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方法論記事

飼育第1の給電ゼブラフィッシュの完全および更新された「ワムシPolyculture方法」

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DOI:

10.3791/53629

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2016年1月17日

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1Aquatic Resources Program, Boston Children's Hospital, 2UQ Biological Resources, University of Queensland, 3Reed Mariculture, 4Aquatics Lab Services

この記事について

サマリー

幼虫のゼブラフィッシュは動物プランクトンを食べるのに適応しています。実験室でこの自然の特徴を利用するには、最初に餌となる魚を生きた海水ワムシと同じシステムで一緒に育てることが可能です。 この「ポリカルチャー」戦略は、幼虫への労働と妨害を最小限に抑えながら、高い成長と生存を促進します。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、科学の多くの分野でますます重要性を増しているモデル生物です。 実験室でのこの種の培養の最も要求の厳しい技術的側面の1つは、最初に餌をやった幼虫を高い成長率と生存率で幼若期に育てることです。 この開発期の中心的な管理課題は、水質を損なうことなく、栄養価の高い飼料をほぼ継続的に魚に届けることを中心に展開しています。 ゼブラフィッシュの幼生は水柱の小さな動物プランクトンを食べるのに適しているため、ブラキオニドワムシ、アルテミア、ゾウリムシなどの生きた獲物は、少なくとも魚が幼若期に達し、加工飼料を効率的に食べることができるようになるまでは、選択可能な餌として広く認識されています。 このプロトコルは、新たに孵化したゼブラフィッシュの幼生を、生きた海水ワムシ(Brachionus plicatilis)と一緒に同じシステムで培養する方法を説明しています。この多文化アプローチは、パフォーマンスを制限するレベルの化学廃棄物を生成することなく、魚に「オンデマンド」で栄養豊富な生きた食料源を提供します。 重要なのは、このシステムはワムシの自然な高い生産性と魚の行動の好みの両方を利用しているため、メンテナンスに関連する労力が少ないことです。 以下のプロトコルでは、ゼブラフィッシュの幼生とワムシの多品種培養で使用するためのワムシの生産(任意のレベルに拡張可能)を組み込んだ、更新された段階的な手順を詳しく説明しています。これは、外因性摂食の最初の5日間で最大のパフォーマンスを促進します。

概要

5 -ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、発生遺伝学、毒物学、行動、水産養殖、再生生物学、多くのヒトの疾患1のモデル化を含むがこれらに限定されない科学分野の増加、で利用卓越した実験動物です。種は実験室で維持することは比較的容易であるが、彼 ​​らの文化6に関連する管理上の課題がいくつかあります。これらの中で最も顕著なのは魚が第一ガス膀胱インフレ7以降のフィードを開始する場合は特に、幼虫の飼育です。成長の5日7特に重要である-通常の、制御された条件の下では、この発達イベントには、次の3で、受精後（DPF）〜5日後に発生します。フィード項目は、diges適切なサイズでなければなりません - この段階で中心的な技術的な難しさは十分に第1の給電幼虫の栄養要求を満たすためにあります培養タンクに過度の廃棄物を作成せずに、ほぼ連続的に魅力的、および使用可能なtible、。歴史的にこのルーチン水交換8,9とともに、タンクで魚に餌の多数の少量を提供することで、一般的に達成されました。これらの方法はある程度成功しているが、それらは、非効率的で高い労働投入を必要とし、唯一の変数と成長と生存10の制限されたレートを返します。

自然界では、ゼブラフィッシュの幼虫は、おそらく水柱11に豊富に小さな動物プランクトンの存在を餌に。このため、このようなゾウリムシ 、ワムシ、およびアルテミアなどのライブフィードを組み込むlarvicultureプロトコルは、通常、7最も効率的です。 2010年、最もよく、共著者は、外因性の摂食12の最初の5日間塩水ワムシと一緒に静的な、汽水水に幼虫のゼブラフィッシュを成長させることが可能であることを実証しました。このアプローチは、どのハーネスエスワムシ培養の自然な高生産性が低い労働投入12,13と幼虫の成長および生存の収率が非常に高い料金、水を汚染することなく、十分な、栄養価の高い獲物を提供します。近年では、世界中の研究室の数は増加し、このプロトコルのバリエーションを採用しており、その多くが今保育園のシステム14をサポートするために、連続的にワムシを培養しています。

過去数年にわたり、ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureとワムシ生産の両方のための方法は、洗練され、より標準化されたと容易に拡張可能になるように改善されました。この記事では、1のためのステップバイステップの手順）は、連続かつ堅牢なワムシの生産と2）外因性の給餌の最初の5日間魚の力強い成長をサポートするために使用ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureシステムの確立を提供します。

