遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの

運命地図は、生体内で細胞を標識し追跡することで、前駆細胞が発達中および成体の組織において特定の構造や細胞型にどのように寄与するかを決定することによって作成されます。この概念を進展させたのが、遺伝学的誘導性運命地図作成（GIFM）であり、生体内での遺伝子発現状態と細胞挙動を関連付けることで、遺伝学的系統に基づいた運命地図を作成します。こんにちは、ブラウン大学のマーク・サービス研究室および分子生物学・細胞生物学・生化学科のデボラ・エリスです。

本日、同僚のAshley Brown、Liz Norman Neen Hagen、Steve Brownと共に、遺伝学的誘導性運命マッピングの手順を実演します。私たちは研究室で、初期の脳発達を研究するためにこの手順を用いています。また、この手法を遺伝子不活性化研究やヒト疾患の動物モデルにも適用することが可能です。

それでは始めていきましょう。X cre, E-R-M-G-F-P 胚において、MGFP LAEはグレーの楕円で示されるすべての細胞に存在するレポーターアレルです。X cre, erにおいて、Xは遺伝子調節エレメントを表します。C ERの発現制御は、青色で示される遺伝子Xの発現ドメインに空間的に限定されており、CRE ERタンパク質はHSP 90によって細胞質に隔離されています。

タモキシフェンが存在しない場合、レポーターはオフの状態になります。タモキシフェンを投与すると、CERがHSP 90から放出されて核へ移行し、レポーターアレルからストップカセットを除去するため、ドメインXにおいて運命マッピングされた細胞が現れます。永続的かつ遺伝的な組み換えにより、細胞は恒常的にMG FP LA Zを発現します。レポーターアレルCERとタモキシフェンの組み合わせによりマーキングが行われ、胚の原始的な脳領域において遺伝子発現に基づき最初にマーキングされた細胞集団は、CERを駆動した初期の遺伝子発現が消失した後でも、これらの運命マッピングされた細胞として追跡することが可能です。

このようにして、遺伝的に定義された細胞系統の最終的な分布と末端運命を成体において特定することができます。本手順は、20 mg/mL のタモキシフェンストック溶液の調製から始まります。ガラス製の吸入バイアルの中で、タモキシフェン 200 mg をあらかじめ加温したコーンオイル 10 mL に溶解させます。

その後、溶液をTatorボルテックスを用いて37 °Cで2時間インキュベートします。調製したタモキシフェンストック溶液は、バイアルをアルミホイルで包んで遮光し、4 °Cで保存してください。このストック溶液は最大1か月間使用可能です。

運命マッピング実験のために、野生型Swiss Webster雌と、遺伝子特異的なCreERアレルおよびレポーターアレルの両方を保持する雄からなる交配ペアを確立します。本デモンストレーションでは、win to one CreER MG FP雄を使用します。Swiss Webster雌を毎朝確認し、膣栓（vaginal plug）の有無をチェックしてください。

膣栓が確認された日の朝を交配後0.5日とし、タモキシフェンの投与日を算出します。本実験のこの起点に基づき、タモキシフェンは胚発生8.5日目に投与します。動物用経口投与針付きの1 mLシリンジを用いて、タモキシフェンストック溶液を200 µL分注します。

タイミングを合わせた妊娠中のSwiss Webster雌マウスの項と背中をしっかりと掴んで頭部を固定し、腹側が上になるようにマウスを仰向けにします。空いている指で尾を保持し、体を一直線に保ちます。次に、経口投与針を口の隅に挿入し、針先がほぼ目の位置に来るまで、口蓋と平行になるようにゆっくりと針を誘導します。

頭部をそっと後傾させ、食道へのアクセスを確保します。針を会厭を通り、食道に沿って胃に向かって進めます。気管に進入しないよう注意してください。

給餌針を胃に挿入したら、タモキシフェンを投与し、針を抜きます。その後、解剖日まで雌をホームケージに戻します。解剖日に、タイミングを合わせた妊娠雌からE 12.5胚を摘出し、GFPマーキングを確認します。

