方法論記事

ラット肝移植モデルにおける血球力学的変化をシミュレートすることによる臓器虚血再灌流損傷

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DOI：

10.3791/61779

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2021年3月6日

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1Department of Intensive Care Unit, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 2Department of hepatobiliary surgery, The Affiliated Ningbo Medical Center Lihuili Hospital of Medical School of Ningbo University, 3Department of transplantation, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 4Digital Technology and Engineering college, Ningbo University of Finance & Economics

この記事について

サマリー

本論文では、肝移植後の虚血再灌流傷害に関する基礎研究を容易にするために、ラットにおける肝相(肝虚血)の動物モデルを構築する方法を詳しく説明する。

要約

ラットにおける正体異形肝移植(OLT)は、肝外器官の虚血再灌流傷害(IRI)を含む術前、術中および術後の研究に使用される実証済みの動物モデルである。このモデルには、数多くの実験とデバイスが必要です。肝相の持続時間は、移植後にIRIを発症する時間と密接に関連している。本実験では、血行力学的変化を用いてラットの肝外臓器損傷を誘発し、最大許容時間を決定した。最も重度の臓器損傷までの時間は、異なる器官のために変化した。この方法は、容易に複製することができ、また、肝臓移植後の肝外器官のIRIを研究するために使用することができる。

概要

虚血再灌流傷害(IRI)は、肝臓移植後の一般的な合併症である。肝疾患は、虚血媒介性細胞損傷および肝再灌流の異常な悪化を伴う病理学的プロセスである。肝性IRIと局所的な自然免疫応答は、熱と冷間のIRIに分けることができる、臨床環境の違いに応じて1。ホットIRIは、通常、肝臓移植、ショック、および外傷2の結果として、幹細胞傷害によって誘発される。冷たいIRIは、内皮細胞および末梢循環によって引き起こされる肝臓移植の合併症である3.臨床報告によると、肝性IRIは初期臓器不全の10%に関連しており、急性および慢性拒絶反応4,5の発生率を増加させる可能性がある。また、肝性のIRIはまた、多臓器不全症候群または全身性炎症反応症候群を誘発し、高死亡率6を有する。肝外臓器の関与を有する患者は、病院に長く滞在し、より多くのお金を費やし、より悪い予後7を持っている傾向があります。合併症の発症は、肝臓移植8の肝相の長さと密接に関連している。

ラットにおける異形性肝移植(OLT)は、1973年にアメリカの教授リーによって最初に報告された。実験手術では、縫合法を用いて、臨床肝移植のステップと血管の吻合と共通胆管(CBD)をシミュレートした。この手順は難しく、時間がかかり、成功率が低い9.1979年、KamadaらのラットのOLTは、26分以内に動脈性相を制御する門脈の吻合に対する「ツーカフ法」を創造的に用いることで、ラットのOLTを大幅に改善した。同年、ツィンマーマンは「単一胆管ステント法」を提案した。リーの研究に基づいて、ツィンマーマンは、直接ドナーとレシピエントのCBDを吻合するためにポリエチレンチューブを使用し、CBDの再構築を簡素化し、括約筋の機能を維持し、この方法は、OLTモデル11の胆道再建のための標準となった。1980年、宮田らは、門脈静脈(PV)、上皮性大静脈(SVC)、および肝内大静脈(IVC)がカフ法によって吻合された「三カフ法」を提案した。しかし、この方法ではカニューレの歪みが生じるおおありで、これは、下の大静脈逆流12の閉塞を招く可能性がある。1983年には、PVとIVCの吻合にカフ法を用いて「ツーカフ法」が提案されたが、SVC13には縫合法を採用した。この方法は、OLTモデルを確立するために世界的に学者によって採用されました。それ以来、カフ吻合のステップは、肝相を短くし、ラット14の生存率を向上させるために改善された。同様に、改善された方法は、アン肝相15を短縮するために臨床現場で使用される。しかし、肝臓移植後のIRIに関する基礎研究は、生存率が肝外器官への傷害の程度に反比例することを示している。そのため、さらなる研究が必要であり、肝臓移植後のIRIをシミュレートするためには、簡単で再現性の高い動物モデルが必要です。