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プロトコル

1.ワムシ文化

  1. 100 L培養容器を用いて培養システムの基本コンポーネント
    1. ワムシ培養のセットアップのためのすべてのコンポーネントを収集します。ワムシ培養セットアップはワムシを成長させるために培養容器（CV）で構成されています。送り出しのワムシ（送り出し培養容器、FCV）を維持するために、同様の容器。藻類の供給混合物（AFM）を格納するための丸底孵化瓶（貯水池、FRフィード）。 CV、FCVおよびFRを通気するための空気供給（AS）; CVとFCVに藻フィードの配信を制御するために、測光タイマー（PMT）と蠕動ポンプ。 CVの内側に座って、フロス粒子フィルタ（FPF）。
      注 ：サプライ品およびコンポーネントの完全なリストは、 物質一覧に記載されています。
  2. コンフィギュレーション
    1. 文化が簡単に収集続きに嵌合ドレインを経て収穫することができるように、スタンドまたはテーブルの上にCVとFCVを昇格ainer（ 図1）。各培養容器内の剛性チューブの長さにASを接続するための柔軟な空気供給チューブを使用してください。チューブは、CVやFCVの底に空気を提供するのに十分な長さであることを確認してください。
    2. AFMが含まれているFRの下まで延びて、剛性チューブの長さにASを接続するために小容量のエアラインを使用してください。空気の流れを調整するために、各エアラインにバルブを取り付けます。飼料供給チューブとのPMTにFRを接続し、上部付近に、CV / FCVの側面に開けた穴に、PMTからチューブを実行します。 図1。
  3. 起動
    1. 逆浸透水（RO）で使用可能な容量の90％に培養容器を埋めます。 ROが使用できない場合は、きれいな、脱塩素水道水を使用します。しかし、バイオセキュリティのリスク評価には、潜在的に病原性生物が源水に存在しないことを確実にするために実行する必要があります。注：このような分析を行うことができますいずれかの資格を水試験所によって。
    2. 15グラム/ Lの塩分濃度に達するように水槽塩と培養容器の水を用量。それは「ローリング沸騰」を維持す​​るように容器内に空気の流れを設定し、それは完全に通気することによって溶解されるまで、ゆっくりと培養容器に一定量の塩を加えます。それは完全に酸素化であることを確実にするために> 1時間水に空気​​を混入続けます。
    3. 藻類の供給混合物を作ります。クリーンの3リットルに、新鮮な（0 ppm）で水を脱塩素アンモニア中和剤（ナトリウムhydroxymethylsulfonate）のNaHCO 3および100グラムの100グラムを追加します。この最後の試薬は、培養器材の消毒から水道水や漂白剤残留物から残留塩素を中和するという付加的な利点を提供します。これは、これらの化合物が完全に溶解されることを保証することが重要です。そして、藻類の濃縮物（バイオマス乾燥重量〜15％）の1 Lを追加します。 4℃でFRおよびストアへの供給混合物を追加します。
    4. 千万 - 5のスターター培養物を追加します。 通気さ15グラム/ Lの塩分の水を含むCVにBrachionus plicatilisワムシ。ワムシは、出荷または貯蔵中に冷却されている場合、それらは以下のようになり、徐々に培養容器内の水の温度に順応させ（30分以上の間）（25 - 27゜C）。
    5. PMTの電源をオンにし、ワムシ培養容器内に藻フィードをポンピング開始。 〜藻類供給混合物の1.6ミリリットル、1日あたり、培養中に百万ワムシごとに配信されるように、PMTのタイマー機能を使用すると、藻類の供給混合物の送達速度を設定します。 24時間の期間にわたって定期的に少量ずつ授乳を配布。授乳より頻繁に、より良いです。
    6. 手動で設定された期間（ 例えば、1分）のためにPMTをオンにしてポンプの吐出流量を校正し、メスシリンダーやビーカーにこのインターバルの間にポンプ藻類を収集します。例えば、PMTの用量藻類5mlの1分であれば、線量率は次のようになります5 mlの藻類/分。
    7. 1.6ミリリットルによって、何百万人で、現在のワムシの数を乗じて、必要な毎日の供給速度を計算します。例えば、億ワムシの人口サイズのワムシ培養の1日あたりの供給の〜160ミリリットル（100×1.6 ml）を必要とするであろう。
    8. 24時間の期間を通して一定の間隔で合計一日の供給要件を投薬するPMTを設定します。例えば、の送達は、160 mlの総毎日の送り量は、部分に5 mlの4分間/分の投薬ポンプ速度とPMTのセットを使用して、24時間の期間にわたって一回3時間、毎日8回（5を送達することができml /分×4分= 20ミリリットル×8授乳= 160ミリリットル）。
    9. 収穫前に、72時間 - それは必要な人口を生成するまでの文化は一般的に48のために、成長できるようにします。 24時間で、最大始動後培養容器にフロス粒子フィルタを追加して、通常の保守を開始します。
