疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

サマリー

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。

要約

タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークは疾患において動的にリモデリングされますが、ほとんどのシステム生物学的アプローチはタンパク質の存在量の変化に焦点を当てており、重大な相互作用レベルの機能不全を見落としています。ここでは、細胞および初代ヒト組織におけるPPIネットワーク機能不全のハイスループット、体系的、疾患コンテキストマッピングを可能にする、堅牢なケモプロテオミクス法(機能不全タンパク質-タンパク質相互作用トーム(dfPPI)を提示します。この方法は、エピシャペロームベースの相互作用部アセンブリを選択的に捕捉するケミカルバイオロジープローブを、ラベルフリー液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)およびネットワークベースの計算分析と統合して、トランスクリプトームまたはプロテオミクスデータだけでは明らかではないタンパク質ネットワークの再配線を明らかにします。dfPPIプラットフォームは、疾患状態、種、組織全体に適用して、機能不全の実用的なノードを特定し、疾患の進行に関する高解像度のシステムレベルの洞察を可能にします。このプロトコルでは、サンプル調製、化学プローブ処理、アフィニティー濃縮、ラベルフリーLC-MS/MS分析、およびdfPPIデータセットの生成と解釈に使用されるバイオインフォマティクスワークフローの段階的な手順を示します。この記事は、このアプローチの再現性とアクセシビリティを促進し、より広範なシステム生物学およびトランスレーショナルリサーチコミュニティによる採用をサポートすることを目的としています。

概要

細胞の機能、ひいては生物の機能は、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの正確な調整に依存します^1,2。これらのネットワークは、ほぼすべての生物学的プロセスの組織化と実行を担当しています。PPI ネットワークは本質的に動的でストレスに反応しますが、病気では異常に再配線され、機能不適応につながる可能性があります。重要なのは、この再配線には必ずしも遺伝子またはタンパク質の発現の変化が伴うわけではないということです。むしろ、それは、そうでなければ正常^に発現するタンパク質間の物理的相互作用の変化から生じます^3,4,5。トランスクリプトミクスやプロテオミクスなどのシステム生物学における従来のアプローチでは、これらの重要な相互作用レベルの変化を捉えることができません。

PPIマッピング技術は大幅に進歩し、セルラーネットワーク^の組織と規制に関する洞察を提供します6^{、7、8、9、10、11}。アフィニティー精製質量分析(AP-MS)、架橋(XL)-MS、近接標識、共分画など、一般的に使用されるアプローチには、それぞれ、高い特異性、空間分解能、または一過性複合体の検出能力などの特定の利点があります6,8,9,10,11 .しかし、これらの方法は、多くの場合、餌タンパク質、遺伝子操作、または複雑なバイオインフォマティクスを必要とし、ネイティブの^{生物学的システム}におけるタンパク質ネットワークの大規模な疾患駆動型再配線を捉えるのに苦労する可能性があります6,7,8,9,10,11 .また、ほとんどは拡張性に欠けているため、大規模なサンプルコホートの分析や、条件、細胞型、または時点にわたる相互作用盤の変化を体系的にマッピングするには実用的ではありません 6,7,8,9,10,11 (表 1)。

このギャップに対処するために、疾患表現型の原因となるPPIネットワーク機能不全を直接同定するケモプロテオミクス法である機能不全タンパク質-タンパク質相互作用(dfPPI)プラットフォームを開発しました¹²。これは重要な生物学的洞察を活用しています:病態では、分子シャペロンのサブセットがエピシャペローム^13、14、15と呼ばれる超分子足場を形成します。これらの構造はタンパク質の折り畳みには作用しませんが、代わりにタンパク質の接続を再編成する足場相互作用ハブとして機能します³。重要なのは、エピシャペロームに隔離されたタンパク質はランダムではないということです。それらは、病気の表現型^{16、17、18、19、20}の維持に積極的に関与している人々です。dfPPIは、これらのエピシャペローム結合タンパク質とその相互作用因子を捕捉することにより、特定の疾患状態を引き起こす正確なネットワーク変化を特定します。エピシャペローム主導のネットワーク再配線は疾患全体に普及しており、アルツハイマー病コホートでは大部分、がん検体では~70%が^16,20であり、疾患に焦点を当てた大規模な研究へのdfPPIの適用性を裏付けています。

dfPPIプラットフォームは、サンプル調製、エピシャペロームアフィニティーキャプチャー、MSによるインターラクトーム同定から、経路濃縮や機能的タンパク質ネットワークモデリングなどのダウンストリームバイオインフォマティクス解析まで、ワークフロー全体を網羅しています(図1)。この方法は、アフィニティーマトリックス(PUビーズまたは他のプローブ)^13、16、17に固定化されたエピシャペローム特異的化学プローブを利用して、細胞または組織から機能的相互作用を単離します。これらのプローブは、エピシャペロームへの特異性とdfPPIへの適合性について、すでに複数の出版物で厳密に検証されています16,17,18,20,21,22。捕捉された複合体は、オンビーズとインゲルの両方の消化ワークフローを使用して MS にかけられ、続いてラベルフリーの LC-MS/MS が行われます。得られたデータは、相互作用レベルの機能不全を定義し、それを生物学的プロセスや表現型に関連付ける専用のバイオインフォマティクス パイプラインを通じて分析できます。エピシャペロームはコンテキスト固有の相互作用トーム^17、18、20を足場にするため、dfPPIは、特定の疾患、細胞型、または段階でタンパク質ネットワークがどのようにリモデリングされるかを明らかにし、精密な表現型解析のための強力なシステム生物学ツールとなっています。

この方法は拡張性が高く、がんや神経変性などのさまざまな疾患にわたって、死後のヒト組織や培養細胞を含む何百もの臨床および実験サンプルに適用されています^{16、17、18、19、20、22、23}.病理学的状態を定義するPPIの変化を明らかにすることにより、dfPPIは、メカニズムの洞察と実用的な治療標的^{16、17、18、19、20、22、23}の発見の両方を可能にします。

このプロトコルでは、エピシャペローム結合インタラクトームのアフィニティーキャプチャーから、LC-MS/MSのサンプル調製、MSによるインタラクトーム同定まで、dfPPIプラットフォームの実験コンポーネントを詳細に説明します。計算分析パイプライン、つまり、異なる相互作用と機能的影響を定義するためにMSによって同定されたタンパク質のリストで何が行われるかは、スペースの制限によりここでは説明しません。ただし、https://epichaperomics.mskcc.org の dfPPI Shiny アプリ (https://dfppi.mskcc.org に更新) および https://www.chiosislab.com/resources の Chiosis Lab Web サイトを通じて自由にアクセスでき、広範囲に文書化されています。これらのポータルに加えて、完全なバイオインフォマティクスパイプラインと付随するスクリプトは、dfPPIを癌^16、17、19 およびアルツハイマー病^18、20に適用するいくつかの出版物に含まれています。

プロトコル

このプロトコルは、当機関のヒト研究倫理委員会および動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っています。研究で使用された機器と試薬は、 材料表に記載されています。

