口、メインチャネル、およびPLBR(図1A)を含むマイクロ流体デバイスを設計します。
  2. このプロトコル(図2)で提示された設計は、2つのシードインレット、2つの異なる基板を混合するためのグラジエントジェネレータ、1つのアウトレット、およびPLBRの6つのアレイで構成されています。各アレイには5つのPLBRが含まれており、1つのマイクロ流体デバイス内に30の並列PLBRがあります。
  3. 目的のチップレイアウトを含むリソグラフィーフォトマスクを作成します(図1B)。フォトマスクは、サブミクロンの分解能を持つ電子ビーム描画によって社内で製造されました。使用されたマスクは、5 in2ガラスプレート上のクロム層で構成されていました.
    注:クリーンルームクラス100以上の条件下で、次の手順をすべて実行します(プロセスフローチャートを図3Aおよび3Bに示します)。
  4. 4インチのシリコンウェーハをピラニア(硫酸と過酸化水素の比率10:1)とフッ化水素酸で数分間洗浄します(注意:危険な化学物質)。脱イオン水(DI)で約10秒間すすぎます。
  5. ウェーハを200°Cで20分間脱水します。
  6. ウェーハ(1層目)に1μm SU-8 2000.5フォトレジストをスピンコートします(4mlレジスト、スピン10秒、v=500rpm、a=100rpm/sec、スピン30秒、v=1,000rpm、a=300rpm/秒)。
  7. コーティングされたウェーハを95°Cのホットプレートに置き、余分な溶媒を排出します(65°Cで1.5分、95°Cで1.5分、65°Cで1分、理想的には2つのホットプレートを使用します)。
  8. 1層目のフォトマスク(ここではピコレータリアクタのトラップ領域)とウェーハをマスクアライナーの内側に挿入し、ウェーハを350〜400nm(真空接触、64 mJ /cm²、t = 3秒、I = 7 mW /cm²)にさらします。
  9. SU-8の重合を開始するには、95°Cのホットプレートで露光後ベークを実行します(65°Cで1分、95°Cで1分、65°Cで1分)。注:この手順の後、SU-8層の構造を確認できます。
  10. ウェーハをSU-8現像槽に1分間入れ、ウェーハを新しいSU-8現像液を入れた2番目の容器に数秒間移します。
  11. ウェーハをイソプロパノールですすぎ、SU-8現像液を除去し、ウェーハスピナーの窒素流を使用してウェーハを乾燥させます。
  12. ウェーハを150°Cで10分間ハードベークします。
  13. ウェーハ(2層目)に9 μm SU-8 2010フォトレジストをスピンコートします(4 mlレジストを分注し、v = 500 rpm、a = 100 rpm/秒で10秒間スピン、v = 4,000 rpm、a = 300 rpm/秒で30秒間スピンします)。
  14. SU-8 を塗布したウェハを 95 °C のホットプレートに置き、余分な溶媒を排出します (65 °C で 15 分、95 °C で 45-60 分、65 °C で 10 分)。注:シワや泡には注意が必要です。ウェーハを95°Cまで高速に加熱すると、蒸発した溶媒が小さな気泡に封入される可能性があります。
  15. 目的のレイアウトのフォトマスク(ここでは栄養素供給用のメインチャネル)とウェーハをマスクアライナーに挿入し、350〜400 nm(ハードコンタクト、64 mJ /cm²、t = 10秒、I = 7 mW /cm²)に露光
    16. します
  16. 95°Cのホットプレートで露光後ベークを行い、SU-8の重合を完了させます(65°Cで5分、95°Cで3分30秒、65°Cで3分)。注:この手順の後、SU-8層の構造を確認できます。
  17. ウェーハをSU-8現像槽に45秒間入れ、ウェーハを新しいSU-8現像液を入れた2つ目の容器に移し、60秒間現像します。
  18. ウェーハをイソプロパノールで20秒間すすぎ、SU-8現像液の残留物を取り除き、加圧窒素を使用してウェーハを乾燥させます。
  19. 最後に、ウェーハを150°Cでハードベークします。その結果、最終的なウェーハ(図1C)が得られ、PDMS成形のマスターモールドとして使用されます。
  20. プロファイラー(表面形状測定機)の測定(図3C)を実行して、SU-8構造の高さを検証します。注:構造の高さが不正確であると、培養中に細胞の非効率的な捕捉や細胞の損失につながる可能性があります。