肝相の定義に基づいて、ラットの肝外器官のIRIをもたらす肝臓移植における血行力学的変化をシミュレートした。本明細書では、肝臓移植後のIRIの基礎研究を容易にするために、ラットにおけるアン肝相(肝臓虚血)の動物モデルを構築する方法の詳細な説明を提供する。

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プロトコル

動物倫理委員会は広西医科大学(No20190920)の実験を承認した。すべての動物は広西医科大学動物実験センターから供給された。SPF雄のスプレイグ・ドーリーラット(200〜250g、10〜12週間)を使用し、室温25±2°C、湿度50±10%の下に保ちました。給餌は、操作の24時間前に停止しました;しかし、水が提供されました。

注:1人のオペレータは、マイクロ手術ベースまたは手術顕微鏡なしですべての操作を実行することができます。

1. 操作

  1. 体重を量った後、イオブルランでラットを麻酔(5%)動物麻酔装置を使用して。
  2. 1~2分後、ラットのつま先をピンセットで軽くクランプします。ラットがつまんでも反応しない場合、麻酔状態に入った。乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を使用してください。ラットの体温を37~38°Cに保つには、動物用暖房ランプを使用してください。
  3. 腹部消毒(ポビドンヨウ素溶液)に続いて、ラットを動物解剖テーブルに固定する。鉗子およびはさみを使用してxiphoidプロセスの下に3cmの中央部の切開を作る。
  4. 腹腔を開き、レトラクターを使用して肝臓を露出させ、肝胃靭帯を動員する。綿棒を使用して肝臓の中央葉をそっとひっくり返し、上に回してポルタヘパティスを露出させます。CBD、PV、および HA を識別します。
  5. 綿棒を使用して左下腹腔に向かって小腸を押し、濡れたガーゼで覆い、肝内静脈を右腎静脈に移動します。
  6. 右腎静脈の上の門脈、肝動脈、下静脈を、3-0シルク糸でマークされた眼内レンズと鉗子で分離し、それぞれスリップノットを有する。
  7. 左と右下肢皮膚を切り開き、眼用鉗子を使用して大腿静脈を露出させる。低分子量ヘパリン625 IU/kgを大腿静脈からゆっくりと注入し、全身をヘパリン化する。
  8. 門脈、肝動脈、および3-0縫合糸で右腎静脈の上の下の静脈をリゲートし、45分間続いた(図1)。腹腔内の小腸を交換し、ガーゼで覆います。これらの期間中に吸入麻酔を減らします。
  9. 45分後、門脈、肝動脈、右腎静脈の上の下静脈を解放する。
  10. 筋肉と皮膚を縫合し、層ごとに、吸入麻酔を終了する。4時間ごとに5mg/kgの皮下モルヒネを使用して術後鎮痛を提供する。
  11. 目が覚めてから25±2°C、湿度50±10%の温度でラットを観察してください。動物の暖房ランプが必要です。

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結果

ラットの肝臓虚血に対する耐性
この動物モデルでは、手術中に血管が結紮された部位を図1に示す。ラットを15分間の虚血(I15群)に対して無作為に5群に分け、30分(I30群)、45分(I45群)、60分(I60)、およびシャム群を各群に10匹ずつ含む。各群の生存率は、手術後14日目に観察された。すべてのラットはI15群、I30群、およびシャム群で生存した。8人はI45グループで14日間生き残り、I60グループで生き残ったのはわずか2人でした。これらの結果は、ラットが最大45分間の無肝相を許容できることを示唆している(表1)。

ラットの循環に及ぼす血管結紮の影響
実験中、バイオシステムズは、無肝期の前後に心拍数と血圧(右内頸動脈挿管)を記録した。我々は、ラットの心拍数と平均動脈圧(MAP)が血管結紮後に劇的に変化することを発見した(図2)。