  4. メンテナンス
    注：文化は継続的に動作し、routinが必要です理想的には、次の順序で、毎日同じ時刻に行われるべきである電子整備。
    1. クリーンで利用可能な容量の90％にFCVを記入し、10グラム/ Lの水族館塩を投与された、新鮮な水を脱塩素。水が十分に混合すること、及び塩の全てが完全に溶解していることを確認してください。それは「ローリングボイル」を維持す​​るように容器内に空気の流れを設定します。屈折計で塩分を測定し、塩分濃度が10g / Lであることを確認してください。この目標を達成するために、それを超えない重要なことです。
    2. 文化の異なる部分から、3ミリリットルホールピペットやautopipettorを使用して、各 - その後、2の3つのサンプルを収集し、文化が十分に混合されていることを確認します。CVにおけるワムシのサンプル。これらのサンプルは、便利なサイズ（ 例えば、10 ml）をチューブまたはバイアルに結合します。
    3. それは、解剖顕微鏡下で可視化することができるように、ペトリ皿に合わせたサンプルを2ml - トランスファー1。文化の品質をチェックします（の振る舞い​​を泳ぎますワムシ、切り離された卵の存在、汚染原虫）。
    4. 50％Lugols試料にヨウ素溶液100μlを加えることによって、残りの混合試料中のワムシを固定します。秒以内にLugolsを添加した後、水泳を停止するにはワムシを観察します。さて、簡単にワムシを数えます。
      注：エタノール、希釈漂白剤、または酢はLugolsの代わりに使用することができます。酢（2滴/ 10 ml）をあることの利点を有している非危険、およびワムシの契約をすることはできません漂白剤とヨウ素溶液などの記憶装置に強度を失うので、繊毛のコロナと「足」は、拡張のままではなく、動物がより自然に見えます。
    5. その後すぐにプラスチック製のピペットで〜2ミリリットルのサブサンプルを取り、（固定化されたワムシは急速に沈降する）、サンプルが十分に混合されていることを確認し、Sedgewick-ラフターカウントスライドに1ミリリットルを分配（20×50 1 mmの正方形）（ 図2 ）。解剖や化合物の顕微鏡を使用して、無傷のワムシをカウントし、トンこれらのワムシ（図2）に接続されている卵のotal数。 〜100ワムシをカウントするために、必要に応じてスライド領域の多くを数えます。 1ml当たりのワムシの数を計算して、スプレッドシートやログブックでこれを記録します。
    6. CVにおけるワムシの量の収穫は〜30％：、空気供給およびフロスフィルターを取り外し、ゆっくりとCVの下部にあるバルブを開け、水が53ミクロンメッシュスクリーンでプランクトンのコレクタに流入することを可能にします。バケツやドレインにフィルタリングした後、集電体の底から流れ出る水を収集します。ワムシの損傷を防ぐために、適度な流れに優しいを使用してください。ワムシは、画面上で乾燥させないでください。
    7. 一貫性の理由から、毎日ワムシの標準数のFCVを確立することが望ましいです。したがって、既知のCVのワムシ密度と収穫量に基づいて、一貫性の最終密度を達成するために、FCVの総音量を調整（ 例えば 、1500ワムシ/ mlで）。収穫ロティを追加FCVへFERSは：（ - 15グラム/ Lの10）静かにきれいな海水で満たされた洗浄ボトルを使用して、コレクション画面からワムシを転送します。 FCVの上に画面を反転し、食塩水の穏やかな流れでFCVにワムシを洗います。 FCVへの供給（一日あたり百万ワムシ当たり〜1.57ミリリットル）を提供するためのPMTを開始します。
    8. きれいな、柔らかいナイロンブラシやスクラブパッドでCVの内部全体をスクラブ。
    9. 水の量を置き換えるために5ガロンのバケツにきれいなRO水の測定量に塩の適切な量を添加することにより、15グラム/ Lの水の新しいミックスを作る収穫する失いました。バケツの水に塩を加え、完全に溶解するまで激しく攪拌した後、CVに追加します。
    10. シンクに高圧スプレーを使用して、それは破片がなくなるまでフロスフィルターを洗浄した後、CVにそれを返します。
    11. ワムシ/ mlの毎日の数に応じて、各投与イベントの持続時間を変更することにより、CVに送達藻類の供給量を調整します。配信される飼料の適切な量を決定するために、上記のステップ1.3.8で提供さの計算を使用してください。
    12. 約24時間後、プロセスを繰り返します。上記の（ - 1.4.10 1.4.2ステップ）と同様に（前日に不要であった）、FCVに残っているワムシを収穫することにより開始します。新鮮な、きれいな脱塩素水（5グラム/ Lの塩）の2リットルでそれらを濃縮します。これらは、バックアップ電源として4℃で保存するか、このプロトコルに記載されるものを超えて、魚の後の段階を供給するために使用することができます。
      注：このプロトコルは、2まで許可 - CVにおけるワムシが深刻な結果なしで収穫の省略を許容することができるので、（通常の自動給紙に）減少培養維持の3日間。