1. アフィニティーキャプチャーのためのサンプル調製

1. 組織からのタンパク質抽出
   注:このプロトコルは、死後の脳組織サンプル用に最適化されています。
   1. 20 mM Tris(pH 7.5)、20 mM KCl、5 mM MgCl₂、および0.01%NP-40(天然溶解バッファー)を含むタンパク質抽出バッファーを調製します。使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を追加します。バッファーを氷の上に置いてください。
   2. 凍結組織(目標体積約50 mm³)を、乳棒が取り付けられた特殊な1.5 mLマイクロ遠心チューブで構成されるマイクロティッシュホモジナイザーチューブに入れます。500〜700 μLのネイティブ溶解バッファーを加え、組織のコンパクトさと均質化の容易さに基づいて容量を調整します。均質な懸濁液が形成されるまで、乳棒を上下に静かに動かし、ホモジナイザーチューブの研磨壁に対して、氷上でサンプルを均質化します。
      注:タンパク質アセンブリを本来の構成に維持し、タンパク質の分解を避けるために、氷上ですべての手順を実行します。
   3. バイアルを回転ユニットに置いて、ライセートを4°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション中にサンプルをローテーションして穏やかに混合します。
   4. 卓上遠心分離機を使用して、サンプルを13,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、破片を除去します。
   5. 上清を回収し、透明な1.5 mL微量遠心チューブに移します。移送中にペレットを乱さないでください。
   6. 製造元の指示に従って、ビシンコニン酸(BCA)アッセイキットを使用して上清中の総タンパク質濃度を測定します。
      注:タンパク質ライセートは、使用するまで-80°Cで保存できます。凍結融解サイクルを繰り返さないでください。繰り返される凍結融解サイクルと保管温度がタンパク質アセンブリの完全性に及ぼす影響については、以前の出版物²⁴ を参照してください。
2. サンプル正規化
   注:HSP90αおよびHSP90βは、エピシャペロームのコアコンポーネントであり、相互作用捕捉に使用される化学プローブの直接結合パートナーです13,21,23。HSP90α(またはHSP90β)に基づいてサンプルを正規化すると、プローブを標的にしたエピシャペロームの量がサンプル間で一致することが保証され、これは捕捉されたインタラクトームの正確な比較に不可欠です。サンプルは、ウェスタンブロットによって決定されたHSP90レベルに基づいて正規化できますが、他の方法を使用することもできます。HSP90レベルがサンプル間で同等である場合は、このセクションをスキップして、ステップ1.3に進みます。ここでのHSP90α/βブロッティングの使用は、入力正規化のみを目的としており、エピシャペローム存在量の尺度として解釈されるべきではありません。
   1. 4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20%グリセロール、10%2-メルカプトエタノール、0.02%ブロモフェノールブルー、および0.125 M Tris-HCl、pH ~6.8からなる2×Laemmliサンプルバッファーを調製します。
      注意: 2-メルカプトエタノールは有毒で揮発性であるため、ドラフト内で取り扱う必要があります。
   2. 5 μgの全脳タンパク質抽出物(ステップ1.1から)を1:1(v / v)と2×Laemmliサンプルバッファーを1.5 mLの透明な微量遠心チューブに入れます。
   3. サンプルを加熱ユニットで95°Cで3〜5分間加熱してタンパク質を変性させてから、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にロードします。
   4. サンプルをプレキャストされた8%トリス-グリシンプロテインゲルにロードします。または、ハンドキャストジェルを使用してください。
   5. 5 μLの染色済みタンパク質標準を各ゲルにロードし、たとえば最初のウェルにロードして、タンパク質の分子量を測定します。
   6. 1× TGS(Tris-Glycine-SDS)ランニングバッファーでゲルをRTで流星します。標準的な流時間は100 Vで1.5〜2時間です。
   7. 25 mM Tris、192 mM グリシン、および 20% メタノールを含む転写バッファーを調製します。
      注意: メタノールは可燃性であるため、安全ガイドラインに従って取り扱う必要があります。
   8. タンパク質を、定電圧(100 V)で4°Cの転写バッファー内のニトロセルロース膜に60分間転写します。
   9. メンブレン洗浄液(1× TBS-0.1%トゥイーン-20)とブロッキング液(1× TBS-0.1%トゥイーン-20中の5%ミルク)を調製します。このプロトコルは、市販の供給源からの粉末無脂肪粉乳を使用します。
   10. メンブレンを室温(RT)でブロッキング溶液に1時間置き、プラットフォームロッカー上で穏やかに攪拌します。ミニゲルあたり10 mLのブロッキング溶液を使用します。
   11. ブロッキング溶液を取り出し、メンブレンを抗HSP90α抗体(10 mLブロッキング溶液で1:6,000希釈)とともにプラットフォームロッカー上で4°Cで一晩インキュベートします。
   12. 抗体溶液を取り出し、メンブレンを10 mLの洗浄液でそれぞれ5分間3回洗浄します。
   13. HRP結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(10 mL 1×TBS-0.1%トゥイーン-20で1:5,000希釈)を加え、プラットフォームロッカー上でRTで1時間インキュベートします。
   14. 二次抗体を除去し、メンブレンを洗浄液で4回洗浄します(上記と同じ量とタイミング)。
   15. 製造元の指示に従って、強化化学発光(ECL)キットを使用してHSP90α特異的化学発光シグナルを検出します。化学発光イメージングシステムまたはオートラジオグラフィーフィルムを使用してください。
   16. シグナル強度に基づいてサンプル中のHSP90αレベルを定量し、下流プルダウンの正規化係数を計算します。
       注:HSP90シグナルの強度は、各サンプル中のプローブ標的エピシャペロームの量を反映しています。サンプル間のシグナル強度を比較し、すべてのゲルで実行される基準サンプルに正規化することにより、インタラクトームキャプチャームの入力ボリュームをそれに応じて調整できます。定量は、デンシトメトリーソフトウェアを使用して実行できます。ブロット間で正規化できるように、各ゲルに常に参照サンプルのアリコートを含めてください。
3. PUビーズの準備
   注:PUビーズおよびコントロールビーズは、以前に報告された^21,25のように社内で合成することも、材料移転契約(MTA)の締結時にキオシス研究所に要求することもできます。それらはイソプロパノールで-20°Cで保存する必要があります。
   1. ポリウレタン(PU)ビーズのアリコート、またはイソプロパノールストックから直接コントロールビーズを取ります。洗浄および取り扱い中のビーズの損失を考慮して、約 30% の過剰分を含めます。
   2. 保存溶媒を取り除きます:ビーズを沈殿させてから、イソプロパノールを吸引します。ネイティブ溶解バッファー(1.5 mLチューブの場合は1 mL、15 mLコニカルの場合は5 mL)を加え、穏やかなピペッティングまたは反転によって完全に再懸濁します。
   3. 洗浄して平衡化する3回:洗浄ごとにボルテックスして再懸濁し、遠心分離(1.5 mLチューブ:10,000 × g、1分、15 mLコニカル:3,000 × g、5分)、ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットチップを取り付けた真空ラインで上清を吸引します。
   4. 洗浄したビーズに天然溶解バッファーを1:1の体積比(ビーズ:バッファー)で添加して、均一な作業ビーズスラリーを生成します。
   5. サンプルあたり40 μLのPUビーズ(またはコントロールビーズ)スラリー(例:1:1 v/vビーズ:バッファー)を1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。ビーズの分注を容易にするために、端を切り取ったピペットチップを使用してください。
      注:PUビーズは光に敏感です。プルダウンステップでは、濃い色またはホイルで包まれた1.5mLチューブを使用します。PUビーズは、小分子エピシャペロームバインダーで疎水性の表面コーティングを施しているため、固まり、プラスチック表面に付着する傾向があります。穏やかにピペットを出し、均一な再懸濁を確保するために完全に混合します。タンパク質捕捉のばらつきを避けるために、各サンプルに同量のビーズスラリーを分注することが重要です。
   6. 各チューブに1 mLのバッファーを加え、ボルテックスし、10,000 × g で1分間遠心分離し、吸引によって上清を廃棄することにより、ビーズを天然溶解バッファーで3回洗浄します。各洗浄の間にビーズが完全に再懸濁されていることを確認してください。
      注意: 吸引するときは、ビーズに触れないようにしてください。液体を取り除きながら、ピペットチップをチューブの壁にそっと押し付けます。
   7. 最終洗浄後、ビーズペレットを乱さないように注意しながら、チューブからほとんどの液体を取り除きます。
      注:洗浄したビーズは、4°Cで数日間保存できます。通常、ビーズは調製後1〜2日以内に使用されます。
4. インタラクトームプルダウン
   注:プルダウンの最初のステップは、エピシャペロームに結合しない不活性小分子に結合したコントロールビーズを使用したプレクリアリングステップです¹⁶。このステップにより、非特異的に相互作用するタンパク質、凝集体、および不溶性破片がライセートから除去され、それによってその後のPUビーズプルダウンの特異性が向上します。プレクリアリングはバックグラウンド結合を減らし、特定のエピシャペローム関連タンパク質の検出を強化します。
   このプロトコルによって回収されたインタラクトームは、実験汚染物質に対して非常に敏感なMSによって分析されます。正確なタンパク質同定を確保し、データ品質を維持するには、サンプル、消耗品、または機器を取り扱うときは、常に新しく調製されたバッファーと試薬を使用し、ほこりやケラチンへの曝露を最小限に抑え、清潔で粉末を含まない手袋を着用してください。プルダウンおよびゲル内消化のすべてのステップにはMS専用のガラス器具/消耗品を使用し、ウェスタンブロッティングに使用するアイテムは物理的に分離して保管してください。ガラス器具を再利用する場合は、100%メタノール、超純水、80%酢酸、超純水で順次すすぎ、自然乾燥させて除染してください。洗剤は使用しないでください。微量の残留物でも、LCカラムやイオン源を汚す可能性があります。
   1. 正規化されたタンパク質抽出物(ステップ1.2に従って、HSP90ブロット強度に基づいて計算)を、40 μLのコントロールビーズスラリー(すなわち、20 μLビーズ+ 20 μLバッファー)を含む個々の1.5 mLマイクロ遠心チューブに加え、適切な容量のネイティブ溶解バッファーを追加して最終容量を250 μLに調整します。
      注:サンプル固有の投入量を決定するには、式A1 = (60 / C1)×X1を使用します。ここで、A1は添加する正規化された総タンパク質の量(μL)、C1は測定されたタンパク質濃度(μg/μL)、X1はHSP90ブロッティングから導き出される正規化係数です(ステップ1.2で説明)。追加する追加のバッファーの量は、250 μLからA1を引いたものとして計算されます。正規化が必要ない場合は、250 μLに250 μgの総タンパク質を使用します。
   2. サンプルを4°Cで30分間インキュベートし、エンドオーバーエンドローテーター(10〜15 rpm)で回転させます。
   3. チューブを10,000 × g で4°Cで1分間遠心分離し、凝集または不溶性タンパク質とともにコントロールビーズをペレット化します。
   4. 1 mLピペットを使用してコントロールビーズから上清を注意深く収集し、40 μLの洗浄されたPUビーズスラリーを含む1.5 mLチューブに移します。
   5. サンプルを4°Cで3時間インキュベートし、エンドオーバーエンドローテーター(10〜15 rpm)で回転させます。
   6. 各チューブを10,000 × g で1分間遠心分離し、上清を吸引し、ビーズを1 mLのネイティブ溶解バッファーで4回洗浄します。各洗浄について:ステップ1.3で説明したパラメータを使用して、ボルテックス、遠心分離機、および吸引します。
      注:この段階では、(1)SDS-PAGEとそれに続くゲル内消化、または(2)捕捉されたタンパク質のビーズ上消化のいずれかを使用して、サンプルをLC-MS/MSで処理できます。
      ゲル内消化ワークフローでは、書かれているプロトコルを続行します。ビーズ上の消化のために、ビーズを冷たいPBSでさらに2回洗浄し、すぐにセクション3に進みます。ビーズ上の消化を進める場合は、ビーズを凍結しないでください。サンプルは同日に新鮮に処理する必要があります。ビーズ結合タンパク質複合体を凍結すると、タンパク質の溶解度の凝集または損失が促進され、ペプチド回収率が低下し、変動性が増加するため、消化効率が損なわれる可能性があります。MSコアの推奨事項に基づいて、ビーズ上で一貫した消化を確保するために、サンプルは同じ日に新鮮に処理する必要があります。
5. ゲル内消化のためのサンプル前処理
   1. ステップ1.4.6で調製したビーズサンプルに25 μLの2×Laemmliサンプルバッファーを加え、1.5 mL微量遠心チューブに収めます。
      注:この時点でのサンプルは、-80°Cで最大24時間保存できます。プロテオームの被覆率を最大化し、インタラクトームを完全に表現するために、常にサンプル量全体を SDS-PAGE ゲルにロードしてゲル内消化を行います。部分的な読み込みは推奨されません。サンプル量が限られており、部分的なローディングが避けられない場合は、凍結融解サイクルを最小限に抑え、相互作用の完全性を維持するために、残りの材料をアリコートで保管する必要があります。
   2. 各サンプルを95°Cで3分間加熱し(上記のように2×Laemmliサンプルバッファーを添加して)、タンパク質複合体を変性させ、SDS-PAGEにロードする前にビーズから溶出します。バッファー中のSDSと還元剤はPPIを破壊し、マトリックスからタンパク質を放出します。
   3. 各チューブを10,000 × g でRTで1分間遠心分離します。
   4. 各上清を4〜20%プレキャストグラジエントSDS-PAGEゲルにロードします。
   5. RTで1× TGSランニングバッファーでゲルを流し、途中でランを停止します(100 Vでゲルに~3.5〜4 cm、通常30〜60分のランタイム)。
   6. 電気泳動ユニットからゲルを取り出し、メーカーの指示に従ってクマシーブリリアントブルーで染色します。
      注:プラスチック容器内の5〜7 mLの超純水に浸した染色ゲルは、タンパク質同定のためにMS施設に輸送できます。すぐに処理しない場合は、超純水で4°Cで最大1〜2週間保存してください。作業と実験目標を実行したコア施設に応じて、2つの代替プロテオミクスワークフローが使用されました。セクション2では、ゲル内消化とそれに続く四重極オービトラップ質量分析計を使用したデータ非依存取り込み(DIA)-MS分析について説明します。セクション3では、並列蓄積-連続フラグメンテーション(diaPASEF)²⁶によるトラップイオン移動度分析用に最適化されたオンビーズ消化プロトコルについて詳しく説明します。必要に応じて、ステップを相互参照できます。