2. ポリジメチルシロキサンチップの製造

注:以下のすべての手順は、粉塵粒子が製造手順に干渉するのを防ぐために、理想的には層流条件下で実行する必要があります(プロセスフローチャートを図4に示します)。

  1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースと硬化剤の混合物を10:1の比率で調製します。不透明に見える均質な溶液が得られるまで、慎重に混合します。希望の層の高さ(ここでは3 mm)に必要なだけ準備します。
  2. PDMS混合物をわずかな真空下で約30分間、すべての気泡が消えるまで脱気します。
  3. 適切なSU-8ウェーハを装着した成形装置(またはシャーレ)を作製し、PDMS混合物を注ぎます(図1D)。
  4. PDMSをオーブンで80°Cで3時間焼きます。
  5. PDMSスラブをウェーハから慎重に剥がします。清潔で鋭利なメスを使用して、スラブを単一のチップに切ります。
  6. チップをn-ペンタン浴で90分間洗浄し、続いて2回のアセトン洗浄浴(各90分)で洗浄します。チップを一晩乾燥させて、溶剤の残留物を取り除きます。注意:PDMSの洗浄はドラフトの下で行ってください。注:n-ペンタン洗浄中、モノマーとダイマーは硬化したPDMSから除去され、洗浄手順中にチップサイズが一時的に2倍になる場合があります。
  7. マイクロ流体PDMSチップは、最終実験まで近くの容器に保管してください。
  8. 実験の直前に、チューブとPDMSチップを接続するために使用されるコネクタよりもわずかに小さい直径のニードル(またはホールパンチャー)を使用して、PDMSチップに入口と出口の穴を開けます。
  9. マイクロ流体PDMSチップをイソプロパノールで慎重に洗浄し、スコッチテープを使用して、構造化されたPDMS側に付着する可能性のあるほこりの粒子を取り除きます。チップに粒子が見えなくなるまで、スコッチテープを数回使用します。
  10. 170 μmの薄いスライドガラスをアセトンとイソプロパノールで順次洗浄します。最後に脱イオン水で洗浄し、加圧窒素で乾燥させます。
  11. プラズマ活性化の前に、プラズマクリーナーを温め、約300秒間プラズマを流してください。
  12. ボンディングする前に、PDMSとガラスチップを位置合わせします。最後に、PDMSチップをスライドガラスに慎重に置きます(図1E)。PDMSとガラスは数秒で接着します。注:ボンディングプロセス中にピンセットでPDMSチップの上部を押し込まないでください。これは、水路や小さな構造物のいわゆる屋根の崩壊につながる可能性があります。
  13. 結合を強化するために、最終的なPDMSガラスチップを80°Cで10秒間ベークします。

3. 細菌培養の準備

注:すべての栽培は、栽培中に干渉する可能性のある望ましくない粒子の蓄積を防ぐために、滅菌ろ過された培地で準備する必要があります。

  1. 目的の生物(ここではC. glutamicum ATCC 13032)を含む寒天プレートを使用し、1つのコロニーを20 mlの新鮮なBHI培地に接種し、ロータリーシェーカー(120 rpm)で30°Cで一晩(≈ 8〜14時間)インキュベー
    2. トします。
  2. 10 μlのプレカルチャーを目的の培地(ここではCGXII21)に移し、マイクロ流体培養中に使用し、ロータリーシェーカー(120 rpm)で細胞を30°Cで一晩成長させます。
  3. 所望の量の細胞懸濁液(実験の開始に応じて10〜500μl)を、マイクロ流体細胞培養中に使用する目的の培地(ここではCGXII21)に移します。注:最善は、初期の対数期の細胞を播種に使用することです。C. glutamicumの培養では、播種に最適な光学密度(OD600)は0.5〜2でした。
  4. 1 mLの細菌培養物を滅菌済みの2 mLチューブに移します。注:これは、振とうフラスコとマイクロ流体培養の間の移動時間を最小限に抑えるために、マイクロ流体PDMSチップが組み立てられた直後に行う必要があります。通常、転送時間は約15分であり、酸素制限や温度変化によって引き起こされる代謝への影響を防ぐために、できるだけ短く保つ必要があります。