2. Polyculture

  1. セットアップ
    1. ティーストレーナーを通して生成された胚を注ぎ、その後静かに滅菌FISですすぐことにより産卵イベントからゼブラフィッシュの胚を収集時間、水（または適切に調整され、溶液の他の非汚染源、 例えば、胚培地、E3など）ペトリ皿に洗浄瓶から。
    2. 5日間皿当たり50胚 - 40の密度でペトリ皿中で28℃ - 25で胚を培養します。
    3. 5日後に受精、または孵化した幼虫の90％以上が積極的に水柱の中に泳いでいるのpolycultureフェーズを開始します。
  2. 接種
    1. 3.5 L保育園タンクにFCVから直接ワムシ培養液500ミリリットルを追加します。ワムシ培養水を含めることはpolyculture中ワムシの栄養成分を維持藻類フィードを提供します。
    2. ゆっくり保育園タンクに1ペトリ皿から幼虫を注ぎます。何の幼虫が皿に残っていないことを確認してください。
    3. 1 Lの最終体積と最終秒に到達するためにタンクに再循環システムまたは専用の水源からのクリーンな、コンディショニング魚水500mlを加えます5 G / Lのalinity。
      注：塩分は塩分<2グラム/ Lの場合> 7グラム/ Lとワムシの生存率はマイナスの影響を受けるの場合はゼブラフィッシュの幼虫の生存率がマイナスの影響を受けるため、この塩分濃度は非常に重要です。
  3. Polyculture段階
    注：polyculture段階は（日5-9受精後に対応し、5日間の合計）までの4日後の接種に続くべきです。
    1. ワムシや魚が存在し、成長していることを確認するために、この期間中に少なくとも1日1回あたりpolycultureタンクを確認します。ワムシは水柱全体に表示されていることを確認してください。 fishsはワムシの中で泳いで、水柱の中にも表示されていることを確認してください。
    2. タンクを介して通常の水の流れを開始します。スクリーンを配置したり、タンクからフラッシュされない幼虫を確保するための排水口の上にバッフル。
      注：この段階の終わりに、魚は、 アルテミアのようなより大きな獲物のアイテムを消費するのに十分な大きさになります125ミクロン - 75のサイズ範囲のノープリウスまたは処理フィード項目。
      注：代表polycultureタンク内のワムシ個体群動態はステップ1.4.2で説明したのと同じ方法で、タンクからワムシをカウント/サンプリングによって測定した - 1.4.5。それが完了するまでこれがpolycultureフェーズの開始から一日一回行われました。

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結果

ここに記載の連続ワムシの培養システムは動的であり、そして毎日の給餌、収穫率のばらつきがある場合ワムシ数が経時小さい程度に変動することは正常です。ボストン小児病院での養殖施設での積極的な文化の一つでワムシの人口は、上記のように維持し、30日（ 図3）をモニターしました。この期間中の平均培養密度は1330ワムシ/ mlの最大値及び510ワムシ/ mlの最小値と、932ワムシ/ mLでした。これは、このプロトコルに従って維持ワムシの培養物の典型的な性能を示しています。

ゼブラフィッシュとpolycultureタンク内のワムシの人口動態は、 図4に示されている。3.5 Lの水槽は、FCVのワムシの培養物500mlを、滅菌Fの500mlを接種しましたISH水、および40 5日齢の野生型（テュービンゲン株）の幼虫は、ワムシとゼブラフィッシュは、典型的なpolycultureタンクに行う方法を示しま...

