脳卒中前臨床評価ネットワーク:血栓塞栓性脳卒中および血栓溶解症の多検査室モデル:TE-MCAo

サマリー

血栓塞栓性脳卒中を模擬するため、異種ラットの血液から調製した塞栓を中脳動脈に注入し、その後全身血栓溶解術を投与して再開化しました。このモデルのバージョンは、複数検査室ネットワークでの利用に最適化されており、複数の候補治療薬の試験をサポートしています。

要約

現在の翻訳型齧歯類脳卒中モデルは、ナイロンフィラメント、注射塞栓、腔内トロンビン、または血管周囲エンドテリン-1を用いて中脳動脈閉塞(MCAo)を誘導し、ヒト脳卒中を模擬しています。これらの方法の中で、血栓塞栓注射の後に血栓溶解を行う方法が、ヒト患者で見られる神経炎症現象を最もよく模倣し、最も広く使われている不活性ナイロンフィラメント法よりも好ましい場合があります。しかし、主要な単一検査室で使われている標準的な血栓塞栓モデルは、時間がかかり、結果にばらつきがあり、習得にはかなりの技術が必要です。これらの制約に対処するため、血管閉塞を標的とし、静脈内血栓溶解を用いて再開化を実現する血栓塞栓性MCAoモデルを開発しました。これは臨床シナリオで実施される全身血栓溶解と並行しています。動物の数を減らすために、私たちはドナー動物から血液を保存し、複数の被験者のための後の塞栓検査準備に備える方法を開発しました。当社が導入したDoccolマイクロカテーテルの利用により、血栓塞栓をマイクロカテーテルに事前に装填し、内頸動脈に挿入することで血栓の準備と注射を簡素化します。再開術を実現するために、1.5 mg/kgの静脈内テーネクテプラーゼを投与しました。再現性を促進するために、標準手術手順書、研修ビデオ、実践的な外科研修ワークショップを準備・現場検証しました。このモデルは標準的な外科的アプローチを用いており、広く受け入れられているナイロンフィラメントモデルを使うすべての研究者に馴染みのあるはずです。マイクロカテーテルを翼口蓋動脈を避けて遠位内頸動脈への通過は、ナイロンフィラメント挿入に似た方法で行われます。回復および脳卒中後の評価は、一般的な行動的、放射線学的、組織学的プロトコルで行われることがあります。このモデルは、制御された再開化を伴う血栓塞栓性MCAoモデルを目指す研究者にとって、実用的で再現性が高く、アクセスしやすいアプローチを提供します。

概要

脳卒中は世界中の主要な死因と障害の原因の一つ^です。多くの患者が静脈内血栓溶解療法で恩恵を受け、選択的な患者は機械的血栓切除術で有益です。すべての患者が血栓溶解や血栓切除のために間に合うわけではなく、またすべての患者が完全な回復の恩恵を受けるわけではないため、追加または補助的な脳保護療法の開発が依然として大きな必要性を残しています。最も広く使われている齧歯類虚血性脳卒中モデルは、中大脳動脈(MCA)の単線閉塞とその後の完全再灌流です。このモデルは大血管閉塞(LVO)をシミュレートし、大きな脳卒中を起こした患者が完全な機械的血栓切除術を成功裏に受けていることをモデル化します。しかし、このモデルは臨床脳卒中のごく一部しか捉えていません。対照的に、より多くの患者は動脈硬化に起因する血栓塞栓性脳卒中(原所で動脈硬化性プラーク破裂または全身性疾患による動脈塞栓症)を発症し、全身性血栓溶解のみで治療されますが、ナイロンモデルではこれを再現できません ^2,3。さらに、ナイロンフィラメントMCAoモデルには血栓性閉塞に関連する炎症カスケードが欠^{けています。}血栓塞栓術を用いた動物モデルと全身的な血栓溶解剤投与は、多くの脳卒^中患者に見られる病態生理および基本的な生物学を表します^4,6。しかし、これまでのところ、齧歯類血栓塞栓性脳卒中モデルは複雑で再現が難しいことが知られています。専任の専門家がいる孤立した研究室では、比較的再現性の高い形で血栓塞栓症モデルを達成できます。このようなモデルは、複数研究室プロジェクトで必要とされるような広範な使用には適していません。