4. 実験的なセットアップ

注:すべてのステップは倒立顕微鏡で実行されます。

  1. 実験の2時間前に顕微鏡インキュベーターを起動して、システムをウォームアップします。注:顕微鏡には、温度を制御し、必要に応じてガスの流れを制御するために、フルサイズのインキュベーターを装備する必要があります。チップシステムにはメディアが継続的に注入されるため、追加の湿度制御は必要ありません。
  2. インキュベーターシステムを開き、目的の対物レンズを選択し、必要に応じて対物レンズに液浸油を加えます。
  3. チップをチップホルダーの内側に取り付けます。必要に応じて、ステージ操作中に欠けが動かないように、ガラスプレートを粘着テープで固定します。
  4. サンプルを顕微鏡の中央に置き、PLBRアレイに焦点を合わせます。
  5. 入口と出口を適切なチューブで接続します(図1F)。チューブを廃棄物リザーバーに接続します。代表的なチップを図4Dに示します。
  6. シリンジをポンプに挿入し、メディアの流れを開始します。培地、緩衝液、または必要に応じてコーティング液を使用し、マイクロ流体チャネルを約1時間すすぎます注:コーティング液は、非特異的な細胞接着を防ぐためにチャネル壁をコーティングするために使用されます。
  7. 大腸菌の場合、0.1%のBSA溶液を使用してチャネル壁をコーティングします。C. glutamicum の場合、コーティングは必要ありません。コーティング手順の後、チップを培地で洗い流してから細胞播種します。
  8. 細胞播種や培養を行う前に、漏れが発生していないこと、温度が一定であることを確認してください。

5. マイクロ流体デバイスへの細菌細胞の播種

  1. チューブに接続された適切なシリンジで目的の細菌溶液が利用可能であることを確認してください。
  2. バッファーまたはコーティング溶液を切断し、セル懸濁液をチップに接続します。デスボリューム、望ましくない気泡を最小限に抑え、実験時間を短縮するために、シリンジだけでなく、針全体とチューブを交換してください。
  3. 細胞懸濁液を200 nl/minの体積流量でチャネルに注入し、ほとんどのPLBRが所望の量の細胞で満たされるまで(図5A)。注:最適な播種結果は、細菌株、OD600、およびプレカルチャーの増殖培地によって異なります。これらのパラメータは、トラップ効率と、十分な数のセルが反応器構造にトラップされるまでの時間を増やすように適合させる必要があります。C. glutamicumの場合、典型的にはOD600 0.5-2の細胞懸濁液が使用された。大腸菌の場合、OD600は0.5〜1でした。
  4. 充填されるPLBRの数が少ない場合は、流量を800〜1,200 nl/minに増やします。
  5. 細胞懸濁液を取り外し、増殖培地をチップに接続します(図5B)。媒体交換中に気泡が発生しないようにしてください。新鮮な成長培地で100 nl/minで灌流します。

6. タイムラプスイメージング

  1. タイムラプスイメージング用の特定のPLBRを選択します。通常、PLBRは、実験の開始時に単一の母細胞を含むものが選択されます。1回の実験で調査できる関心領域の数は、目的のフレームレートと顕微鏡のセットアップによって異なります。
  2. PLBRの数に応じて適切なフレームレートを選択します。マイクロスコープがタイムラプスインターバルで必要な量のROIを処理できることを確認してください。
  3. 適切なフィルター セット (ここでは YFP) を選択します。ステージ移動中やタイムラプス測定のたびに自動的にシャッターを閉じ、発色団の漂白を防ぎます。
  4. タイムラプス顕微鏡シーケンスを設定し、実験を開始します。
  5. すべてのPLBRが生い茂った後、実験を中止し、マイクロ流体PDMSチップを破棄して、実験を評価できます。

7. 分析

注:次の手順または手順の一部は、手動で実行することも、ImageJなどの画像分析プログラムによって実行することもできます。

  1. 培養が必要なすべての基準(母細胞の数、母細胞の位置など)を満たす関心のあるPLBRを決定します。
  2. 1つのマイクロコロニーの増殖速度を決定するには、各時間枠の細胞数をカウントします。
  3. 時間 vs. ln (セル番号) をプロットして、最大成長率を計算します。プロットの傾きは、[1/時間]単位の成長率を表します(図6を参照)。
  4. 蛍光データ解析は、実施する実験に大きく依存します。このレポートでは、異なる同質遺伝子マイクロコロニー間のコロニー間および細胞間の不均一性を示すために、例を選択しました(図7を参照)。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