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ディスカッション

ラットのOLTは、肝臓移植、IRI、移植拒絶反応、免疫寛容、移植病理学および薬理学、ホモ移植、異種移植における臓器保存を研究するための理想的なモデルです。現在、肝臓移植の実験研究に広く用いられている。

パイロット研究の間、我々は最初にペントバルビタールナトリウム腹膜内麻酔を投与し、これが高い術後死亡率と血行力学的変化に対する短い耐性につながったことを発見した。このように、我々は、その後の試験で吸入麻酔を使用して、作用の急速な開始と インビトロ 特性の迅速な排除を行った。吸入麻酔への切り替えは、ラットの許容時間と術後生存時間を有意に改善した。麻酔薬の過剰な処理を防ぐために、研究者はラットの呼吸と心拍数に注意を払う必要があります。生体システムは、心拍数と血圧を監視するために使用することができます。また、外科的縫合の厚さが血管の結紮に及ぼす影響も観察した。3-0より小さい線は血管を完全にリゲートすることができたが、それらは緩むのが難しく、血管の破裂につながる可能性がある。逆に、3-0より大きいラインは不完全な血管閉塞をもたらし、血行力学的変化を防ぐ。これらの物質的問題は...

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開示事項

この原稿の著者は、開示する利益相反はありません。

謝辞

広西医科大学第二付属病院のウェンタオ・リー博士とJi-hua Wu博士の有益な提案を認めたいと思います。著者たちは、チームメイトの皆様に有益なコメントやディスカッションをしてくれたことに感謝したいと思います。著者はまた、彼らのコメントのためにJoVEの匿名のレビュー担当者と編集者に感謝したいと思います。特別な感謝は、彼らの継続的なサポートと励ましのために元博士の両親に行く必要があります。寧波自然科学財団(2014A610248)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4%パラホルムアルデヒド溶液上海マックリン生化学株式会社P804536
空気乾燥オーブン上海Binglin Electronic Technology Co.、Ltd.BPG
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)キットエラブサイエンス・バイオテクノロジー(株E-BC-K235-S
アンモニアシノファーム化学試薬(株10002118
アミラーゼキットエラブサイエンス・バイオテクノロジー(株E-BC-K005-M
無水エタノールシノファーム化学試薬(株)100092183
動物麻酔器Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR640
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)キットRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
自動生化学分析装置。SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems(ネサリー時)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
遠心分離機Baiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
カバーガラス江蘇省泰実験装置有限公司10212432C
クレアチニンキットレイト生命分析科学株式会社S03076
水機ハンガリー3DHISTECH株式会社ドナテッロシリーズ2
埋め込み機湖北省Xiaogan国海医療技術有限公司。KH-BL1
冷凍機武漢Junjie電子有限公司JB-L5
ヘマトキシリン-エオシン染料溶液武漢Saiwellバイオテクノロジー株式会社G1005
高効率パラフィンワックス華龍パラフィンワックス株式会社Q / YSQN40-91
塩酸シノファーム化学試薬株式会社10011018
眼内レンズ(IOL)鉗子Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
イソフルラン深センRuiwode Life Technology Co.株式会社—
マイクロハサミ(ネサリー時)上海手術器具工場WA1010
ニードルホルダー上海手術器具工場J32010
中性ガム上海華神ヒーリング機器有限公司—
正常光学顕微鏡ニコンインスツルメンツ上海株式会社ニコンエクリプスCI
眼科用鉗子上海外科用器具工場J3CO30ストレート
眼科用鉗子上海外科用器具工場JD1060
眼科用ハサミ上海外科用器具工場J1E0
病理学スライサーShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
ピペットDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.
リトラクター北京金諾台技術開発有限公司JNT-KXQ
の走査器ハンガリー3DHISTECH株式会社Pannoramic 250
スライド武漢SaiwellのバイオテクノロジーCo.、株式会社G6004
キシレンSinopharmの化学試薬Co.株式会社1330-20-7
) ) ) (シーエム脱上海曲げ7010101008

参考文献

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