ここでは、更新かつ標準化された中大脳血栓塞栓症(TE-MCAo)と、その後の全身性血栓溶解モデルの詳細なプロトコルを提供します。具体的には、血栓の準備を簡素化し、カテーテルへの血栓充填を標準化し、このモデルの複数検査室試験におけるスケーラビリティを検証しました。このモデルは脳卒中前臨床評価ネットワーク(SPAN)で使用するために開発しました。しかしながら、このモデルは新しい候補治療法の大量前臨床ネットワーク試験を実施しようとするネットワークにとって有用であることを意図しました。標準化モデルを用いて、研究期間中に各研究拠点ごとに1日あたり6頭のラットにTE-MCAoを誘導することができました。

SPANや類似のネットワークは、有望な脳保護薬を前臨床現場から^{臨床実践での}成功へと翻訳できない繰り返しの失敗に対応して拡大しています7。2019年に国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)がSPAN⁸を開始しました。SPANは、中央集権的なマスキング、ランダム化、自動集中的アウトカム解析を通じてバイアスを最小限に抑え、潜在的な治療法をより効果的にスクリーニングすることを目指しています。SPAN 1は最初の2回のバージョンでナイロンフィラメントモデルを採用しました。なぜなら、参加するすべての研究所がすでにナイロンを使用しており、⁹基の展開が容易だったからです。血栓塞栓症や血栓溶解の多くの側面をより忠実にモデル化するために、SPANはここで述べたTE-MCAoモデルの作成を目指しました。このモデルは、ナイロンフィラメントモデルからTE-MCAoモデルへ移行する前臨床外科医にとって有益です。前臨床検査室では、MRIなどの画像診断技術を用いてMCAo(またはTE-MCAo)の存在をMCAo(またはTE-MCAo)で確認することを推奨します。

SPANネットワークは過去の研究⁹で完全に説明されており、すべてのSPAN標準作業手順(SOP)はSPANのウェブサイトで入手可能です。簡単に言えば、このネットワークは薬剤流通、データ品質管理、プロトコル遵守の検証、ネットワーク通信を担当する調整センター(CC)によって管理されています。すべてのSOPはCCによって作成され、審査後に運営委員会によって承認されます。SPANでは、すべての齧歯類には研究所到着時にMRI対応のバーコード付きイヤータグが付けられ、被験者はSPAN研究電子データキャプチャ(REDCap)データベースに登録されます。動物はCCによって部位と性別ごとに層別化されたランダム化表を用いてランダム化されます。SPAN 1およびSPAN 2では、6つの参加研究室で推定治療薬の有効性が調査されました。すべての試験薬は、同じ外観のバイアルに包装され、調整センターでラベルが貼られ、プロジェクトの開始時に研究所へ出荷されました。

プロトコル

USCの調整センターを含むすべての参加SPAN研究所は、動物の人道的かつ倫理的な扱いに関するNIHおよびAAALACのガイドラインに従っていました。すべての現場で現地IACUCの承認を得ました。

1. 血栓の準備

注意:すべての血液および血栓は、生物災害に関する地域の機関ガイドラインに従って取り扱うべきです。血液に接触するすべての物質は、生物有害廃棄物として処分するか、外科器具の場合はオートクレーブで徹底的に洗浄・消毒されるべきです。この試験での献血動物の使用を減らすため、私たちはドナー血液を貯蔵し、必要に応じて血液を使って血栓塞栓を作る方法を開発しました。

1. 動脈から新鮮なドナー血液を1.5mLのマイクロ遠心分離機管または小児用エチレンジアミン四酢酸(EDTA)マイクロチューブに抽出し、500μLレベルまで充填します。
   注:私たちは大腿動脈カニュレーションを採血に好む。大腿動脈は大きな腔径を持ちカテーテル挿入が可能で、両側性で2回の採血が可能であり、齧歯類にとっては生存可能な手術でもある。私たちの経験では、血液は4°Cで4週間保存できます。
2. 500μLの保存された抗凝固血液に_CaCl2 溶液1mL(5mg/mL)を加えます。
3. _CaCl2による抗凝固逆転直後、微小遠心分離機チューブから100cmのPE-50チューブに優しい吸引で血液を吸引します。
   注意:遅延はPE-50チューブに血液を引っ込める前に血栓を引き起こします。
4. 巻き上げチューブを、事前に温めたリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で37°Cでテーブルトップオーブンで2時間孵化します。
   注意:ペトリ皿をオープンホットプレートに置くと、熱の分布が不均一で結果が一致しません。
5. 2時間の培養終了後、血液充填PE-50チューブを直ちに4°Cに移して保存します。20〜72時間の間は次のステップでも使える状態です。