2. ゲル内タンパク質消化によるLC-MS/MSによるタンパク質同定

1. システイニル化タンパク質のゲル内還元とアルキル化
   1. 各クーマシー染色ゲルレーンの染色領域を切除し、約5つの同じサイズのゲルスライスに切断します。温度制御されたマイクロチューブシェーカーで700 rpmで撹拌しながら、500 μLの50%(v / v)メタノール中で37°Cで1分間インキュベートして、各スライスを染色します。
      注:各ゲルスライスは、後続のステップでの試薬の効率的な拡散と、ゲル内トリプシンの効率的な一晩の消化を保証するために、~1 cm×0.5 cm×1 cm以下でなければなりません。化学プローブの直接結合剤およびエピシャペローム^15、16、23のコア成分を表すHSP90およびHSC70などの高度に染色されたタンパク質に対応するゲル領域を、ゲルの残りの部分とは別に切除します。それらの存在量が高いと、LC-MS/MS分析中の存在量の少ない相互作用物の検出と定量が妨げられる可能性があります。
   2. 各ゲルスライスを、30%アセトニトリル(ACN)で調製した5 mM重炭酸アンモニウム(ABC)500 μLで37°Cでインキュベートし、温度制御されたマイクロチューブシェーカーで700 rpmで15分間振とうして残留汚れを除去します。ゲルスライスが完全に脱色するまでインキュベーションを繰り返します。
      注:目に見えるタンパク質染色が残っていると、ペプチドクリーンアップステップ中にペプチドのC18マトリックスへの結合が妨げられ、回収率と下流のMS感度が低下する可能性があります。
   3. ゲル片を紛失しないように注意しながら、先端の細いピペットを使用してABC/ACN溶液を取り出して廃棄します(つまり、液体と一緒にゲル片を吸引しないでください)。次に、各チューブに 500 μL の 100% ACN を加え、ゲル片が完全に水没していることを確認します。オービタルシェーカー上で700rpmのRTで10分間、またはゲル片が半透明になり、サイズが縮小し、白い紙の外観になるまでインキュベートします。
      注意: ACNは可燃性であるため、ヒュームフードで取り扱う必要があります。
   4. ゲル片を吸引しないように注意しながら、先端の細いピペットを使用して各チューブからACNを取り出して廃棄します。1,000 × g で 10 秒間短時間遠心分離して残留液体を収集し、先端の細いピペットで残りの液滴を慎重に吸引します。開いたチューブをRTの真空遠心分離機に10〜15分間、またはゲルスライスが乾燥して硬くなるまで置きます。
      注意: 過度に乾燥させないでください。ゲル片のひび割れや過剰収縮を避けるために、定期的にチェックしてください。乾燥したら、ゲル片を密閉された低結合チューブまたは微量遠心チューブに消化するまで4°Cで保存します。ゲル結合および精製されたタンパク質は、4°Cに保持すると数日間安定です。
   5. 還元:~100 μLの10 mMジチオスレイトール(DTT)(500 mMストックから50 mM重炭酸アンモニウムで新鮮に調製)を各サンプルチューブに加え、ゲル片が完全に水没するようにします。温度制御されたマイクロチューブシェーカー上で700 rpmで撹拌しながら、56°Cで45分間インキュベートします。
      注意: DTT は皮膚および呼吸器の刺激物です。化学ヒュームフード内で取り扱い、手袋を着用してください。
      注:蒸発を防ぎ、DTT濃度を維持するために、インキュベーション中はチューブがしっかりと閉じられていることを確認してください。
   6. アルキル化:ゲル片を乱さないように注意しながら、先端の細いピペットを使用して各チューブからDTT溶液を取り除きます。50 mM ABCに~100 μLの55 mMヨードアセトアミド(IAA)を直ちに加え、ゲルスライスを完全に覆います。暗所で700 rpmで30分間攪拌しながらRTでインキュベートします。
      注意: IAA は有毒で光に敏感です。手袋を着用したまま、ヒュームフード内ですべての取り扱いを行ってください。
      注:アルキル化反応の急冷を避けるために、IAAを添加する前にDTTを完全に除去してください。IAAの劣化を最小限に抑えるために、インキュベーション中はチューブをアルミホイルで包むか、遮光容器を使用してください。
   7. チューブを1,000 × g でRTで5秒間短時間遠心分離し、底部に残留液体を回収します。ゲル片を乱さないように、細口径ピペットチップ(P10チップなど)を使用して上清を慎重に除去します。チューブを少し傾けて端から吸引し、ゲル片を吸引するリスクを最小限に抑えます。
   8. 平衡化:ゲル片を500 μLの50 mM ABCで30%ACNで覆います。RTで10分間インキュベートし、加熱されたオービタルシェーカーで700rpmで撹拌します。このステップは、過剰なアルキル化試薬を除去し、脱水前にゲルを平衡化するのに役立ちます。
   9. 溶液の除去:1,000 × g で5秒間短時間回転させ、上記のように先端の細いピペットを使用して上清を廃棄します。
   10. 再度脱水する:ステップ2.1.3と2.1.4を繰り返して、100%ACNを使用してゲル片を再脱水し、乾燥するまで真空遠心分離します。このステップにより、酵素消化中の最適なペプチド回収が保証されます。
2. ゲル内タンパク質分解とペプチドクリーンアップ
   1. 乾燥ゲルサンプルを50 mM ABCに最終濃度5 ng / μLのMSグレードトリプシンを加えて消化し、ゲル片を完全に再水和します(通常、総容量50〜100 μL、またはゲルスライスを覆うのに十分な量)。1.5 mLの微量遠心チューブで37°Cで一晩インキュベートし、蒸発を防ぐためにチューブがしっかりと密閉されていることを確認します。可能であれば穏やかに撹拌します(例:温度制御されたマイクロチューブシェーカーで300rpm)。
   2. 10%ギ酸(FA)を滴下して1%(v/v)の最終濃度を達成することにより、一晩消化した後、サンプルを酸性化します(たとえば、100 μLの消化物に1 μLの10%FAを加えます)。穏やかに混合し、RTウォーターバス超音波処理器でチューブを10分間超音波処理して、ペプチド抽出を促進します。
   3. ペプチド含有上清を細い先端ピペット(P10狭口径チップなど)を使用して慎重に除去し、ゲルマトリックスを乱したり、ゲル断片を吸引したりしないように注意します。採取した上清を低結合の500 μLチューブに移し、氷の上に置きます。
   4. 各チューブに5%FA/50%ACN(v/v)溶液(通常~50〜100 μL、またはゲル片を完全に覆うのに十分な量)を加え、室温で穏やかに撹拌します(たとえば、70 rpmのシェーカーで10〜15分間)、残留ペプチドを抽出します。上清を注意深く収集し、ステップ2.2.3の元のペプチド溶液と混合します。
   5. 結合したペプチド抽出物を、RTで真空遠心分離を使用して濃縮します(たとえば、1,000 × g で~30分間)、小さな液滴だけが残るまで。チューブ壁への付着によりペプチドが失われる可能性があるため、サンプルを完全に乾燥させないでください。部分的に乾燥した抽出物は、脱塩のためにすぐに使用するか、密閉された低結合チューブに-20°Cで保存します。
   6. 前述のように、200 μLピペットチップに2つの積み重ねられたC18抽出ディスクを挿入して調製した、手作業で梱包された小規模のC18充填ピペットチップ(すなわち、StageTips)を使用してペプチドを脱塩します(²⁷)、次の変更を加えます。
   7. 40 μLのメタノールを加えてC18ディスクを活性化します。卓上遠心分離機を使用して、ディスクを含むピペットチップ(空の200 μLピペットチップに挿入され、500 μLチューブ内に入れる)を1,500 × gで3分間遠心分離します。
      メモ: すべての手順で、C18 ディスクを乾燥させないでください。乾燥すると、ペプチドの結合と溶出が妨げられます。手で梱包された小型C18パックピペットチップを保持する外側の200 μLピペットチップ(スリーブ)は、2チップインチューブアセンブリが遠心分離機に適切に収まるように、端から~1 cmカットして短くする必要がある場合があります。
   8. 0.1%FAを加え、上記のように遠心分離してディスクを平衡化します。
   9. 20 μLの0.1%FAで再構成したペプチド溶液を、積み重ねたディスクの上部に直接塗布します。
   10. 1,500 × g で 5 分間遠心分離して、C18 ディスクへのペプチド結合を促進します。
   11. 40 μLの0.1%FAをカラムに通して、結合したペプチドを洗浄します。
   12. 0.1% FAを含む40 μLの70%ACNでペプチドを溶出します。溶出したペプチドを、LC-MS/MS分析まで-80°Cの低結合チューブに保存します。凍結融解サイクルを繰り返さないでください。
3. DIAを用いたMS分析と結合したNano-LC
   1. 真空遠心分離(例えば、RTで20〜30分、1,000× g)を使用して脱塩ペプチド溶出液を濃縮し、小さな液滴を残します。ペプチドを 10 μL の 0.1% FA の LC-MS グレードの水中で、穏やかに短時間ボルテックスして上下にピペッティングして再構成します。続行する前に、短時間回転させてチューブの底に液体を集めます。
   2. 再構成したペプチドサンプルの4 μLアリコートをナノLC-MS/MSで分析します。50°Cに維持された自己充填逆相カラム(内径75 μm × 2 cm、C18樹脂、粒子サイズ3 μm)でペプチドを分離します。 圧力爆弾²⁸ を使用して、C18樹脂のスラリー(メタノール中、1:3 v / v)を、10 μmのスプレーチップ(外径360 μm × 75 μm 内径×10 μmチップ)を内蔵した溶融シリカキャピラリーに充填することにより、カラムを調製します。ナノスプレーイオン化を介してカラムを高分解能ハイブリッド質量分析計(四重極 Orbitrap タイプ)に接続し、DIA ワークフローをサポートします。
      注:SDS-PAGEゲルスライスから生成されたペプチド混合物を最適に分離できるため、20 cmのカラム長をお勧めします。
   3. カラムオーブンまたは加熱ブロックを使用して分析カラムを50°Cに維持し、ペプチドの保持と分離を一貫させます。変動は再現性に影響を与える可能性があるため、実行全体を通じて安定した温度制御を確保します。
   4. 250 nL/分の流速で、0.1% FAで3〜40%ACNの線形グラジエントを110分間使用してペプチドを溶出します。このグラジエントにより、MS検出前に効果的なペプチド分離が可能になります。カラム平衡化を含む合計分析時間は120分です。
   5. 前述のように、高分解能MSを使用してDIAモードでデータを取り込みます²⁹。
      1. 300-1650 m/zのスキャン範囲で、プロファイルモードで120,000(m/z 200)の解像度で取得するフルMS1サーベイスキャンを設定します。スライディング分離ウィンドウスキームを使用して、30の連続した前駆体ウィンドウ(364-1370 Th)のMS2フラグメンテーションで各MS1スキャンに続きます。
      2. 25.5、27.0、および 30.0 の段階的正規化衝突エネルギーを使用してフラグメンテーションを実行します。デフォルトの最大前駆体充電状態は 4 です。MS/MSスキャンの固定最初の質量を200 Daに設定し、30,000の分解能でMS2スペクトルを取得します。
      3. MS2 には自動注入時間設定を使用し、MS1 には最大注入時間 60 ミリ秒を使用します。MS1とMS2の両方のスキャンで、イオンターゲット(AGC)を3e6に設定します。
4. アフィニティー捕捉インタラクトームの相対定量化
   注:アフィニティーで捕捉されたエピシャペロームインタラクトームのDIA-MS分析で同定されたタンパク質を定量するには、DIAワークフローをサポートし、ペプチド強度またはスペクトル数に基づいて信頼性の高い定量を提供するソフトウェアプラットフォームを使用します。このプロトコルでは、ペプチド/タンパク質の同定とラベルフリーの強度ベースの定量に、MaxQuant(バージョン2.5.1.0など)とそのMaxDIA^{ワークフロー20,29}を使用しました。検索では、PSM/ペプチドおよびタンパク質レベルで1%FDRを使用した逆配列のおとり戦略を使用しました。「逆」および「潜在的な汚染物質」のエントリは、バイオインフォマティクスの前にフィルタリングされました。スパイクインは使用されませんでした。機器の準備は、内部 ID および RT 安定性基準を満たす 250 ng の HeLa 消化物 (および断続的な 10 fmol 6 タンパク質ミックス) で検証されました。
   1. すべてのサンプルで一貫したパラメーターを使用して生のDIA-MSデータを分析します。最大2つの欠落した切断を含め、次のように修飾を設定します:システインの固定、カルバミドメチル化。可変、メチオニンの酸化、およびタンパク質N末端のアセチル化。
   2. UniProtヒトタンパク質データベース(~20,000エントリなど)に基づく インシリコ予測スペクトルライブラリを使用し、正確な誤発見率(FDR)推定のためにおとりと汚染物質の配列が含まれていることを確認します。代替酵素を使用しない限り、トリプシン消化を指定します。検証済みのヒトスペクトルライブラリ(2020年6月18日UniProtリリース、20,956エントリに基づく)は、マックスプランク生化学研究所リポジトリ³⁰から入手できます。
      注:予測ライブラリを使用したこのワークフローの代替として、ステップ3.4は、これらのデータセットで同等の同定と定量を生成したライブラリフリー処理を示しています。
   3. タンパク質の存在量は、下流のPPIネットワーク分析により適しているため、強度値(ラベルフリー定量[LFQ]強度ではない)を使用して定量します。アフィニティー・エンリッチメント・データを歪める可能性のある正規化アーティファクトを回避するために、LFQ の選択が解除されていることを確認してください。代わりに、全体的なタンパク質発現ではなく相互作用の強さを反映するペプチドスペクトル一致から導き出された生の強度値を使用します。適切なフィルタリング基準(タンパク質グループごとに少なくとも1つの固有のペプチド)を適用して、タンパク質の同定と定量の信頼性を向上させます。結果のタンパク質強度表をエクスポートして、その後の統計分析やネットワークベースの分析に使用します。
      注:LFQ値が全ライセートにわたるタンパク質ローディングの正規化に役立つ標準的なプロテオミクスワークフローとは異なり、ここではタンパク質はエピシャペロームのアフィニティーキャプチャによって濃縮されます。この濃縮ステップでは、LFQ 正規化によって不明瞭になる可能性のある生物学的分散が導入されます。したがって、生の強度値は、条件全体でのタンパク質とエピシャペロームの相互作用の違いをよりよく反映し、下流のネットワークレベル(dfPPIなど)分析に必要なシグナルを保持するため、好ましいです。マスコットベースの検索を使用した以前の研究^{では、強度の}代わりにMS / MSスペクトルカウント値も使用されました。このようなアフィニティーキャプチャーワークフローでは、スペクトルカウントは相互作用頻度を反映しており、条件間で異なる相互作用タンパク質を同定するのに適しています。LFQ 値とは異なり、MS/MS カウントはプロテオーム全体の全体的な正規化を想定しておらず、エピシャペローム濃縮ステップからの生物学的に意味のある分散が保持されます。