デバイス製造

マイクロ流体PLBRシステムは、高解像度顕微鏡に適した薄いガラスチップに1層のPDMSを接着して製造します。製造は、1 番目にレプリケーション マスターの製造 (図 1A、1B、および 1C) と、次にチップの製造 (図 1D、1E、および 1F) の 2 つの主要なステップで構成されます。プロトコルによれば、標準的なフォトリソグラフィー微細加工技術を使用してマスターモールドを作成します。クリーンルーム設備のない研究室では、市販のカスタマイズされたSU-8マスター金型を取得することができます。PDMS成形を繰り返し行う(図1A、1B、1C)ことで、数百個のディスポーザブルチップを作製できます。PDMSの成形とチップの組み立ては、どのラボでも行うことができ、クリーンルーム設備は必要ありませんが、層流の作業場が有利です。

このプロセスは、マイクロ流体チップシステムの設計から始まります。通常、マイクロ流体チップの設計にはCADソフトウェアが使用されます(図1A)。CADの後、サブミクロンの分解能で電子ビーム描画装置(図1B)によってマスクが生成されます。本研究では、SU-8ウェーハリソグラフィーに使用した5インチクロムマスクを作成しました。最終的なシリコン-SU-8ウェーハはPDMS成形に使用されます(図1D)。ベーキングステップの後、PDMSスラブはチップに切断され、スライドガラスに不可逆的に結合されます(図1E)。最後に、チューブが接続されます(図1F)。

図2は、マイクロ流体システムの設計を詳細に示しています。これは、2つのシードインレット、異なる基質またはメディアを混合するためのグラジエントジェネレーター、および1つのアウトレットで構成されています。メインチャンネルの寸法は50μm x 10μm(W x H)です。各デバイスは、それぞれ5つのPLBRを含むPLBRの6つのアレイで構成されています。これにより、1つのマイクロ流体デバイス内に30個の並列化されたリアクターが作成されます。

図 3 は、レプリケーション・マスターの運用を示しています。プロトコルで詳細に説明されているように、最初のSU-8層はSU-8リソグラフィーによって製造されます(図3A)。同様の手順が 2 番目の層にも適用されます (図 3B)。チャネルの形状を確認するために、プロフィロメータを使用してPLBRとメインチャネルの高さを調査しました。図3Cに示す例では、第1層(栽培層)を測定しました。ここでは、層は1,200 nmの一貫した高さを示しており、BHI培地でのC.glutamicumの培養に適しています。

図4は、PDMSの混合(図4A)から始まり、成形プロセス(図4B)、最後にボンディングステップ(図4C)に続くPDMS成形手順を示しています。Figure 4Dは、厚さ170 μmのガラスプレート、入口と出口を備えたPDMSチップ(高さ3 mm)、およびチューブに接続されたスチール針を組み込んだ最終的なマイクロ流体チップを示しています。実験後、チップは廃棄することができ、大規模な洗浄は必要ありません。さらに、組み立てや取り扱いも簡単です。複雑で難しい充填手順は必要ありません。

デバイス原理

図5は、原子炉システムの動作原理を示しています。細胞はマイクロ流体デバイスに注入され、個々の細胞は細胞壁の相互作用によってPLBR内に閉じ込められたままになります。チャネルとPLBRの流体力学的抵抗の違いにより、PLBR内で発生する流れは最小限です。PLBRの播種後(図5A)、細菌溶液から増殖培地への変化により、成長および観察段階が開始されます(図5B)。PLBRが大きくなりすぎた後(図5C)、通常は実験を停止し、タイムラプス画像を分析できます。PLBR内のトラッピングメカニズムとフロープロファイルについては、Grünbergerらを参照してください。詳細については、13を参照してください。

成長率分析

本システムは、成長、形態、または蛍光シグナルなどのさまざまな生物学的パラメータに関して、さまざまな細菌種を研究するために適用できます。最初の例では、工業的に関連性のある生産生物であるC.glutamicumを標準培養条件(T = 30°C、CGXII培地21)で培養しました。図6Aは、3つの同質遺伝子マイクロコロニーから得られた成長曲線を示しています。PLBRが満たされるまで指数関数的な成長が維持され、栄養制限が発生しないことを示しています。図6Bは、成長するC.glutamicumコロニーの4つのDICタイムラプス顕微鏡画像を示しています。