2. カテーテルの装填

1. コイル状のPE-50チューブ(内径:0.58mm)を生理食塩水入りの3〜5cc注射器に接続し、血栓をPBS入りのペトリ皿に優しく排出します。
   注意:これにはかなりの力が必要になる場合があります。カテーテルと注射器が押し出時に外れないように、接続部への圧力を抑えてください。PE-50カテーテルは必要に応じて、押出を容易にするために10〜50cmの小さなセグメントに切断することも可能です。
2. カミソリの刃で約6cmの長さの血栓を切断します。
3. 各血栓区画をPE-50カテーテルに優しく引き込み、5回完全に排出して洗浄します。
4. 次に、PE-10カテーテル(内径:0.279mm)に優しく血栓を引き込み、15回完全に排出して洗浄します。
   注意:この工程で頻繁に断裂が見られる場合は、手術用顕微鏡や外科用ルーペで拡大鏡を使い、血栓がカテーテルの開口部に沿って吸引されているか確認してください。
5. 任意:エヴァンズブルーを使って血栓を視覚化する方法
   1. 4%エバンズブルーを1xPBS溶液に準備します。
   2. 4%エバンズブルーを200μL、1xPBSを10mLのペトリ皿に入れます。これがより濃縮された溶液 = エヴァンの青色希釈 #1。
   3. Evan's Blue Dilution #1を400μL取り、PBS1を20mL入った別のペトリ皿に混ぜます。これはエヴァンズブルー=エヴァンズブルー希釈#2の希釈溶液です。
   4. より濃縮したエヴァンズブルーペトリ皿溶液(希釈#1)に1秒置き、その後希釈したエヴァンズブルーペトリ皿(希釈#2)に移します。
6. 洗浄済み血栓1本を、空気塞栓なしでプレハブのマイクロカテーテル(内径:0.2 mm、外径:0.360 mm、長さ:300 mm、女性ルアーロックに接続)にウェット・トゥ・ウェット方式で挿入します。
   注意:このステップでは倍率(例:2.5倍ルーピー)の使用を推奨します。
7. 血栓が完全に積み込まれたら、マイクロカテーテル内に正確に5.0cm残るまで十分な額を押し出します。余分な部分をカミソリの刃で切り落とします。
   注意:負荷された血栓の長さは、望むストロークの大きさに応じて用途に応じて調整可能です。
8. マイクロカテーテルは先端から16mmの位置にマークし、総頸動脈の分岐点を越えて内腔内で進む範囲を区切る。

3. 動物手術と麻酔

1. 30:70の酸素と亜酸化窒素の混合物に4%イソフルランで麻酔を誘導し、同じガス混合物に1〜2%のイソフルランで麻酔を維持します。
2. 動物の手術中の快適さを維持するために、鎮痛薬カルプロフェンを皮下投与、アトロピンを0.05mg/kg腹腔内投与してください。
   注:多くの外科医は切開部に1.0 mLのブピバカイン(2.5 mg/mL)を注入します。
3. 直腸温度プローブで制御された温熱パッドを使い、手術中は37±0.5°Cで体温を保ちます。