3. オンビーズタンパク質消化によるLC-MS/MSによるタンパク質同定

1. オンビーズ消化
   注:MS分析のためのオンビーズタンパク質消化中の最適なタンパク質回収を確保し、サンプル損失を最小限に抑えるには、低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを使用することが不可欠です。これらのチューブは、チューブ壁へのタンパク質の吸収を減らし、それによってサンプルの回収率を高めるように設計されています。このセクションで使用されるすべての試薬は、LC-MSグレードの水と化学薬品を使用して新たに調製する必要があります。プロテオミクスコアにサンプルを提出する場合は、施設によっては使用前にすべてのバッファーをフィルター滅菌する必要がある場合があるため、地域のポリシーを確認してください。
   1. ステップ1.4.6からチューブ内に残っている可能性のある残留PBSをすべて取り除きます。ビーズを80 μLの2 M尿素に再懸濁し、50 mM ABC、pH 8.5で新たに調製します。ピペッティングまたは短時間のボルテックスにより、完全な混合を確保します。
      注: ビードの量と種類に基づいて比例して体積を調整します。このプロトコルは、40 μLのPUビーズスラリー用に最適化されています。
   2. DTTを加えて、最終濃度1 mMにします。
      注:DTTは溶液中で酸化しやすいため、使用直前にLC-MSグレードの水中で1 M DTTストック溶液から新しい10 mM DTT溶液を調製してください。必要な量をサンプルに直接加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
   3. チューブにキャップをかぶせ、加熱されたオービタルシェーカーで1,100 rpmで振とうしながら、37°Cで30分間インキュベートします。蒸発を最小限に抑えるために蓋をしっかりと密閉してください。
   4. IAAを加えて、最終濃度3.67 mMにします。暗所で RT で 45 分間、1,100 rpm で振とうしながらインキュベートします。
      注:使用直前に、LC-MSグレードの水で新鮮な10 mM IAAストックを調製してください。必要な量をサンプルに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
   5. DTTを追加して未反応のIAAを急冷し、最終濃度3.67 mMを達成します。ピペッティングで穏やかに混合します。
      注:未反応のIAAをクエンチすると、プロテアーゼ活性と消化効率を損なう可能性のある過剰アルキル化が防止されます。DTTを新鮮に調製し、現在のサンプル量に基づいて量を計算して、目標濃度を達成します。
   6. 750 ngの0.5 mg/mLのMSグレードのLys-Cプロテアーゼをサンプルに加えます。37°Cで1時間インキュベートし、1,150rpmで振とうします。
      注:LC-MSグレードの水に溶解してLys-Cを調製します。酵素アリコートは-80°Cで保存し、複数回の凍結融解を避けてください。
   7. 調製したばかりの0.5 mg/mLのシーケンシンググレードのトリプシンを750 ng加えます。37°Cで1,150rpmで振とうしながら一晩インキュベートします。過剰消化とペプチド分解を防ぐために、16〜18時間以内にインキュベートします。
   8. 翌日、サンプルを1,000〜5,000 × g でRTで1〜5分間遠心分離し、新鮮な1.5 mLマイクロ遠心チューブにピペッティングして上清を移します。ビーズを捨てます。
   9. 50%トリフルオロ酢酸(TFA)を滴下して、消化物のpHを3未満に調整します。pHインジケーターストリップを使用してpHを確認します。
      注:典型的なpH範囲は~2.5〜3.0で、脱塩前にサンプルを酸性化する必要があります。
      注意:TFAは腐食性で揮発性です。ドラフトを追加し、適切な個人用保護具 (PPE) を着用してください。
2. ペプチド脱塩
   注:ペプチドの脱塩とクリーンアップには、小規模なC18パックピペットチップ(StageTipsなど)を使用してください³¹.C18材料の3層(C18固相抽出ディスクなど)を200 μLのピペットチップに充填して、C18 StageTipsを調製します。既製の市販のC18スピンカラムも使用できます。コンディショニング、サンプルローディング、ペプチド溶出については、メーカーのプロトコルに従ってください。性能(保持効率、回収率など)は、自家製デバイスと市販デバイスで異なる場合があります。小規模なC18パックピペットチップは、バイパスフローを避けるためにしっかりと梱包する必要があります。
   1. 小規模のC18充填ピペットチップを、(1)100 μLメタノールで順番に調整します。400 × g で遠心分離し、フロースルーを廃棄します。(2) 100 μL の 70% ACN/0.1% TFA。400 × g で遠心分離し、フロースルーを廃棄します。(3) 100 μL の 0.1% TFA。400 × g で遠心分離し、フロースルーを廃棄します。この手順を 2 回繰り返します。
      注:コンディショニングにより、疎水性C18樹脂が完全に濡れます。既製の市販のC18スピンカラムには、真空マニホールドも使用できます。ユーザーは、具体的な取り扱いの推奨事項について製造元の説明書を参照する必要があります。
   2. 酸性化ペプチド消化物を、サンプルをチップに直接ゆっくりとピペッティングして、コンディショニングされた小規模のC18充填ピペットチップにロードします。300 × g で遠心分離して、消化物が樹脂を通過できるようにし、フロースルーを廃棄します。サンプル量が容量を超える場合は、複数ラウンドに分けてロードします。
      注:気泡を避けて、消化物を充填した樹脂ベッドに直接ピペットで留めます。低保持チップを使用する場合は、小型のC18パックピペットチップの内壁に触れて、液体をゆっくりと均一に放出します。
   3. 100 μL の 0.1% FA を小規模の C18 充填ピペットチップに直接ピペットで入れ、溶液が C18 材料を完全に飽和させます。400 × g で遠心分離し、フロースルーを廃棄します。この手順を2回繰り返して、塩分と干渉物質を除去します。
      注意: 各スピンの前に、液体がC18材料を完全に流れていることを確認してください。洗浄液をピペットチップの壁に沿ってゆっくりと分配して、気泡を閉じ込めないようにします。
   4. 50 μLの70%ACN/0.1%FAを小規模のC18充填ピペットチップにピペッティングして、結合ペプチドを溶出します。300 × g で遠心分離し、溶出液を清潔な低結合マイクロ遠心チューブに集めます。このステップを2回繰り返して、完全に溶出します。
      注:溶出液を完全に回収するには、複数回の遠心分離が必要になる場合があります。残留液体がチップベースに閉じ込められたままの場合は、C18パックの小さなピペットチップを軽くたたくか、さらに短時間スピンして残りの量を収集します。溶出液を結合し、最終的な量を確認してから続行します。
   5. 溶出したペプチドを真空濃縮器を使用して乾燥するまで凍結し、乾燥させます。通気できるように蓋が緩く配置されていることを確認してくださいが、水しぶきは避けてください。
   6. 12 μLの0.1%FAをLC-MSグレードの水でチューブの底に直接加えて、乾燥ペプチドを再構成します。チューブを穏やかにボルテックスして超音波処理し、ペプチドを完全に溶解させます。
      注:ペレットまたは乾燥フィルム全体が完全に再構成されていることを確認してください。ピペットベースの溶解は、チップ表面への付着によるペプチドの損失のリスクがあります。
   7. 再構成されたペプチドを冷水で満たされたバスソニケーターで5分間超音波処理して、完全な溶解を確実にし、過熱を防ぎます。
   8. ペプチドを20,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。ペプチド上清を適切なオートサンプラーバイアルに移し、LC-MSシステムにロードします。少量、高品質のガスクロマトグラフィー(GC)テスト済みのポリプロピレンバイアルと、ボンドされたシリコーン/ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)セプタムキャップを使用して、サンプルの損失を最小限に抑えます。バイアルにサンプルIDと注入順序を明確にラベル付けします。
   9. 280 nmの分光光度計を使用してペプチド濃度を推定します。これは概算であり、芳香族残留物の含有量や汚染物質の影響を受ける可能性があることに注意してください。または、より正確な定量のために比色ペプチドアッセイを使用します。
3. LCおよびMSパラメータ
   注:以下のLCおよびMSパラメータは、現在のプロトコルで使用されている質量分析計と組み合わせたnano-LCシステム用に最適化されています。他のナノLCシステムや質量分析計では、それに応じてパラメータを調整する必要があります。
   1. (1)移動相 A:1 L の LC-MS グレードの水に 1 mL の LC-MS グレード FA を加え、(2) 移動相 B:1 L の LC-MS グレード ACN に 1 mL の LC-MS グレード FA を加えます。
      注:LC-MSグレードの溶媒と酸のみを使用してください。両方の相をきれいなガラス瓶に調製し、LC システムで必要に応じて脱気します。微生物の増殖や分解を避けるために、未使用の相は毎週廃棄してください。
   2. 長さ 25 cm、内径 75 μm の溶融シリカキャピラリーカラムに、1.7 μm の C18 逆相粒子を充填して取り付けます。
      注: 気泡の侵入や充填材の損傷を避けるために、カラムの取り扱いには注意してください。設置とカラムの平衡化については、製造元の指示に従ってください。
   3. 3% 移動相 B を使用して、流速を 50 nL/分から 300 nL/分に徐々に増やして、カラムをコンディショニングします。
      注:このステップにより、サンプル注入前に固定相が適切に濡れて平衡化されます。流量ランピング中のカラム圧力を監視します。突然の圧力スパイクは、気泡またはカラムの詰まりを示している可能性があります。ベースライン圧力が安定すると、平衡化は完了したと見なすことができます。
   4. 最適なクロマトグラフィー性能を確保するために、カラム温度を 50 °C に維持します。
   5. システム性能を評価するための品質管理(QC)標準として、HeLa細胞トリプシン消化物を100 ng注入します。
      注:このQC注入は、LC保持時間の一貫性、MS感度、および実行全体のプロテオームカバレッジを評価するためのベンチマークとして機能します。タンパク質同定数、保持時間の再現性、シグナル強度をリファレンスQCデータセットと比較し、実験サンプルを分析する前にシステムの準備状況を確認します。実験全体の再現性を高めるために、既知の濃度で調製された市販の HeLa 消化標準試料を使用します。
   6. 2% から 35% の移動相 B のグラジエント溶出を 300 nL/分の流速で 90 分間にわたって使用します。90分のグラジエントにより、複雑なプロテオームに適した高分解能のペプチド分離が可能になります。グラジエントに続いて、95% 移動相 B で 7 分間保持してカラムを洗浄します。
      注:次の注入前に再平衡化ステップ(例えば、2%Bに10〜15分間戻す)を含めて、実行全体でのカラムの再現性を確保します。保持時間の安定性とピーク形状に影響を与える可能性のある急激な勾配変化は避けてください。
   7. ナノフロー互換のエレクトロスプレーイオン化源(CaptiveSprayスタイルなど)を備えた質量分析計を使用してMS分析を実施します。
      注:CaptiveSprayイオン源は、低ナノフロー速度で安定したエレクトロスプレーを提供し、イオン化効率と感度を向上させます。代替質量分析計を使用するラボでは、それに応じて取得パラメータとイオン化パラメータを調整します。精度と分解能を維持するために、分析前に適切な調整と校正を確認してください。スプレーエミッターを適切に配置し、実行中のスプレーの安定性を監視して、信号のドロップアウトを防ぎます。
   8. データに依存しない取得 diaPASEF メソッド³² を利用します。diaPASEFに慣れていないユーザーの場合は、製造元の技術文書またはトラップイオンモビリティー分析(TIMS)-DIA^{ワークフロー33} を記述した最新のプロトコルを参照して、さまざまなサンプルタイプまたはグラジエント長を最適化してください。
      注:diaPASEFは、TIMSとDIAを組み合わせて、移動度^次元34で前駆体イオンとフラグメントイオンを整列させることにより、シーケンス速度と感度を向上させます。TIMSデバイスが適切に校正され、四重極と同期していることを確認して、イオン移動度や質量ウィンドウのずれを回避します。
   9. 以下の機器設定を使用します。(1)質量範囲:100〜1700 m / z;(2)イオン移動度範囲:0.60-1.60 V·s /cm²;(3)衝突エネルギー:20-59 eV、傾斜。(4)ランプ時間:100ミリ秒;(5)蓄積時間:100ミリ秒;(6)diaPASEFの質量範囲:400-1201 Da;(7)マスウィンドウ幅:26 Da、1 Daのオーバーラップ。(8)サイクルあたりの質量ステップ数:32;(9)サイクルタイム:~1.8秒
      メモ: これらの設定は、カバレッジの深さとスキャン速度のバランスをとるように最適化されています。サンプルの複雑さ、グラジエント長、LC-MS システムのパフォーマンスに応じて、わずかな調整(ウィンドウ幅やステップ数など)が必要になる場合があります。HeLa 消化物の 7,500 を超えるタンパク質の同定を達成することは、最適なシステム性能を示しています。識別の数は機器によって異なる場合があり、それに応じて評価する必要があります。
   10. 分析カラムの過負荷を防ぐために、注入ごとに300〜400 ngのペプチドサンプルをロードします。過負荷は、ピークの拡大、イオンの抑制、再現性の低下につながる可能性があります。分光光度計または比色ペプチドアッセイを使用して注入前にペプチド濃度を確認し、実行間のばらつきを回避します。
   11. キャリーオーバーを避けるために、サンプルグループ間でブランク注入を実行します。注入ブランクとして100%移動相A(0.1%FAを含む水)を使用します。これにより、カラムから残留ペプチドが洗い流され、分析間の汚染が減少します。ベースラインイオンとバックグラウンドイオンを監視して、適切な洗浄を確認します。
4. DIAデータ解析
   1. directDIA^{ワークフロー35} を使用したデータ解析と、DIAプロテオミクスデータのライブラリフリー処理をサポートする適切なソフトウェアを使用してください。UniProt FASTAデータベース³⁶に基づいて、標準検索パラメータとデフォルトの定量設定を使用して、タンパク質の同定と定量を実行します。
      注:酵素特異性、修飾設定、FDR閾値、および分析後の出力を含むすべてのパラメータは、 補足ファイル1に詳述されています。DIA-NN³⁷ などの代替DIA解析プラットフォームも、同様のワークフローと出力をサポートしている場合に使用できます。
   2. 前駆体、ペプチド、およびタンパク質基レベルで1%FDRに対応するq値カットオフを使用して、ライブラリフリーのdirectDIAを実行します。下流分析の前におとりの識別を除外します。
      注:iRT標準は追加されていません。性能は、事前定義された識別および保持時間安定性基準に対するHeLaダイジェストランでベンチマークされました。