蛍光分析

シングルセル蛍光顕微鏡では、研究者はしばしば特定の蛍光タンパク質、例えばGFPや誘導体を利用して、目的の特定の表現型を測定可能な出力(蛍光シグナル)に結合します。PBLRの蛍光ベースのタイムラプス研究への適用性を実証するために、Pタックプロモーター(pEKEx2-yfp-tetR)の制御下でプラスミドコードYFP-TetR融合タンパク質を生産するC.glutamicum株の蛍光発光を調査しました18,22。低インデューサー(IPTG)濃度の存在下では、Ptacからの発現により、同質遺伝子細菌集団の細胞間変動が大きくなることが知られています。1つの予備培養から始めて、いくつかの同質遺伝子マイクロコロニーについて増殖と単一細胞蛍光を追跡しました。図7に見られるように、異なるマイクロコロニー間の表現型の不均一性と、1つの母細胞から始まるコロニー内の単一細胞レベルでの不均一性が観察されました。1つのコロニー(図7B、PLBR 1)はほとんど蛍光発光を示さなかったが、PLBR 2の細胞は、Ptacプロモーターからの基礎yfp-tetR発現により低蛍光発光を示した。PLBR 3では、蛍光発光は他のコロニーと比較してかなり強く、集団の広範な分布が観察されました。この例は、PBLRがタイムラプス蛍光顕微鏡研究に適用できることを示しています。単一細胞の蛍光を1つの時点で測定できるフローサイトメトリーと比較して、現在のシステムでは、細胞の追跡と単一細胞の蛍光の研究を何世代にもわたってリアルタイムで行うことができます。

figure-results-1
図 1.PLBRチップの製造プロセスの概要。マスターモールド作製:(A)デザイン、(B)リソグラフィーマスク作製、(C)ウェーハ作製からスタート。PDMSガラスチップ製造:(D)のPDMS成形から始まり、(E)ガラスとPDMSのボンディング、(F)最終チップの組み立て。

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図2. PLBRチップの設計(A)マイクロ流体チップ全体のCAD図面。(B)選択したレイアウト位置の倍率:レイアウトには、2つのミディアムインレット(a1)、ミキシングチャネルを備えたグラジエントジェネレーター(a2)、および6つの並列PLBRアレイ(b1)が含まれています。 b2は、幅100μmの流体チャネルに埋め込まれた1つのPLBRを示しています。PLBRの内径は40μmで、栄養チャネルの幅は2μmです。播種入口の長さは40μmです。ピンク色は第1層(捕獲・栽培地域)、青色は第2層(流体輸送)を表しています。

figure-results-3
図 3.(A)トラッピング構造を含む第1層の作製;(B)流体チャネル、入口および出口を含む第2層の製造。(C)最初の層の代表的な表面プロファイル。この場合、第1層の高さは1,200 nmであり、複雑な培地でのC.glutamicumの培養に使用されます。

figure-results-4
図 4.デバイス製造と代表的なチップ。PDMS成形プロセスの図:(A)PDMSの混合と脱気。(B)PDMS成形;(C)離型剤、切削加工、切りくず接合。最終チップ(英国王立化学会の許可を得て複製13):(D)2つの入口と1つの出口を備えたPDMSチップの写真。(E)それぞれ5つのPLBRを含む6つの並列アレイのCAD画像。(F)1つのPLBRのSEM画像。

figure-results-5
図5. PLBRシステムの動作原理。 (A)播種段階。(B)細菌のマイクロコロニーの成長期;(C)オーバーフローフェーズ。英国王立化学会の許可を得て複製13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

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図 6.C. glutamicum WTマイクロコロニーの成長率測定。(A) 3つのPLBR栽培の成長プロットとその結果の指数曲線(一部は英国王立化学会の許可を得て複製)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.(B)成長するC.glutamicumコロニーのタイムラプス画像。

figure-results-7
図7. PBLRに基づく集団の不均一性の分析。C. glutamicumは、誘導剤IPTGの非存在下でPtacプロモーター(pEKEx2-yfp-tetR)の制御下でyfp-tetR融合を発現している。(A)実験ワークフロー;(B)コロニー間の不均一性および細胞間の不均一性を示す3つの同質遺伝子マイクロコロニー。(C)それぞれのマイクロコロニー内の単一細胞蛍光の分布。

figure-results-8
図8. 異なるPLBRの走査型電子像トラップ効率を最適化するためのシーディングインレットを示すSEM画像。(A)ラガー播種入口 (B)小さい播種入口 (C)より大きな「開いた」播種入口 (D)2つの播種入口。