4. 献血者の血液採取

1. 大腿動脈カテーテル で ドナーの血液を採取します。ドナーと受領者の生物学的性別を一致させてください。
2. 同じ日に血液を使用する場合:
   1. 1.5mLの遠心分離機チューブを3本準備します。各チューブに500μLの位置に、消えない実験用ペンで印をつけてください。
   2. PE-50チューブを3セット(各100cm)準備し、23ゲージの鈍針 で 1.0mLの注射器に接続します。
3. 血液を後で使用するために保存する場合は、小児用EDTAマイクロチューブを6本準備してください。後で使いやすくするためにキャップを緩めてください。
4. 長さ10.0cmのPE-50チューブを準備し、片端をゴム製クランプでクランプし、もう片方を鈍い面取りで仕上げます。
   1. ゴム装着クランプを作るには、標準的な止血クランプの一本をPE-100チューブとトリムに挿入して適合させます。反対側でも同じことを繰り返します。
   2. PE-50を鈍面にするには、まず端を面取り角度でカットします。次に、マイクロハサミでベベルポイントの先端を切り落とします。
      注意:挿入後に動脈の後壁を刺さないようにポイントを取り除くことが重要ですが、先端を多く取り除くと、カテーテルの斜面効果が失われて光内挿入が非常に困難になります。
5. 大腿動脈に標準的な切開を行います。
6. 動物の準備(太ももの内側を剃り)、手術台の背側横位置に構えます。70%エタノールで3回洗い、その後ベタジンや他の消毒液で1回洗いを消毒します。
7. 後ろ脚を柔らかい拘束具で広げて固定します。
8. 内ももに、鼠径部の自然なしわたみに沿って約1.5〜2cmの縦方向の切開を行ってください。この切開は大腿動脈の予想される解剖学的経路に直交します。
9. 鈍的解離を使い、慎重に大腿血管まで解剖します。大腿動脈を同じ束に通う静脈と神経から慎重に分離してください。
10. 5-0シルク結紮で大腿動脈を遠位閉塞し、縫合糸の尾部で止血剤で遠位部にわずかな緊張を与えます。
11. 大腿動脈を可能な限り近位部まで骨格化し、動脈の後腹膜起源をたどります。大腿動脈の周りに5-0シルクのループをゆるく巻き、再び尾を使って動脈の近位端に優しく緊張をかけます。この時点で絹の結び目を締めないでください。この張力が動脈切開後に止血効果をもたらします。
    注意:ループは動脈瘤クランプでさらに近位に移動させることができます。
12. 近位縫合ループから約3分の2の距離に、動脈の下にシルク縫合糸を置き、緩んだ縫合線の遠位にマイクロハサミを使って小さな動脈切開を行います。緩んだ縫合糸はカニュレーション後、腔内カテーテルを固定するために結ばれます。
13. 鋭い鉗子を使って動脈切開の上部の開口部を持ち上げ、鈍い面取りカテーテルを開口部に挿入します。カテーテルをできるだけ近側まで進めてください。
    注意:カテーテルと内側の血管壁の間に摩擦が生じる可能性があります。これに役立つ方法は2つあります。1) カテーテルの端の外側に脚の内側から漿液を塗る直前に塗ること、2) 鈍く溝のある鉗子を使って血管の外側を押さえつつ同時にカテーテルを前進させること。これにより、血管がカテーテルとともに単に前進するのを防ぎます。
14. カテーテルの先端が近位ループのほぼ先端まで進んだら、その縫合糸の尾部の張力を解きます。出血はカテーテルが血管内にしっかりとフィットすることで防ぐべきです。
15. カテーテルを十分に進めて、緩んだループがカテーテルを包み込むように締めます。カテーテルを閉塞するほど締まらないよう、優しく締めてください。また、このカテーテルセグメントがテーパー状であるため、縫合糸がカテーテルの面取りに付いていないことを確認してください。
16. ゴム製のクランプを外せ。カテーテルはすぐに血液で満たされるはずです。
17. 開放型遠心分離機管または小児用EDTAマイクロチューブに充填し、どちらの収集容器にも最大500μL以下を置きます。
18. マイクロチューブが充填されたら、大腿動脈からPE-50カテーテルを外し、近位端を結紮し、切開部を中断した5-0プロリーン縫合糸で閉じます。
19. 後で血液を使用する場合は、キャップを充填した小児用EDTAチューブに装着し、4°Cで保存してください。
20. 血栓を当日使用に備えたい場合は、上記のステップ1.2を進めてください。
21. すぐに残りの遠心分離機チューブで同じことを繰り返します。
22. 片側カテーテル治療が行われている場合、麻酔回復後に動脈献血者はビバリウムに戻されることがあります。対側大腿動脈は後でカテーテル化される可能性がありますが、両側大腿動脈カテーテル治療後はIACUCの規則に従い、ドナーは安楽死されるべきです。

5. TE-MCAo

注:TE-MCAoアプローチは、標準的なカットダウンを総頸動脈に用いています。麻酔の選択や減量療法は使用者次第です。ここでのプロトコルは、外科医がすでに総頸動脈(CCA)、内頸動脈(ICA)、外頸動脈(ECA)を分離した時点で始まります。