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ディスカッション

魚を養うために、連続ワムシ培養系の確立と維持、及び同タンク内のワムシと一緒に最初に送りゼブラフィッシュの幼虫を培養：早期幼虫のゼブラフィッシュを供給するためのワムシpolyculture方法の実装を成功させるには、二つのタスクのための有効なプロトコルが必要です。

最初のローレンスおよび共著者14で説明したゼブラフィッシュの研究室用の連続塩水ワムシ生産システムのセットアップが変更されたアプリケーション内では、それは両方のより堅牢でユニバーサルにするために、いくつかの方法で強化されました。新しいプロトコルは、機器と方法論の両方で改善が組み込まれています。

藻類の供給混合物のためのストレージシステムはナマズ製造システム15で使用されるハッチングジャーを用います。それは階層化または凝集し、目詰まりを生じないように、これらの丸底瓶で飼料の保存は藻類原料の完全な混合を促進します配送ラインのエージング、頻繁に元のプロトコルを悩ませ問題。同様に、オールインワンプログラマブルタイマ/計量ポンプの使用は...

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開示事項

ECヘンリーはリード養殖社、養殖や魚の愛好家の市場にワムシ、藻類の濃縮物、およびその他の消耗品を提供する企業で採用されています。

謝辞

このプロトコールに記載の代表的な結果を得るために生成魚のケアと使用はボストン小児病院、プロトコル番号の14-05-2673Rで機関動物実験委員会によって定められたガイドラインに完全に従って行きました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ワムシ文化インフラストラクチャ
100 L 培養容器アクアニアリングカスタムポリカーボネート培養容器、円錐底、排水バルブ付き
5ガロン培養バケットキットリード海洋培養CCSスターターキット小規模施設用の小容量培養容器
リジッドクリアチューブ 1/2 "OD、36インチPentair Aquatic Ecosystems16025空気供給用硬質透明チューブ
メッシュチューブ PentairAquatic EcosystemsRT444Xフロスフィルター用メッシュチューブサポート
ワムシ フロス リード マリカルチャーワムシ フロス 12インチ x 42インチ粒子状廃棄物トラップ
蠕動式メータリングタイマーポンプ、5 GPDグレインジャー38M003 ワムシへの供給供給のためのタイマー付き計量ポンプ
蠕動計量タイマーポンプ、1-100 mL/hr(小規模培養用)Coral VueSKU:IC-LQD-DSRワムシへの供給供給用タイマー付き計量ポンプ
シリコーンチューブ ワムシ容器への藻類送達用コールパーマー
リジッドクリアチューブ "O.D.,36"Pentair Aquatic Ecosystems16025藻類ペーストへの空気供給用リジ
ッドクリアチューブ Rigid Clear Tubing O.D., 36"Pentair Aquatic Ecosystems16025藻類送達用の硬質透明チューブ
ワムシ
Live ワムシ Brachionus plicatilis タイプ Lリード マリカルチャータイプ L 500 万システム起動用ワムシストックカルチャー
ワムシ フィード
ヒドロキシメチルスルホン酸ナトリウムリードマリカルチャーClorAm-X®藻類飼料ミックス用1ポンド浴槽 アンモニア還元剤
重炭酸ナトリウムフィッシャー科学S25533B藻類飼料用pH緩衝液
微細藻類濃縮物リード マリカルチャーロティグロー Plus® 1リットル袋栄養的に最適化されたワムシ飼料
RG コンプリートリードマリカルチャーRG コンプリート 6 オンス ボトルオールインワン 微細藻類ベースの飼料 小規模培養用
Water Preparation
 Reef Crystals Reef SaltThat Fish Place198210培養水を作るための塩 (注:このアイテムは一例であり、汚染物質を含まない任意の塩の配合を使用することができます)。 
屈折計Pentair Aquatic EcosystemsSR6測定 塩分濃度
ワムシ培養装置
プランクトンコレクター 12インチ径、53ミクロンPentair Aquatic EcosystemsBBPC20ワムシ収集用メッシュスクリーン
スクラブパッドPentair Aquatic EcosystemsSCR-58培養容器内清掃用スクラブパッド
スクラブブラシ
バケツグレインジャーサプライ 43Y530混合培養水用の目盛り付きバケツ
ハッチング ジャーPentair Aquatic EcosystemsJ30藻類飼料ミックスの貯蔵
Lugol'sの解決策、希薄なフィッシャーサイエンティフィックS99481カウントするための生きたワムシを固定するために使用される&
nbsp;Pentair Aquatic Eco-SystemsM415Counting ワムシ
Miscelleneous
Tea StrainerKitchenworks971972産卵後のゼブラフィッシュの胚の収集に使用
チューブエージェントは、グリッド付きセジウィックラフタープランクトンカウントスライドを

参考文献

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