歩問題考えられる理由解決
ウェーハ製造ソフトベーク中のSU-8に閉じ込められた気泡温度が速く上昇する95°Cと65°Cで数回焼きます
ウェーハ製造消えて壊れたSU-8構造最適な製造手順ではない;SU-8構造の機械的ストレスベーキング時間、露光時間などのパラメータを最適化します
ウェーハ製造SU-8層から低または高または不均一な層の厚さスピンコーティング中の問題スピンコーターのパラメータとウェーハチャックの確認
チップボンディングとアセンブリ PLBRの崩壊PDMSボンディングパラメータが最適ではない 電力、プラズマ露光時間、ボンディング後のベーキング時間を調整します。
チップボンディングとアセンブリPLBRの汚れた構造と粒子チップが適切にクリーニングされていなかった表面のクリーニングにスコッチテープを貼る
チップボンディングとアセンブリPDMSガラスボンディングが不十分ボンディングパラメータが最適でない、または洗浄が不十分 酸素プラズマの設定を確認する
マイクロ流体実験流体漏れ入口/出口の穴が適切に開けられていませんでした 穴あけ加工の最適化
マイクロ流体実験充填中の多数の小さなPDMS粒子穴が適切に開けられていなかった 穴あけ加工の最適化
マイクロ流体実験、生物学的側面細胞増殖なし洗浄手順からの溶剤残留物セルローディングの前にチップをより広範囲にフラッシュするか、ボンディング前に溶媒を蒸発させます
マイクロ流体実験、生物学的側面成長率の変化さまざまな理由がありますプレカルチャーと温度を確認する
マイクロ流体実験、生物学的側面培養中の細胞形態の変化栄養素の制限または温度変化インキュベーターとフローの確認
マイクロ流体実験、技術的側面タイムラプス顕微鏡観察中の位置のずれ温度変動振動がなくなるまで、実験前の温度プロファイルを確認してください
マイクロ流体実験、技術的側面培養中の細胞の損失やや高い原子炉高さ リアクターの高さの最適化
マイクロ流体実験、技術的側面トラッピングなし原子炉の高さが低すぎる リアクターの高さの最適化

表 1. トラブルシューティング. この表は、実験作業中の重要な側面、よくある間違い、可能な解決策をまとめたものです。

ディスカッション

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細菌の単一細胞分析用の複数の(PLBR)を含むマイクロ流体PDMSデバイスの製造、実験セットアップ、および関連する操作手順について説明しました。

ソフトリソグラフィ技術を使用した微細加工により、さまざまなサイズや細菌の形態に合わせてデバイスの寸法を迅速に調整できます。現在、さまざまな微生物の培養と培養スループットに関して、ピコリットルバイオリアクターを最適化しています。トラップ効率を高めるために、反応器の形状も最適化されています。 図 8 は、現在検証されている 4 つの新しい PLBR デバイスを示しています。すべての図で、播種チャネルは幅と形状に関して再設計されました。実際には、これは閉じ込められる細胞の数に影響を与えるようですが、さらなる調査が必要です。追加のオーバーフローチャネルを組み込むことで、トラップ効率に関する大幅な改善も達成され、リアクターを通る対流が増加し、より多くのセルがトラップされます。ただし、同時に、培養中に細胞が洗い流されるリスクが高まります。

この装置は、単一細胞レベルでの成長と生産プロセスを調査するために何十年にもわたって使用されてきたマクロスケール培養に代わる興味深いものです。ただし、いくつかの重要な要件があります。複数のピコリットルバイオリアクターを並行してモニタリングするには、焦点ドリフト補正を備えた高解像度で完全に電動化された顕微鏡セットアップが必須です。さらに、測定全体を通じて所望の培養温度を一定に保つために、インキュベーションシステムが必要です。

デバイス製造の成功率は95%です。主な問題は、非効率的なPDMSガラス接着、PDMS屋根の崩壊、または流体漏れに関連しています(発生するほとんどの問題のトラブルシューティングについては 、表1 を参照してください)。実験作業は部分的に非無菌条件下で行われますが、流体システムは閉じているため、実験中に汚染が見られることはめったにありません。PDMSマイクロ流体デバイスは光学的に透明であるため、高解像度の in vivo イメージングに使用できます。PDMSは用途に最適と思われますが、疎水性分子に対する親和性が高いため、全細胞生体触媒プロセスで広く使用されている溶媒の使用が制限されています。ただし、プロトコルをこの種のアプリケーションに適応させるための適切なコーティングが利用可能です。