1. CCAを露出させ、3-0シルクリガチャーで引き戻します。ECAとICAについても同じことをしてください。
2. 結紮や焼灼を用いて後頭動脈を露出させ閉塞します。
3. 翼口蓋動脈(PPA)を露出・引き戻すか閉塞します。
   注:十分な経験があれば、このステップは省略可能です。手順を学ぶ際は必ずこのステップを行うことをお勧めします。
4. 優しく引き戻しを使い、ECAとICAを「T」字型に移動させます。
5. 上記のすべてのステップが完了した後でなければ、CCAのリガチャーは結びます。
6. ECA(Zea Longa CCAオープンメソッド¹⁰)でマイクロハサミを使って動脈切開を行います。
7. ステップ4.4.2で説明されている鈍面法を用いて、すでに装填されたマイクロカテーテルの先端(内径:0.2mm、外径:0.360mm、長さ:300mm、メスルアーロックに接続)を準備します。
8. あらかじめ血栓を装填したマイクロカテーテルをECAに慎重に挿入してください。ICA拘束ループを緩め、頸動脈分岐部で頭蓋内16mmまで頭蓋内で前進させ、頭蓋外PPAの誤カノレーションを防ぎます。
   注意:カテーテルがCCAに入りたい場合、尖った綿先端のアプリケーターで優しく圧迫することで、進行するカテーテルをICA内に向き合わせるのに役立ちます。
9. 3-0シルクでICAおよびCCAに内腔内マイクロカテーテルを固定し、締めすぎないように注意してください。
10. モーター式シリンジポンプで10 μL/分の速度で20 μLを1 mLシリンジに注入し、2分間投与します。
    注意:通常、シリンジポンプは十分な圧力がかかるまで最初は進みません。
11. 同じポンプ設定でさらに20μLの滅菌生理食塩水を注入します。
    注:レーザー斑点画像を用いた血流の研究では、20μLのフラッシュで100%の成功率が確認されました。
12. マイクロカテーテルを除去し、動脈切開部位の近位に縫合糸でECAを永久結紮します。すべての拘束ループを外してください。出血がないか注意深く観察し、必要に応じて追加の結紮で固定してください。
13. 皮膚切開部は一時的にホチキスや走行中の5-0プロリーン縫合糸で閉じます。
14. 動物を麻酔から外し、温かい回復ケージに入れます。
15. オプション:検査室では、MCA閉塞の成功を確認するためにレーザードップラーフローメトリーを使用することがあります。あるいは、24時間または48時間に磁気共鳴画像法(MRI)を受けて脳梗塞の確認と定量を行うこともあります。
    注:多くの患者は手術終了時に生理食塩水または乳酸リンガー液を皮下投与することを好みます。

6. 全身性血栓溶解症

注意:テネクテプラーゼ(TNK、1.5 mg/mL)は全身性血栓溶解用として購入される場合があります。ユーザーは他の溶菌剤を好む場合もあります。個々の50 mgバイアルは50 mLの蒸留水で再構成され、その後2.5 mLを正確に3.0 mLのバイアルに分割されます。アリコートは後で使用するために-20°Cで冷凍されることもあります。-20°Cで保存された再構成組織プラスミノゲン活性化剤の安定性は60日¹¹日です。

1. 各科目ごとに冷凍されたTNKを1つ解凍します。室温で約15分間解凍します。
2. 1ccのシリンジを使って、正確に1.5 mg/kgを抽出します。例えば、300gのラットには0.45mgが必要です。
3. 動物を再麻酔し、一時的な皮膚の閉鎖を除去してください。
4. 外頸静脈の枝を露出させてください。
   注:検査室がこの方法に抵抗がなければ尾部静脈を使うことも可能です。SPAN外科医は外部頸静脈の動員により優れているため、頸静脈の使用を好みました。これは私たちのフィラメントモデルでも日常的に行われています。
5. 30Gまたは32Gの針を使い、TNKを静脈に直接刺して投与します。
   注意:最初は3-0シルクループの間に静脈を隔離したいと考えるかもしれません。練習すれば、これは必要なくなります。
6. 切開部は中断した5-0プロリーンまたは他の吸収性の縫合糸で閉じます。
7. ステップ5.14の通り、動物をリカバリーケージに戻します。

7. 統計的手法

1. 記述統計を作成するには、正規分布の数値データには平均と標準偏差を、正規分布でないデータには中央値および四分位数の範囲を用いてください。カテゴリデータを頻度分布として提示します。仮説検定には、正規分布のパラメトリックデータに対して適切な方法でt検定またはANOVAを適用します。そうでなければ、仮説検定は行わないでください。