結果

プロトコルの実行が成功すると、ユーザーはダウンストリームの dfPPI 分析に適した高品質の相互作用データセットを取得する必要があります。タンパク質の同定は、1% FDR(PSMおよびタンパク質レベル)のDIAデータから実行され、定量は生の強度またはMS/MSスペクトルカウント(LFQではない)を使用します。予想されるQCシグネチャには、PCAによる技術的複製の緊密なクラスタリング、約10〜12%の前駆体/タンパク質CVの中央値、複製ではなく生物学的起源によって駆動される階層的クラスタリング、およびg:Profiler/Reactomeでの堅牢な経路レベルの濃縮が含まれます。

使用前のPUビーズプローブの生成と活性の検証

PUビーズは、前述のように、エピシャペローム結合小分子類似体をNHS活性化アガロースにカップリングすることによって調製される²⁵。標準の 25 mL レジンパックでは、イソプロパノールに 1:1 のスラリーとして保存された ~25 mL の PU ビーズが得られます。低結合チューブにアリコートし、光から保護して-20°Cで保存します(例:アルミホイルで包む)。これらの条件下では、バッチは≥12か月間安定したままです。使用前に、イソプロパノールを除去し、ネイティブ結合バッファーでビーズを平衡化します(ステップ1.3)。各ロットは、合成時に認定され、その後は2つのアッセイを使用して定期的に認定されます(図2):(i)生物学的特異性-エピシャペローム高ライセート(MDA-MB-468など)およびエピシャペローム低ライセート(ASPC1など)を同一の条件下(総タンパク質250μgを含む40 μLビーズスラリー、4°Cで3時間、ネイティブ洗浄)、溶出/変性、およびHSP90のイムノブロット、 HSC70、およびHOP。受容性:エピシャペローム高サンプルでは強力な濃縮があり、低サンプルではシグナルが最小限に抑えられます。参照ロットに匹敵するバンド強度比(±20-30%)。(ii)PUビーズと一致した不活性コントロールビーズを使用したエピシャペローム高ライセートからのグローバルカーゴプロファイル実行パラレルキャプチャ、SDS-PAGEへの等しい溶出液量のロード、およびCoomassie染色。受け入れ:PUビーズは、コントロールビーズレーンで最小限のバックグラウンドで、豊富で高分子量の貨物を示します。25 mLのバッチは、サンプルあたり40 μLで~600回のキャプチャをサポートします。再洗浄/再平衡化後に特異性または貨物プロファイルが受け入れ範囲外になった場合は、大量に廃止します。

インゲルおよびオンビーズプロトコルの代表的な結果

エピシャペローム高MDA-MB-468細胞のパイロット直接比較では、インゲルおよびオンビーズのワークフローで、非常に一致したインタラクトームが生成されました:6,333のタンパク質のうち4,616(73%)がタンパク質グループレベルで共有され、1,275(20%)がインゲルでのみ検出され、442(7%)がオンビーズでのみ検出されました。経路レベルの一致はさらに高く、860のReactome用語のうち、727(85%)が一般的で、81(9%)がインゲルに固有で、52(6%)がオンビーズに固有でした。タンパク質強度の中央値は、ゲル溶出濃度と一致し、ゲル溶出濃度と一致し、インゲルの方がビーズ内よりも~3×高かったが、これは経路の一致に重大な影響を与えなかった。

コホートスケールの例とQCシグネチャ

一例として、12の生体サンプルを分析しました(図3)。4つのサンプルを溶出し、ゲル内消化によって処理しました。8つのサンプルは、エピシャペローム複合体のアフィニティー精製に続いて、オンビーズ消化とナノLC-MS/MSを技術的複製で行いました。予想されるQCシグネチャが観察されました:PCAによる技術的反復の緊密なクラスタリング、~10〜12%の前駆体/タンパク質CVの中央値、複製ではなく生物学的起源によって駆動される階層的クラスタリング、およびg:Profiler / Reactomeでの堅牢な経路レベルの濃縮。これらの結果は、ワークフローコンポーネント全体の再現性、エピシャペローム結合タンパク質の広範な検出、および経路レベルでの差動インタラクターの明確な機能解釈可能性を示しています。両方のワークフローから得られた経路濃縮は、いくつかの生化学的および機能的直交アッセイによって検証された、このラインの公開されたdfPPI出力と一致しました¹⁷。

投入物と消化の品質

代表的なクーマシー染色SDS-PAGEゲルは、ゲル内消化によって処理された4つのサンプルについて示されています(図3A)。このゲルは、再現性のあるタンパク質の捕捉とレーン全体にわたるバンディングの一貫した分布を示し、質量分析の前に天然ライセートからタンパク質複合体の濃縮に成功したことを確認しています。これらの変性したインタラクトームプロファイルは、アフィニティーキャプチャームステップが下流のMS分析に十分かつ一貫したタンパク質インプットをもたらすことを示しています。

捕捉されたインタラクトームは、分子量全体にわたって幅広いタンパク質カバレッジを示し、天然のライセートからのタンパク質アセンブリの濃縮の成功を反映しています。重要なのは、この回収は豊富なタンパク質に限定されず、存在量の少ない相互作用因子も含まれており、システムレベルの分析に必要な複雑さと深さを提供することです。

大規模な制御と特異性

このワークフローでは、コントロールビーズを事前クリアにのみ使用します(手順1.3および1.4を参照)。各生体試料に対して定期的な「不活性プローブ」比較キャプチャは行いません。大規模な臨床コホートの場合、不活性キャプチャは貴重な材料を消費しますが、下流の統計は単一のタンパク質のレベルではなくネットワーク/経路レベルで機能するため、dfPPIの解釈価値はほとんど追加されません。ランダムまたは樹脂粘着性の汚染物質は、同じ経路のメンバー間で協調的に現れないため、経路レベルの濃縮テストやコホートレベルの一貫性フィルターには耐えられません。実際には、特異性は、(i)プレクリアリング、(ii)タイトな複製再現性(PCA/CV)、および(iii)閾値とリサンプリングにわたる経路の安定性によって保証されます。歴史的に、不活性捕捉および可溶性競合物 (PU-H71) ブロック実験を評価し、かけがえのない臨床材料を消費しながら、dfPPI 経路の結果^16、17、21 を変化させないことを発見しました。したがって、パイロット検証のためにのみ予約しています。明示的な実行レベルチェックを好むグループの場合、どちらのオプションもプロトコルと互換性がありますが、コホートスケールのdfPPI分析には必要ではないことに注意してください。

複製数

dfPPIの経路推論はセットベースであり、固定された複製数を必要としません。堅牢な取り込みにより、条件ごとに1つのサンプルで探索的経路コールを得ることができます。確認分析には、培養細胞の条件ごとに≥3回の生物学的反復(可能な場合はLC-MS/MS注射を重複)、ヒト組織ではコホートに適したNs(≥通常、発見の場合はグループあたり5〜10回、共変量で層別化する場合はより大きくなる)を推奨します。反復クラスタリング(PCA)、前駆体CVの中央値(ターゲット~10-15%)、および濃縮結果のブートストラップ/リサンプリングによって安定性を評価します。

実行全体での技術的な再現性

技術的再現性は、ビーズ上消化サンプル(8つのマウス脳、2回実行)からのペプチド強度データの主成分分析(PCA)(図3B)を使用して評価されました。複製は生体サンプルごとに密にクラスター化され、異なるサンプルは最初の2つの主成分に沿ってきれいに分離されました。最初の2つの主成分は、それぞれ全分散の28.6%と22.0%を説明し、技術的なノイズではなく生物学的差異に従ってサンプルを分散しました。この構造は、高い分析の一貫性を反映しており、この方法が生物学的に関連する違いを保持していることを確認しており、これは dfPPI が条件固有のネットワーク再配線を検出できるようにするために重要です。

サンプル間の検出の一貫性

前駆体イオン強度の変動係数(CV)分布は、特徴の大部分が20%CVを下回り、中央値は条件全体で9.7%から11.9%の範囲であることを示しています(図3C)。これらの結果は、反復全体で一貫した MS 検出とペプチド回収率を裏付けています。

ダイナミックレンジとプロテオームカバレッジ

対数変換されたタンパク質存在量値の階層的クラスタリング(図3D)は、サンプルの強力な分離とサンプル間の変動の維持を示し、MSランでキャプチャされた広いダイナミックレンジも反映しています。タンパク質強度は、青から黄色の勾配で視覚化されたように、存在量の少ない相互作用因子から高度に濃縮されたタンパク質基まで多岐にわたります。このデータは、このプロトコルが多様なタンパク質アセンブリと相互作用体の検出を可能にし、コア成分と末梢成分の両方を捕捉できることを確認しています。

dfPPIによる機能解釈

解釈と再現性をサポートするために、dfPPIデータセット分析のための2つの補完的なリソースを提供しています:(i)インタラクティブなShiny Webアプリケーション(https://epichaperomics.mskcc.org/ https://dfppi.mskcc.org に更新)と(ii)以前のdfPPI研究でリリースされたオープンでスクリプト可能なワークフローとCytoscapeセッションファイル(GitHub / Zenodo)38,39,40,41.このアプリは、生の強度またはMS/MSスペクトルカウントテーブルを取り込み、品質管理(反復クラスタリング、欠損値チェック)、オプションのノイズ/バッチ処理(共変量回帰)を実行し、差次的に関与するタンパク質を識別し、インタラクティブなプロットとダウンロード可能なレポートを介して経路/ネットワークの読み出しを提供します。

dfPPIは、測定された強度またはスペクトル数を「エピシャペローム関与」の代理として扱います。ユーザーは、単純な両側 t 検定 (デフォルト) から共変量認識線形モデルまでの範囲の差分接続 (DC) モデルを選択します。DCステップもスキップできます。DC後、ユーザーは、候補を濃縮に渡すために、折り畳みとp値のしきい値(デフォルトは以前のdfPPI作業を反映しています、たとえば、FC > 1.0、公称p≤0.25)を設定します。ランクベースのGSEA(符号付き統計量)と、複数テスト補正を伴うg:Profilerによる過剰表現(超幾何学的)の2つのエンリッチメントエンジンが利用可能です。シャペロン中心のコンテキストでは、パイプラインは、シャペロン足場タンパク質の直接相互作用者が差次的に関与するタンパク質間で過剰に代表されているかどうかをテストするための相互作用エンリッチメント分析(iEA)も提供します。ネットワークビューは、効果サイズおよび/または統計的サポートによってノード/エッジを重み付けし、単一タンパク質効果ではなく、調整された再配線の視覚化を可能にします。スクリプト化されたワークフローを好むユーザーのために、ネットワークマップと図の構築に使用される基礎となるRコードとCytoscapeセッションファイル(例:GitHub/Zenodo)^{38、39、40、41} 、および関連する出版物^{17、18、19、20} が公開されており、ローカルで実行することも、新しいデータセットに適応させることもできます。