提案されたPLBRは、さまざまな種類の細菌の細胞および細胞内イベントの時空間解析に適しています。現在のアプローチの主な利点は、従来の方法とは対照的に、マイクロコロニーの成長を直接定量化できることにあります。さらに、PLBRは、定義された一定の条件下での培養を可能にします。このシステムは、少量の試薬や材料の使用を容易にするため、安価でカスタマイズ可能で、高スループットに適しているという利点があります。従来の方法では、微生物の培養を分析する際には、母集団全体の平均値が考慮されます。さらに、既存の方法では手動サンプリングが必要であり、サンプルの劣化につながり、測定に誤差が生じる可能性があります。PLBRは、微生物学におけるバイオプロセス開発と集団不均一性解析に新しい視点を提供します。PLBRは、バイオプロセス開発におけるさまざまなアプリケーションにとって有望なツールであり、細胞間の不均一性 の分析、細胞系統内の特定の細胞クラスターの分析、微生物産生株のスクリーニング、細胞表現型のリアルタイム調査など、さまざまな研究分野に適用できます。

開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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著者は、技術者のAgnes Müller-Schröer氏の貴重な貢献に感謝します。この研究の一部は、Forschungszentrum Jülich GmbHのHelmholtz Nanoelectronic Facility(HNF)で行われました。著者は、寛大な支援とサポートに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シリコンウェーハ直径100mm、P / BOR <100>Si-MAT, Silicon Materials, ドイツ
フォトレジスト SU-8 2000.5Micro Resist Technology GmbH, ドイツ
フォトレジスト SU-8 2010Micro Resist Technology GmbH, ドイツ
SU-8 Developer mr DEV- 600Micro Resist Technology GmbH, ドイツ
ポリジメチルシロキサン (PDMS) シルガード 184 シリコーンエラストマーキットダウコーニング;Farnell GmbH、ドイツ
ディスペンシングニードル Precision Tips  27 G;ID = 0.2 mm、OD = 0.42 mmNordson EFD Deutschland、ドイツ
ガラスプレート D263 T eco、30 mm x 25 mm x 0.17 mmSchott AG、ドイツ
ホールパンチャー AKA 5130-B-90ハリス ユニコア
チューブ タイゴン S-54-HL、ID = 0.25 mm、OD = 0.76 mmサンゴバン;VWR International GmbH、ドイツ
使い捨て注射器–Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 mlB. Braun Melsungen AG, Germany552-183143
Syringes, 1 ml sterile glass syringesINNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Germany
Chemicals
(NH4)2SO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
UreaCarl Roth GmbH + Co. Co.KG、ドイツ
KH2PO4Carl Roth GmbH + Co. KG、ドイツ
K2HPO4Carl Roth GmbH + Co. KG、ドイツ
MgSO4•7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ
MOPSCarl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ
FeSO4•7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ
MnSO4•H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ
ZnSO4•7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ
CuSO4Carl Roth GmbH + Co. KG, ドイツ
NiCl2•6H2OCarl Roth GmbH + Co. KG (ドイツ
CaCl2Carl Roth GmbH + Co. KG ドイツ
BiotinCarl Roth GmbH + Co. KG ドイツ
カテク酸Carl Roth GmbH + Co. KG
BHIベクトン、ディキンソン
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032DSMZ;ライプニッツ研究所DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Escherichia coli MG 1655DSMZ;ライプニッツ・インスティテュートDSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPPSPS Europe B.V.
マスクアライナー MA-6カール・スース
ホットプレート HP30A - 2トーリーパインズ 科学
研究所用オーブン Memmert UN 200Memmert
プラズマクリーナー FEMTODiener Electronics、ドイツ
neMESYS シリンジポンプCetoni GmbH、ドイツ
マグネチックスターラー CB 162スチュアートVWR 442-0304
顕微鏡ニコンエクリプチTiコン顕微鏡
incubuatorペコンGmbH、ドイツ
遠心分離機minispin plus"ブラックライン」Eppendorf9776501
Photometer BioPhotometer plus エッペンドルフ6132000008
シェイクフラスコシェーカー/インキュベーター 3031GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH、ドイツ
プロファイラー、Dektak 150スタイラスプロファイラーVeeco
) プロニ顕微鏡

参考文献

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