結果

図1:ドナー動物からの血液採取と血栓の準備。 大腿動脈カテーテルでドナー動物から血液を採取し、最大4週間保存可能またはEDTAなし(同日使用可能)を含まないマイクロ遠心分離管に移しました。血栓を準備するために、塩化カルシウム溶液を保存された血液チューブに加え、直ちにPE-50カテーテルに吸引しました。コイルされたPE-50チューブは、事前に温めたリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で37°Cの卓上オーブンで2時間培養されました。2時間後、血液充填PE-50チューブを直ちに4°Cに移して保管しました。詳細はプロトコルのセクション1を参照してください。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2: 注射のためにカテーテルに血栓を積み込む過程。(A) MCAo手術当日、血栓がPE-50チューブからPBSを含むペトリ皿に押し出されました。(B) ペトリ皿の上では、カミソリの刃で血栓を約6cmの長さに切り詰めました。(C) ThrombusはPBSで洗浄され、PE-50チューブに引き込まれて5回排出され、その後PE-10チューブに15回排出されました。(D) 凝縮されたエヴァンズブルー溶液を含むペトリ皿に血栓を移しました。(E)血栓は希釈したエヴァンズブルー溶液を含むペトリ皿に移され、プレハブのマイクロカテーテルに注入されました。(F)マイクロカテーテルはラットの内頸動脈を通過し、カテーテル先端から16mm離れたところまで進み、総頸動脈の頸動脈分岐部から通過し、モーター駆動のシリンジポンプで注入されました。詳細はプロトコルの第2節を参照してください。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

パイロットの実現可能性調査では、6つの研究室で135名の被験者を登録しました。被験者は8つの治療のいずれかにランダム化されましたが、ここではモデルの実現可能性を示すために集計データを報告します。135名の登録被験者のうち、132名(98%)でTNKが適切な用量と時間で投与されました。102人(75%)で動物の死亡がスキャン前に行われていたため、TE-MCAo検査後3日後にMRIを実施しました(24%)。3日目以前の動物の喪失は6つの検査室すべてで一貫しており(表1)、モデルは複数の拠点に展開可能であることを示しました。病変の平均±SD大きさは13±16%で、病変面積は同側半球に占める虚血および浮腫を含む)で、検査室によって若干ばらつきがありました(表2)。代表的なMR画像および死後塞栓は補足図1に示されています。

	研究所
可変	AG	DK	IW	MG	SD	YL
サンプルサイズ(N)	23	30	11	28	24	19
MRIが完成しました	19	24	9	23	14	13

表1:研究所ごとの実現可能性。研究室はオーガスタ大学(AG)、デューク(DK)、アイオワ大学(IW)、マサチューセッツ総合病院(MG)、サンディエゴ大学(SD)、イェール大学(YL)でした。登録動物数(N)とMRI検査を受けて生存した数は脳卒中後3日目に示されています。このデータはモデルの実現可能性を裏付けています。

遺跡	サンプルサイズ(N)	病変容積(%) 平均 標準差 ±	中間線シフト指数(%) 平均±SD
AG	19	11±14	11±12
DK	24	18 ± 17	19±13
IW	9	08 ±13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15±17
SD	13	14±21	19±4
YL	12	18 ± 22	14±15

表2:3日目のMRIスキャンで見られる病変の体積(部位別)。モデルの再現性を6つの研究施設で確立するため、病変容積(虚血と浮腫)および正中線シフトを比較しました。病変容積は同側半球の面積パーセントで表されます。正中線シフトは頭蓋内空間の最大幅の線形パーセントとして表されます。データは、各研究所間の異質性を裏付けています。

補足図1:代表的な画像。(A-E)TE-MCAoから48時間後に撮影されたラット脳の各種多重エコー・マルチスキャン(MEMS)画像。断面はブレグマより約1mm前方にあります。(F-J)MCA起源に詰まった塞栓の例がいくつかあります。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