アフィニティー濃縮によって導入された相互作用状態シグナルを保持するために、許容カットオフ(倍数変化>1.0、公称p≤0.25)が推奨されます。次に、統計的制御を経路レベルに移行します:g:Profilerを使用して、候補タンパク質はキュレーションされたオントロジー(GO、Reactomeなど)全体で濃縮についてテストされ、複数のテストで調整された経路のp値によって有意性とランキングが決定されます。この設計は、単一タンパク質の差次発現ではなく、協調されたネットワークの再配線を検出するというdfPPIの目標を反映しており、プルダウンデータセットの濃縮シグナルを不明瞭にする可能性のあるプロテオーム全体の正規化を回避します。以前のdfPPI研究^17,20で示されているように、より寛大なタンパク質レベルの閾値は、安定した疾患関連の経路呼び出しをもたらしますが、他のモデル(例:経験的ベイズ収縮を伴う線形モデル)は、分散またはバッチ共変量がそれを保証する場合に使用できますコア経路中心の推論を変更することなく。

アフィニティー捕捉は必然的に「粘着性」タンパク質(ケラチン、細胞骨格タンパク質、リボソームタンパク質など)を共濃縮し、PUビーズは一般的なシャペロン相互作用器も捕捉する可能性があります。dfPPIでは、いくつかの理由から、これらは生物学を駆動しません。まず、事前洗浄と厳密な洗浄により、ほとんどの非特異的結合剤が除去されます。第二に、多くのシャペロン相互作用因子を含むジェネリックバインダーは、条件全体で1.0付近の倍数変化を示し、および/または一貫性のない検出を示し、FC / p値スクリーニングに失敗します。第三に、経路の濃縮はセットベースでバックグラウンドを認識しており、有意性は実験固有の検出されたプロテオームに対して計算され、共変するには同じ経路の複数のメンバーが必要です。ランダムまたは高存在量の汚染物質は多くの用語に分散しているため、首尾一着したFDR有意な濃縮を形成しません。単一のタンパク質(汚染物質など)は、経路呼び出しを「行う」ことはできません。第四に、dfPPIは単一のタンパク質ではなく、ネットワークレベルのコヒーレンスを解釈します。経路呼び出しは、複数のテスト補正(例:g:Profilerが調整したp値)、最小遺伝子セットサイズ、および複製の一貫性を生き残る必要があります。このフレームワークは、一致した不活性ビーズプリクリアーと共通汚染物質フィルタリングとともに、dfPPIをバックグラウンドに対して堅牢にします:何百もの非情報タンパク質が存在する場合でも、濃縮はタンパク質リストの全長ではなく、経路内の一致するタンパク質の数に依存するため、経路ランキングを変更しません。さらに、これまでに発表されたすべてのdfPPI研究は、広範な実験的検証(例えば、標的生化学、シグナル伝達の読み出し、遺伝的または薬理学的摂動)^{16、17、18、19、20}によって経路およびネットワークレベルの予測を裏付けており、dfPPI出力は単にノイズの多いタンパク質リストではなく、疾患関連のPPIネットワーク機能不全の再現可能なマップであることを示しています。

図3DのdfPPIデータセットによってキャプチャされた機能ランドスケープを評価するために、g:Profiler⁴²を使用してエンリッチメント分析を実行しました(図3E)。この結果は、遺伝子オントロジーの生物学的プロセス(GO-BP)、分子機能(GO-MF)、細胞成分(GO-CC)を含むすべての主要な機能オントロジー、およびReactome、KEGG、WikiPathwaysなどの厳選された経路リソースにわたる堅牢なアノテーションカバレッジを示しています。この代表的な分析は、dfPPIアプローチの重要な強み、つまり、比較的小さなサンプルサイズからでも、多様なアノテーションタイプにわたって生物学的に意味のある経路関連性を明らかにする能力を示しています。ここで観察された広範なReactomeカバレッジは、dfPPIが、Reactomeの構造によく表されている多成分プロセスおよびシグナル伝達カスケードに直接マッピングされるタンパク質ネットワークの相互作用レベルの変化キャプチャの再配線に基づいているという事実を反映している可能性があります。dfPPIは発現ではなく接続性の変化を利用するため、トランスクリプトミクスや存在量のみのプロテオミクスでは見逃される可能性のあるシステムレベルの機能シフトを検出するのに特に適しています。この発見は、ReactomeがdfPPI由来のタンパク質セット^{14、15、16、17、18、20、21}から最も一貫性のある疾患関連濃縮を一貫して得出した他の研究と一致しています。

リアクトームは、マルチタンパク質プロセスと複合体(シグナル伝達カスケード、細胞周期モジュール、代謝アセンブリ)を中心に構成されています。dfPPIは、エピシャペロームに関与する相互作用因子、つまり、機能的に疾患足場に共動員されるタンパク質のグループを濃縮するため、その出力には、孤立したヒットではなく、凝集性のある経路モジュールが自然に含まれています。この調整されたキャプチャにより、関連するサブパスと階層全体にわたって、広範で重要性の高いReactomeカバレッジが得られます。対照的に、存在量中心のオミクス(トランスクリプトミクス、グローバルプロテオミクス)は、相互作用状態ではなく、発現の変化を報告します。シングルベイト AP-MS または近接ラベルは、一度に 1 つの設計された餌の周囲に地元の近隣を提供します。架橋/共分画は、多くの場合、まばらな接続性を提供します。これらのいずれも、単独では、dfPPIが細胞または組織での単一の内因性捕捉から返されるコンテキスト選択されたシステムレベルのセットを日常的に生成することはありません。その結果、広範で(複数のリアクトーム分岐が点灯する)、機械的にコヒーレント(タンパク質は、単にその量ではなく、相互作用がエピシャペロームによって再配線されるため、タンパク質が一緒にシフトする)の両方の経路濃縮が得られます。ただし、dfPPIは補完的なものであり、代替ではなく、各インタラクトミクス手法には明確な長所と限界があり、最適な選択(または組み合わせ)は、生物学的問題、サンプルの制約、および必要な解像度によって決定されるべきであることに注意してください。

これらの結果を総合すると、このプロトコルが再現性のある生物学的に有益なデータセットが得られ、疾患状態や実験的摂動にわたる異なる相互作用トームのリモデリングを明らかにするために使用できることが確認されます。dfPPI出力は、経路濃縮フレームワークとの統合に適しており、標準的な存在量ベースの方法では検出できない機能的再配線イベントのマッピングを可能にします。

図1:dfPPIプラットフォームの概要。 (A)dfPPI(機能不全タンパク質-タンパク質相互作用)プラットフォームは、ケモプロテオミクスワークフローを通じて疾患特異的なPPIネットワーク機能障害の特定を可能にします。セクション1では、アフィニティーマトリックス(PUビーズなど)に固定化されたエピシャペロームを標的とする化学プローブを使用したサンプル調製と相互作用法の捕捉を行います。セクション 2 と 3 では、インタラクトーム同定のための 2 つの互換性のある消化ワークフロー (ビーズ上またはゲル内) とそれに続くラベルフリー LC-MS/MS の概要を示します。統計モデリングや経路濃縮などの計算分析は、このプロトコルではカバーされていませんが、https://epichaperomics.mskcc.org/ で無料で入手できる dfPPI バイオインフォマティクス パイプラインを使用して実行されます。(B)dfPPIの原理。疾患関連の文脈では、内因性エピシャペロームは、PPIネットワークを再編成する超分子足場を形成します。エピシャペローム指向の化学プローブ(PUビーズなど)は、これらの足場をそれらの結合相互作用因子とともに、無傷の細胞または天然のライセートから直接捕捉し、1回の実験でマルチベイトプルダウンをもたらします。一致した制御(不活性ビーズ制御および/またはフリープローブとの競合など)を並行して処理できます。捕捉された材料は、ビーズ上またはゲル内で溶出および消化され、LC-MS/MSで分析され、タンパク質が定量されます(強度またはMS/MSスペクトルカウント)。得られたインタラクトームは、条件間での差分インタラクターを計算し、経路/ネットワークのエンリッチメントを実行するために使用され、システムレベルでコンテキスト固有のPPI機能障害を明らかにします。このワークフローは、遺伝子タグ付けや過剰発現を必要とせず、細胞と組織の両方に適合し、コホート研究に合わせて拡張できます。逆に、従来のアフィニティー精製MSは、一度に1つのタグ付きベイトを中心とし、コンストラクトごとにローカル近傍を生成し、通常、ネットワークをサンプリングするために多くのコンストラクト/ランを必要とします。対照的に、dfPPIは内因性エピシャペロームを餌として使用し、ネイティブシステムから多くの機能不全のPPIを同時に捕捉することで、疾患特異的なネットワーク再配線の発見を加速し、1回のキャプチャから経路レベルの読み出しを提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PUビーズロットの検証とキャプチャ特異性。 (A)生物学的特異性とロット間の一貫性。MDA-MB-468(エピシャペローム高)およびASPC1(エピシャペローム低)細胞を天然バッファー(20 mM Tris、pH 7.4、20 mM KCl、5 mM MgCl₂、0.01%NP-40、プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤)で溶解しました。各捕捉について、40 μLのPUビーズスラリーを250 μgの総タンパク質(1 μg/μL)とともに4°Cで3時間回転させてインキュベートしました。ビーズをネイティブバッファーで洗浄しました。複合体を~100 μLのSDSサンプルバッファーで変性/溶出しました。各溶出液5〜10 μLをSDS-PAGEで分離し、HSP90、HSC70、およびHOPに対して免疫ブロットしました。入力ライセートは参考のために示されています。2つのPUビーズロット(バッチ1、新鮮;バッチ 2、熟成)は、MDA-MB-468 で強力な濃縮をもたらし、ASPC1 で最小限のシグナルをもたらし、特異性とロットの一貫性が維持されていることを示しています。(B)グローバルカーゴとコントロールビーズ。MDA-MB-468ライセートは、(A)のようにPUビーズまたは一致したコントロールビーズのいずれかを使用して処理されました。~20 μL の各溶出液をロードし、SDS-PAGE で分離し、クーシー染色しました。PUビーズは、エピシャペローム結合アセンブリに特徴的な複雑な高MWカーゴを回収しますが、コントロールビーズは最小限のバックグラウンドを示します。分子量マーカー(kDa)が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:dfPPIアフィニティーキャプチャー、インタラクトーム同定、およびバイオインフォマティクス分析の代表的な結果。 (A)4つの代表的なヒト脳サンプル(PT1-PT4)からのエピシャペローム結合インタラクトームのPUビーズアフィニティーキャプチャーから溶出したタンパク質のクーマシー染色SDS-PAGEゲル。ビーズ結合タンパク質アセンブリをSDSサンプルバッファー中で沸騰させて変性させ、SDS-PAGEで分離し、染色して分子量全体の相互作用の回復を評価しました。各サンプルは、相互汚染を最小限に抑えるために、サンプル間に空のレーンを設けて、別々のレーンにロードされました。これらの空のレーンで時折観察されるかすかな信号は、電気泳動中のわずかなサンプルのスピルオーバーを反映しています。これらのゲルは、MS施設に提出されたサンプルの代表であり、各レーンは5つのスライスに分割され、MSによるゲル内消化およびタンパク質同定が行われました。(B)8つの代表的なマウス脳サンプル(二重に実行)からビーズで消化されたエピシャペローム相互作用体から同定されたタンパク質強度の主成分分析(PCA)により、技術的複製の緊密なクラスタリングと、PC1およびPC2に沿った明確な生物学的分離が明らかになりました。これにより、高い技術的再現性と、堅牢なdfPPI分析のための十分な生物学的分散が確認されます。データ構造は、技術的なアーティファクトではなく、相互作用レベルの差異がサンプル分離を促進することを示しており、人為的な正規化を必要とせずに下流の差分相互作用モデリングのための強力な基盤を提供します。(C)8つのサンプルグループにわたる前駆体イオン強度の変動係数(CV)分布は一貫して低い分散を示し、CVの中央値は9.7%から11.9%の範囲です(縦の破線で示されます)。これらの低いCVは、MS検出および定量パイプラインの再現性と堅牢性を浮き彫りにしています。この一貫性は、全体的なタンパク質発現ではなく、相互作用強度の分散が関心のある生物学的シグナルであるdfPPI分析の信頼できるインプットとして生の強度またはMS/MS値を使用することをサポートします。(D)すべてのサンプルにわたる対数₂変換タンパク質強度値の階層的クラスタリングヒートマップ(技術的な重複が示されています)。サンプルは複製ではなく生物学的起源によってクラスター化され、エピシャペローム結合インタラクトームの堅牢な捕捉と生物学的に関連する分散の保存を確認します。広いダイナミックレンジとタンパク質間の一貫した検出により、dfPPI分析のデータセット品質がさらにサポートされます。スケールバーは、2(青、低存在量)から14(黄色、高存在量)の範囲の対数₂変換タンパク質強度値を表します。(E)dfPPIによって同定された異なる相互作用タンパク質に対して実行された経路濃縮分析のマンハッタンプロット。濃縮はg:Profilerを使用して実施され、有意な項は-log₁₀(p値)によってプロットされ、注釈ソースによって着色されます:GO分子機能(GO:MF)、GO生物学的プロセス(GO:BP)、GO細胞成分(GO:CC)、KEGG、Reactome、WikiPathways、およびHuman Phenotype Ontology(HP)。この出力は、エピシャペローム駆動の相互作用トーム リモデリングを通じて摂動された生物学的に意味のある機能経路を明らかにするという、dfPPI の中核的な有用性を表しています。幅広い注釈の対象範囲は、このアプローチを通じて達成可能なシステムレベルの洞察を強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