我々は、多検査室による前臨床試験ネットワークSPANで使用するために、虚血性脳卒中の血栓塞栓性げっ歯類モデルを改良しました。私たちは、ドナーの血液を後で使うために保存する方法を開発し、使用される動物の数を大幅に減らしました。また、血栓塞栓の準備と手術方法を簡素化し、1日に複数のMCAo手術を実施できるようにしました。私たちの意図は、TE-MCAoが広く使われているナイロンフィラメント版のMCAoと同じレベルの快適さと手術用ボリュームを達成することです。この結果を達成するために、対面で外科医研修を2回開催し、本研究に参加した全ての外科医は、より標準的なフィラメントモデルで数か月、場合によっては数年の経験をすでに持っていました。6つの異なる研究所で実現可能性を示し、優れたプロトコル遵守を示しました。

このプロトコルを実施する際には、プロトコルの成功を決定する以下の要素を考慮する必要があります。第一に、採血時の細心の注意が血栓形成の成功に影響します。早期血栓を防ぐために、静脈血ではなく動脈血を採取すべきです。次に、必要以上に多くの血液を採取することが重要だ。時には一晩で血栓が形成されず、他の標本は失敗することもあります。第三に、カテーテルのローディングは光学的拡大鏡、例えばヘッドランプ付きの外科用ルーペ、または照明付き拡大レンズを用いて行うことを強く推奨します。第四に、CCA、ICA、ECAの慎重かつ慎重な解離が、裂傷や血管内血栓症を防ぐために不可欠です。また、分娩カテーテルが正しくICAに入ることを確認するために、PPAを視覚化することが不可欠です。第五に、血栓溶解剤の注射によるげっ歯類に悪影響が見られることは稀です。私たちの研究では、TNK注射後に血管性浮腫や末梢出血などの有害事象は認められませんでした。これは不可能というわけではありませんが、齧歯類における血栓溶解薬の全身的副作用の報告は報告されていません。このプロトコルを初めて実施する研究者は、ここで共同著者として名を連ねている研究者の一人に相談することをお勧めします。個別指導が非常に役立つと感じました。

候補治療法の試験に動物疾患モデルを選ぶ際には、薬剤が治療対象となる患者集団を正確に表現することが重要です。局所虚血性脳卒中モデルには、ローズベンガル光血栓形成モデル、皮質筆細胞動脈閉塞、立体定位エンドテリン1注射13,14,15が含まれます。これらのモデルは、予測可能な皮質領域に高度に再現性の高い病変を生み出すという利点があります。この利点により、細胞メカニズムの研究や病変位置と行動結果の相関において好まれています。コスト増加、複雑さ、再灌流成分の欠如により、薬物検査にはあまり適していません。

内管内モノフィラメントまたは血栓塞栓症を伴うMCAoは、大血管閉塞(LVO)の確立されたモデルです^10,16,17。シリコン被覆モノフィラメントモデルは実行が簡単で広く使われています。病変の位置や大きさは予測しにくいものの、大規模な薬物検査では、この異質性が有利と見なされます。なぜなら人間の脳卒中もかなり異質だからです(^18,19)。モノフィラメント法の欠点は、閉塞が生物学的に不活性であることです。患者では、血栓および血栓溶解は、トロンビン、プラスミノゲン、その他の血栓元素の放出に関連する炎症カスケードを引き起こします 20,21,22。この制限を克服するために、ウサギ、豚、犬、非ヒト霊長類の研究で血栓塞栓症のモデルが提案されています(23,24,25,26,27)。これらの研究は複雑で、一般的に専門的な知識が必要です。それでも、私たちは血栓塞栓症モデルを多検査室の前臨床試験ネットワークに適応させることを目指しました。そのため、血栓塞栓の準備を簡素化し、手術の手順を効率化し、必要な動物の数を大幅に減らすことが求められました。私たちは、優れたプロトコル遵守率(表1)と比較的安定した病変大きさ(表2)で、6つの異なる研究室で成功裏に展開可能な血栓塞栓モデルTE-MCAoを考案しました。スループットは十分で、週平均6名の被験者を扱っていました。