方式	キャプチャー内容	主な強み	主な制限事項	代表的な用途	スケーラビリティ (コホート)
AP-MS(アフィニティー精製-MS)	単一の餌の直接/ほぼ直接の相互作用者	高い特異性;量的;複雑な構図に適しています	餌/タグ/抗体が必要です。一度に1つの餌。過渡的/弱いものを見逃す可能性があります	目的のタンパク質のパートナーを定義する	低〜中程度(多くの餌が必要)
近接ラベリング(例:BioID/APEXバリアント)	経時的な餌のナノスケール付近のタンパク質	過渡的/弱いネイバーをキャプチャします。生きた細胞で働きます	遺伝子工学;オフターゲットラベリング;パラメータ重い	地元の近隣地図。動力学	低〜中程度(餌ごとのエンジニアリング)
XL-MS(架橋MS)	タンパク質内/タンパク質間の空間的近接/接触	構造的制約;過渡接触をキャプチャ	複雑な分析;プロテオームの幅が低い。サンプル固有	構造/コンテキストトポロジー	低(特殊)
共分画/MS (CF-MS)	ネイティブアセンブリの共溶出	タグ付けなし。ネイティブ アセンブリ	労働集約的;複雑な推論;感度の制限	グローバルな複雑なランドスケープ	適度
CETSA/TPP	共安定性/共凝集プロファイル	ラベルフリー。ネイティブ条件	PPIの間接的。溶解度制約	ターゲットエンゲージメント;熱シフト	適度
dfPPI(エピチャペロミクス)	多重餌としての内因性エピシャペロームによって捕捉されたネットワークレベルの相互作用再配線	内因 性;タグ付けなし。1 つのキャプチャは、機能不全の何千もの PPI を尋問します。経路/ネットワークの読み出し;組織適合性;コホートフレンドリー	疾患の状況にのみ適用されます。特殊なプローブ(PUビーズ、YK5-B);一般的な複合検出を対象としていません	疾患コンテキスト相互作用リモデリング、経路の優先順位付け、仮説生成	高(数百サンプル実行可能)

表1:PPIマッピングアプローチとdfPPIの比較。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:Spectronautの完全なパラメータ設定。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、dfPPIプラットフォームを使用して、ネイティブの生物学的サンプル中の機能不全PPIのマッピングを可能にします。存在量や発現の変化から機能障害を推測する従来の方法とは異なり、このプラットフォームは、エピシャペロームを標的とするプローブによるアフィニティー精製を通じて疾患特異的相互作用因子を単離し、続いてラベルフリー強度ベースの定量的MSを行うことで、構造レベルでネットワークの再配線をキャプチャします。現在のアプリケーションは死後の脳組織に焦点を当てていますが、この方法は、癌、神経変性、および免疫機能障害のモデルからの培養細胞および組織を含む他のサンプルタイプおよび疾患モデルに広く適用できます16,17,18,19,20,22,23。

dfPPIは、エピシャペロームを動力学的に選択し、結合した相互作用体でアセンブリをトラップするプローブに依存しています。PUビーズ(PU-H71 / PU-ADなどのエピシャペローム結合ケモタイプに由来)は、HSP90有核エピシャペロームに非共有結合的に関与しますが、滞留時間が長く、従来のシャペロン複合体に対するエピシャペロームコンフォメーションの速度論的選択性の特徴です²³。YK5-Bは、エピシャペローム内のHSC70に向けられたビオチン化された共有結合プローブであり、溶解前の細胞内捕捉を可能にし、内因性PPIを保存します¹⁷。選択性は、HSP90/HSC70 のコンフォメーションとポケット化学をリモデリングし、エピシャペローム アセンブリを安定化する疾患関連 PTM に由来します 14,23,43,44;これらの変化により、PU型非共有結合プローブ⁴⁵に対して高親和性で遅いk_オフ結合が得られ(HSC70指向性YK5-Bによる共有結合捕捉が可能になり)、それによってエピシャペローム複合体を動力学的に保持し、LC-MS/MSの直接的および間接的な相互作用因子を共分離します。実際には、PUビーズはライセート/ホモジネートワークフローに最適ですが、YK5-Bは生細胞キャプチャをサポートします。どちらも、LC-MS/MSで識別でき、下流のdfPPI分析に使用できるコンテキスト依存アセンブリを保持します。

dfPPIの場合、キャプチャプローブを合成するには化学の専門知識が必要です。ただし、この要件はdfPPIに限ったことではなく、広く使用されているPPI法(AP-MS、近接標識、XL-MS)も、クローニング/エンジニアリングタグ付きベイト、安定した細胞株生成、標識/架橋最適化、複雑なバイオインフォマティクスパイプラインなどの専門的なスキルに依存しています。対照的に、dfPPIは遺伝子操作やベイトの過剰発現を回避し、天然細胞または組織(希少な臨床生体試料を含む)に直接作用し、プロテオミクスコアですでにルーチン化されている標準的なアフィニティーキャプチャーおよびLC-MSワークフローを使用します。採用の障壁を下げるために、検証済みのPUビーズと一致したコントロールビーズは、キオシス研究所からMTAを介して入手でき、取り扱い/QAステップはステップ1.3および1.4で完全に指定されています。最後に、分析は、必要な統計と経路/ネットワークの読み出しを実装するWebベースのdfPPIアプリによってサポートされ、バイオインフォマティクスの負担を軽減します(つまり、コーディングのバックグラウンドがなく、基本的なバイオインフォマティクススキルのみのユーザーの場合)。

AP-MS、XL-MS、近接標識、共分画、およびCETSA/TPPはそれぞれ、異なる質問(直接バインダー、空間的近接性、近傍標識、共集合、または熱共安定性)に答えます。dfPPIは、疾患における内因性のコンテキスト依存的な再配線をマッピングすることが目標であり、特に遺伝子タグ付けが実行不可能な天然組織または大規模な臨床コホートにおいて、および単一のキャプチャからの経路/ネットワークレベルの読み出しが必要な場合に選択される方法です。dfPPIは、エピシャペロームをマルチプレックスベイトとして使用し、多くのタンパク質にわたる協調的な相互作用変化を1回のプルダウンで捕捉し、一次材料からのスケーラブルなLC-MS/MS同定と経路中心分析を可能にします。実際には、dfPPIは下流のベイトに焦点を当てた検証(特定のノードでのAP-MSなど)をシードできますが、従来の方法では、dfPPIによって強調表示された複合体のトポロジー(直接接触、空間的制約)を改良できます。並べて比較するには 、表 1 を参照してください。

ワークフローの成功には、いくつかの重要なステップが影響します。まず、高品質のタンパク質抽出物が不可欠です。これには、タンパク質分解を最小限に抑え、天然複合体を保存するために、組織または細胞を慎重に取り扱う必要があります(理想的には急速凍結して-80°Cで保存します)。プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤の両方を含めることは交渉の余地がありません:このアッセイで機能的な「餌」として機能するエピシャペロームの完全性は、HSP90^23,43などのコア成分の特定の翻訳後修飾に依存します。たとえば、Ser226およびSer255のリン酸化は、エピシャペロームコンフォメーションを安定化し、その足場機能を維持するために不可欠です²³。ホスファターゼ阻害剤の省略は構造崩壊と生物学的特異性の喪失を危険にさらす

もう一つの重要な決定要因は、PUビーズアフィニティーマトリックスの品質と取り扱いです。ビーズは、-20°Cの100%イソプロパノールで保存し、定義された活性ウィンドウ内、理想的には1〜2年以内に使用する必要があります。老化したビーズは結合能の低下や非特異的相互作用の増加を示す可能性があるため、重要な実験の前に活性を検証する必要があります。インキュベーション時間とタンパク質インプットも最適化する必要があります:過剰にインキュベーションするとバックグラウンドが上昇する可能性があり、タンパク質インプットが不十分であると検出深度が損なわれる可能性があります。3時間のインキュベーションとパイロットプルダウンを推奨し、各サンプルタイプに適切な入力を校正します。

このプロトコルには、オンビーズとインゲルの2つの消化戦略があります。どちらのワークフローも再現性のある結果をもたらしますが、それぞれにトレードオフがあります。ゲル内消化では、ケラチンなどの汚染物質が混入する可能性があり、追加の取り扱い手順が必要になります。オンビーズ分解はワークフローを合理化し、サンプルスループットや投入量が制限されている場合に一般的に好まれます。ただし、プロテアーゼ量は総タンパク質インプットに基づいて校正する必要があります:この方法は750 ngのトリプシン用に設計されていますが、タンパク質レベルが高いと不完全な消化が発生し、切断が見逃され、ペプチド回収率が低下する可能性があります。消化効率を評価し、それに応じて酵素入力を調整することをお勧めします。すべての消化ステップは、一貫性を確保し、バックグラウンドを最小限に抑えるために、新たに調製された汚染のない試薬を使用して、低結合チューブで実行する必要があります。

LC-MS注入あたりのタンパク質ローディングは、キャプチャーワークフロー、ペプチド収量、およびカラム容量によって異なります。標準的なnano-LC C18カラム(~50-75 μm ID、~15-25 cm)で分析したオンビーズ消化物の場合、通常、注入ごとに300-500 ngをロードします。~400〜500ngを超える性能向上は観察されていませんが、負荷が高くなるとイオン抑制とピーク拡大のリスクがあります。ゲル内ワークフロー(レーンあたり5スライスなど)では、通常、反復ごとにスライスあたり~25%の脱塩材料を注入し、必要に応じて再注入用のバックアップとして~50%を保持します。いずれの場合も、注入前にペプチド濃度を測定し、QC 消化で線形応答を検証し、クロマトグラフィーのピーク形状と同定深度が過負荷なく維持されるようにロードを調整します。

DIAによるラベルフリー定量は、その再現性と深さ⁴⁶により、プロテオミクスで広く使用されています。ただし、このようなアフィニティーキャプチャー実験の文脈では、全体的なタンパク質存在量を測定するのではなく、エピシャペローム足場と相互作用するタンパク質を同定することが目標であり、MaxLFQのような正規化戦略は適切ではありません。これらのアプローチは、均一な入力とプロテオーム全体の類似性を前提としていますが、これはこのプロトコルに固有の濃縮ステップによって違反されます。代わりに、強度値またはMS/MSスペクトルカウントは、下流の機能分析に十分で生物学的に意味のある定量を提供します。これらの指標は、条件全体にわたるタンパク質とエピシャペロームの相対的な相互作用の強さまたは頻度を反映しています。以前の研究^{16、17、18、20}で実証されたように、これらの値は、プロテオーム全体の正規化に依存せずに変化した生物学的経路を特定するdfPPIなどのシステムレベルの相互作用解析に適しています。疾患や治療によってもたらされる真の生物学的分散を維持することにより、強度またはMS/MSベースの定量化により、PPIネットワーク機能障害の正確かつ堅牢なマッピングが可能になります。