役立つトラブルシューティングのステップがいくつかあります。血液が血栓に失敗することがプロトコル失敗の最も一般的な原因であり、手術台に置かれた場合にEDTAやヘパリンによる調製カテーテルの汚染が主な原因です。私たちは厳格な収集手法を推奨します。また、EDTAを不活化させるために使う塩化カルシウム溶液を毎週または隔週で準備することも推奨します。準備カテーテルから血栓を溶出した後、必要な5cmの断片に血栓を切断するのは難しい場合があります。一部の血栓は脆く、簡単に骨折しやすいです。血栓は光学拡大鏡で準備し、極端な場合は別のドナー血栓に移ることを推奨します。誤嚥および溶出の血栓の処理には中程度の技術が必要です。したがって、かなり長いトレーニング期間を推奨しています。吸引カテーテルの先端に引っかかりがないか光学的拡大で確認してください。血栓はインプラントカテーテル内に詰まることがあり、吸引と洗出を穏やかに交互に行うことをお勧めします。典型的なMCAoフィラメントモデルに慣れた外科医にとって、PPAの特定は新たなステップかもしれません。カテーテルがICAを通過する際に追跡し、エヴァンズブルーで血栓をラベル付けすることを強くお勧めします。ICA/PPAの分岐は、ICAの後に慎重かつ深く解離することで容易に特定でき、内頸動脈の細い枝まで確実に位置します。

このプロトコルにはいくつかの制限があります。齧歯類頸動脈のカニュレーションを行うには外科的な技術が必要です。しかし、これはフィラメントモデルにも当てはまります。血栓の取り扱いにも外科的な技術が必要です。すべての血栓塞栓モデルと同様に、フィラメントモデルに比べて梗塞の成功率は低いです。調査の目的がより頻繁な梗塞の発生であれば、フィラメントモデルが望ましいでしょう。一方で、血栓と血栓溶解の再現が目的であれば、このモデルは望ましいです。

このモデルは、血栓と血栓溶解を忠実に用いるモデルを用いて、候補的な脳保護剤の試験を目的としています。今後の方向性としては、リフローなし現象を標的とした補助療法の研究も考えられます。多くの人がこの目的のために抗凝固剤や抗血小板薬を提案しています。

結論として、ここで紹介するTE-MCAoプロトコルは複数の研究室での展開を可能にするよう適応されています。血栓の準備を簡素化し、手術のアプローチも効率化しました。私たちはドナーの血液を保存する方法を考案し、必要な動物の数を大幅に減らしました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mlシリンジ	BD	309628
10倍ルーペ
1ccシリンジ	照も	SS-01T
23gの鈍針	グレンジャー	5FVK7
3.0ccシリンジ	BD	309656
3-0シルクリガチャー
30gの針	BD	305128
5-0プロリーン縫合	エティコン	8698	皮膚の切り口を閉じるために
5-0シルクリガチャー	エティコン	A182
動脈瘤クランプ
硫酸アトロピン	獣医1	NDC86136-006-10	気管支分泌物を減らす
鈍溝鉗子
ブピバカイン	ゼリア・ファーマシューティカルズ	NDC70594-118-01	局所麻酔
塩化カルシウム	シグマ	C7902
カープロフェン	ゾーティス社	NADA #141-199	鎮痛剤
遠心分離機チューブ	エッペンドルフ	22364111	採血のために
エタノール	コプテック	UN1170
エヴァンs ブルー	シグマ	E2129
ヒートパッド	ハーバード・アパラタトゥス	K021-435
止血クランプ
イソフルラン	獣医1	NDC13985-528-60
メイド・バイ・ミー アルティメット・ウィービング・ループ	ホライゾン・グループ	該当しません	ソフト拘束具
マイクロシザー	F.S.T.	15000-00
マイクロカテーテル	ドクコール・コーポレーション	PE-FL-360-200-300	プレハブ注入カテーテル
PE-10カテーテル	BD	427401
PE-100チュービング	イントラメディック	7426
PE-50チュービング	BD	427410
小児用EDTAチューブ	BDマイクロテイナー	K2E-363706	ドナーの血液を保存
ペトリ皿	エッペンドルフ	30702115
リン酸塩緩衝塩水	フィッシャー	B2438
プレヴァンティック	PDI株式会社	NDC10189-1080-1	消毒薬
綿棒	VWR	89031-288
カミソリの刃	AccuTec Pro	71960
生理食塩水	ホスピラ社	NDC 0409-4888-02
ハサミ	F.S.T.	14958-11
鋭い鉗子
シリンジポンプ	ニューエラ・ポンプス株式会社	BS-300
卓上オーブン	ブーケル	132000
テネクテプラゼ(TNK)	ジェネンテック、サンフランシスコ	NDC50242-120-47	血栓溶解
耳タグ	カリフォルニア州サンフランシスコのRapIDラボ、	RapIDタグ