アフィニティーキャプチャーは、ライセート全体と比較して検索空間を縮小しますが、dfPPIプルダウンには、広いダイナミックレンジにまたがる数百から数千のタンパク質と、共濃縮バックグラウンドが含まれています。コホートスケールの比較では、DDAの確率的前駆体の選択により、実行間欠損値と低存在量相互作用因子の可変サンプリングがもたらされます¹⁸。DIAは、事前に定義されたウィンドウ内のすべてのイオンを体系的にフラグメント化し、下流の推論が単一タンパク質ではなく経路/ネットワークレベルである場合に重要な、より深い深さ、より少ない欠損値、およびより高い実行間の再現性を提供します。これが、dfPPIのDIAを標準化する理由です。

すべてのアフィニティー捕捉法と同様に、非特異的タンパク質結合は固有の考慮事項です。タンパク質は、樹脂への粘着性、存在量の多さ、または凝集により保持される可能性があります。このような非特異的相互作用器はプルダウン溶出液中に現れる可能性があるが、それらの存在は、このプロトコル¹⁷の下流の分析目的を損なうものではない。dfPPI ワークフローは、バイナリ相互作用を定義するように設計されているのではなく、システムレベルで PPI 再配線のパターンを抽出するように設計されています。機能強化分析は、差分相互作用器に対して実行され、ネットワークベースの統計を活用して、調整された経路レベルの変化を明らかにします。以前の研究¹⁷で実証されたように、このシステムレベルのアプローチは、単離された非特異的タンパク質の影響を最小限に抑え、コホートレベルのデータから堅牢な生物学的結論を得ることができます。

共免疫沈降、近接標識、架橋などの従来のインタラクトームマッピングアプローチと比較して、dfPPIプラットフォームには、餌工学や過剰発現を必要とせずに、疾患関連条件下で機能的なインタラクトームリモデリングをキャプチャするという明確な利点があります。この方法は、超分子エピシャペロームの周囲に形成されたタンパク質複合体を単離するため、健康なシステムには存在しない創発タンパク質集合体を検出し、新しい疾患ドライバーの発見を可能にします。このアプローチは、組織、種、疾患状態を超えて拡張可能で適応可能であり、がんや神経変性におけるプロテオームのリモデリングに関する独自の洞察をすでに提供しています。そのため、この方法は、ヒトの病気で破壊された機能的ネットワークを明らかにするための強力なツールを提供します。

ここでの例を超えて、dfPPI は、(i) ネットワーク機能障害によって患者を層別化し、標的関与と経路修正を報告する薬力学的バイオマーカーを発見するための大規模な臨床コホートに適した位置にあります。(ii) 再配線の軌跡を追跡し、レスポンダーを予測するための縦断的サンプリング (例: 治療前/治療後、疾患病期分類)。(iii)相互作用状態の変化を上流シグナル伝達に結び付けるためのリン酸化プロテオミクスおよびその他のPTMを認識したオミクスとの統合。(iv)局所ネットワーク病態生物学をマッピングするための微小解剖領域(腫瘍正常界面、脳サブ領域)からの空間的に分解されたキャプチャ。(v)dfPPIの読み出しが実行可能なノードと作用機序を指名する摂動スクリーニング(遺伝的または複合的)。(vi) 予後と治療設計のために dfPPI マップから疾患固有のネットワーク特徴を学習するグラフ/AI モデリング。方法論的には、小型化、自動化(96ウェルフォーマットなど)、および標準化されたQCにより、トランスレーショナルスタディや臨床試験のためのハイスループットパイプラインが可能になります。最後に、dfPPI出力は、ターゲットを絞ったフォローアップ(AP-MS、XL-MS、または近接ラベリング)をシードして、優先順位付けされたモジュールのトポロジーを解決し、インタラクトミクスツールキット内でのメソッドの補完性を強調できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール	シグマ・オルドリッチ	M6250	有毒で可燃性
アセトニトリル(ACN)オプティマ	フィッシャー・サイエンティフィック	A955-1	LC/MSグレード(可燃性)
Affi-Gel 10活性化アフィニティクロマトグラフィー媒体	バイオ・ラッド	1536099	PUビーズや制御ビーズ(Flammable)の製造に使われました
重炭酸アンモニウム(ABC)	シグマ・オルドリッチ	09830-500G
オーロラ・アルティメット 25x75 C18 UHPLCコラム	イオンオプティック	AUR3-25075C18-CSI
オートラジオグラフィーフィルム	ユーエン・パーカーX線社	EBA45	ウェスタンブロット後の化学発光信号検出の代替案
バイオマッシャーマイクロティッシュホモジナイザー	DWKライフサイエンスズ キンブル	7496250010	タンパク質抽出のための凍結脳組織均質化に使用
ブロモフェノールブルー	フィッシャーバイオリエージェント	血圧115-25
1.5 mLチューブ用遠心分離機	エッペンドルフ	5424
1.5 mLチューブ用遠心分離機およびnbsp;	エッペンドルフ	5417R	温度管理付き
15〜50 mLチューブの遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	円錐管用
ChemiDoc MPイメージングシステム	バイオ・ラッド	17001402	ゲル/ブロット密度測定に使用
柱オーブン	Sonation GmBH、ドイツ	ES071/ES072	ナノLCカラムを50度で維持;Cは一貫した保持を意味します
円錐形チューブ(15 mL)	フィッシャー・サイエンティフィック	352096
コントロールビーズ	キオーシス研究所	該当なし	Taldoneら(PMID: 21459002)
クマッシー G-250 ステイン(バイオセーフ)	バイオ・ラッド	1610786
ダーク・エッペンドルフ管(1.5 mL)	USAサイエンティフィック	1415-2507
ジチオスレイトール(DTT)	ロシュ	10197777001	刺激
イージーNLC 1000	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	イージーNLC 1000	Q Exactive HFと共に使用されたLCシステム
エンポレ固体位相抽出ディスク	3M中隊	2215-C18(オクタデシル)	ペプチド脱塩用のStageTipsの準備に使用;100%メタノールで活性化
増強化学発光(ECL)キット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	32209
エッペンドルフチューブ(1.5 mL)	フィッシャー・サイエンティフィック	05-408-129
蟻酸(FA)オプティマ	フィッシャー・サイエンティフィック	A117-10X1AMP	LC/MSグレード
g:プロファイラー(e111_eg58_p18_f463989d)	BIITグループ-タルトゥ&ウムル;リクール	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	経路の濃縮
グリセロール	フィッシャーバイオリエージェント	BP229-1	分子生物学グレード
グリシン	フィッシャーバイオリエージェント	BP381-5	結晶粉
ヤギ抗マウスHRP結合二次抗体(RRID: AB_2619742)	サザーン・バイオテック	1030-05	H90-10抗体の二次
ヤギ抗ウサギHRP結合二次抗体(RRID: AB_2632593)	サザーン・バイオテック	4010-05	HSP90およびアルファの二次モデル;およびHOP抗体
ヤギ抗ラットHRP結合二次抗体(RRID: AB_2716837)	サザーン・バイオテック	3030-05	HSC70抗体の二次疾患
加熱軌道シェーカー	エッペンドルフ	サーモミキサーC(2231001127)
HeLaタンパク質ダイジェスト標準-ピアース	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	88329	LC-MSの品質評価に使用
ホップ抗体(RRID: AB_10828378)	細胞シグナル伝達	5670	PUビーズの品質管理
HSC70抗体(RRID:AB_10617277)	エンツォ	SPA-815	PUビーズの品質管理
HSP90(H90-10)抗体(RRID: AB_854214)	ストレスマーク	SMC-107	PUビーズの品質管理
HSP90α抗体(RRID: AB_303423)	アブカム	AB2928	1.2節に従い正規化について
ヒト細胞株:ASPC1(RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	対照細胞株、エピチャペローム低/シャペロン高
ヒト細胞株:MDA-MB-468(RRID:CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	対照細胞株、エピチャペローム高/シャペロン高
ImageJ(v1.54p)	ウェイン・ラスバンド	https://imagej.net/ij/	デンシトメトリー
ヨードアセタミド(IAA)	シグマ・オルドリッチ	I1149-5G	毒性
低タンパク質結合マイクロ遠心分離管	サーステット	72.706.600
リス-Cプロテアーゼ	プロメガ	VA1170	LC/MSグレード
塩化マグネシウム	シグマ・オルドリッチ	63068	分子生物学グレード
MaxQuant (v2.1.1.0)	マックス・プランク生化学研究所	https://www.maxquant.org/	ペプチド/タンパク質同定およびラベルフリー強度ベースの定量のためのMaxDIAワークフロー
メタノール	フィッシャー・ケミカル	A454-4	HPLCグレード、可燃性、有毒
ミニプロテアーゼ阻害カクテル錠(完全版)	ロシュ	4693124001
ミニトランスブロット電気泳動トランスファーセル	バイオ・ラッド	1703930
ミニゲル電気泳動タンク	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A25977	Novexプレキャストゲルに使用
ミニプロテアン・テトラ垂直電気泳動細胞およびnbsp;	バイオ・ラッド	1658004	Mini-PROTEANプリキャストプロテインジェルまたは手作りゲルに使用されます
ミニプロテアン TGXプレキャストプロテインジェル(4–20%)	バイオ・ラッド	4561094
ナノドロップ	アジレント	BioTek Synergy H1	LC-MS注入前のペプチド濃度推定に使用されます
ナノエリュート2	ブルーカー	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	diaPASEFワークフローでの使用
ナノスプレー・フレックスソース	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	ES071	ナノスプレーESI結合用
新しいObjective PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	ニュー・オブジェクティブ社	PF360-75-10-N-5	C18スラリーで20cmまで詰められています
ニトロセルロース膜	シティバ・アマーシャム	10600006
無脂肪ドライミルク	ラボ・サイエンティフィック	M0841
Novex 8%トリスグリシンプレキャストゲル	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	XP00080BOX
NP-40	ロシュ	11754599001
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	10010023
PhosSTOP ホスファターゼ阻害カクテル錠	ロシュ	4906837001
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	23225
プラスチック容器	フィッシャー・サイエンティフィック	FB0875711A
プラットフォームロッカー	コーニング	6705
塩化カリウム	フィッシャーバイオリエージェント	BP366-1	ホワイトクリスタル
パワーパック・ユニバーサル電源	バイオ・ラッド	1645070
Precision Plus Protein Kaleidoscope プレステインドプロテイン標準	バイオ・ラッド	1610375
PUビーズ	キオーシス研究所	該当なし	Taldoneら(PMID: 21459002)
Q アクティブHFオービトラップ質量分析計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	DIA-MSでの使用
ReproSil-Pur 120 C18-AQ、3 & micro;m	Dr. Maisch GmbH(ドイツ)	R13.aq	ペプチド分離用のシリカ培地;粉末/メタノールのスラリー(1:3、v/v)
回転ユニット(エンドオーバーエンド回転子)	バーンステッド インターナショナル	400110
Sep-Pak C18カートリッジ(100mg)	ウォーターズ・コーポレーション	WAT023590
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	フィッシャーバイオリエージェント	BP166-500	電気泳動グレード
ソニケーター	ブランソン	2510
SpectraMax パラダイム マルチモードマイクロプレートリーダー	分子デバイス	スペクトラマックス・パラダイム
スペクトロノート	バイオグノシス	https://biognosys.com/software/spectronaut/	directDIAワークフロー
SpeedVacコンセントレーター	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	サヴァントSPD111V
吸引真空	カーディナル・ヘルス	CDL-65651-320
TimsTOF HT質量分析計	ブルーカー	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	diaPASEF解析に使用
トリフルオリ酢酸(TFA)オプティマ	シグマ・オルドリッチ	T6508-10AMP	LC/MSグレード(腐食性、可燃性)
トリス	フィッシャーバイオリエージェント	BP152-5	結晶粉;分子生物学グレード
トリス、pH 6.8(1 m)	テクノヴァ	T1068
トリス、pH 7.5(1 m)	フィッシャーバイオリエージェント	BP1757-500	分子生物学グレード
トリスバッファー(20 TBS)バッファー	VWR、生命科学	97064-338
トリスグリシンSDS(TGS 10x)ランニングゲルバッファー	フィッシャーバイオリエージェント	BP13414	電気泳動
トリプシン	プロメガ	V5111	シーケンスグレード
トリプシンゴールド	プロメガ	V5280
トゥイーン20	フィッシャーバイオリエージェント	BP337-100
尿素	シグマ・オルドリッチ	U0631-500G
渦動	フィッシャー・サイエンティフィック	02-215-414
水	フィッシャー・サイエンティフィック	W6-1	LC/MSグレード