GFP陽性胚において、wind one由来のニューロンが中脳、後脳、および脊髄に寄与していることが観察されます。MG FPレポーターは軸索投射を標識しており、これらはPPSを含むペトリ皿にGFP陽性胚をホールマウントで移し、写真撮影用フレームを用いて撮影することで確認できます。胚の撮影後、ピンセットで各胚の尾部を少量切り取り、それぞれの断片をPCRチューブに入れます。これらの組織に対し、両アレルを標的としたPCRによるジェノタイピングを行い、ホールマウント解析で得られた結果を確認します。

以下の手順により、開頭術を開始する前に、胚領域由来の標識細胞が成体脳にどのように分布しているかを解析することができます。足先をつねり、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認します。Nembutalで麻酔をかけた後、切開を行い、肋骨から心臓へアクセスします。

次に、バタフライ針を心尖部または左心室に挿入し、Cクランプで固定します。ハサミで右心房に流出孔を作成し、液体が透明になるまで10から15 millilitersの氷冷生理食塩水で灌流します。続いて、20から25 millilitersの4%パラホルムアルデヒドを灌流します。

心腔内灌流が完了したら、肩のすぐ上の脊柱を切断し、ハサミで頭部を取り出します。頭部の背側正中線に沿って、吻側から尾側に向かってメスで切り込みを入れ、頭皮を切開して頭蓋骨を露出させます。メスを用いて、頭蓋骨の側面および後面の余分な組織や筋肉を掻き出します。

ピンセットを用いて、嗅球のすぐ吻側の中線上で頭蓋骨を穿刺し、精密剪刀の先端が入る小さな穴を開けます。この穴に精密剪刀を挿入し、中線から嗅球の長さに沿って左右両側に2本の切開を加えます。この切断により、鼻骨と前頭骨の接合部で頭蓋骨が分断され、剪刀によるアプローチが容易になります。

頭蓋骨の正中縫合に沿って切開します。その際、下層の組織を損傷しないよう、ハサミの先端を脳から遠ざける角度に保つようにしてください。次に、ピンセットで頭蓋骨をそっと掴み、正中切開に沿って骨を剥がして脳を露出させます。頭蓋骨は小さな破片となって欠けたり、大きな塊となって剥がれたりすることがあります。

さらにピンセットを使用して、前頭頂骨、間頂骨、および後頭骨をすべて除去します。小脳の高さの脳の外縁に沿って位置する傍眼骨を、両側の球状の骨を軽くつまむようにして取り除きます。はさみを用いて、脳幹を囲む骨の背側部分を注意深く切断します。

ハサミの片側を骨の背側縁の直下に挿入し、脊髄を切断した位置から小脳に向かって切断します。これにより、脳幹と小脳を露出させます。ピンセットを用いて、脳幹周囲に残っている骨を取り除きます。

骨を慎重に剥がし、頭部を背側が下になるように向け、ピンセットを使用して脳神経を切断し、脳を頭蓋骨から取り出します。脳を氷を入れたペトリ皿に入れます。冷却したPPSを用い、蛍光解剖顕微鏡を使用して成体脳のGFP標識を確認し、ピクチャーフレームを用いて撮影します。

この例では、中脳がGFPで標識されており、胚発生期の系譜解析に加えて、成体におけるGIFMを、マイクロダイセクションや組織外植え実験など、発生生物学で一般的に用いられる他の手法と組み合わせることが可能です。例えば、腹側中脳はwind one遺伝子を発現するドーパミン神経細胞の発達における前駆細胞領域です。したがって、マイクロダイセクションによって腹側中脳を単離することで、その発達をさらに調査するためのin vitro環境を構築することができます。

これは、遺伝的履歴によって定義される目的の前駆細胞領域を単離するためにGIFMを使用する一例に過ぎません。この手順を開始するには、事前に特定したGFP陽性胚を、細い鋏を用いて細胞培養皿内の氷冷滅菌PBSに移します。胚の頭部を横方向に切断して取り除きます。

次に、頭部の吻側部分を頭冠面で切断して取り除きます。これにより、第四脳室から中脳胞にかけて、背側組織と腹側組織を結ぶ管状の構造が露出します。ハサミの先端を第四脳室に慎重に挿入し、背側正中線を沿って尾側から吻側へ切り開き、チューブを完全に開放してオープンブック標本作製を行います。

次に、中脳の腹側を内側に向かって露出させます。中脳の背側の2つの半分は外側に配置されますが、腹側中脳の下にある残りの非神経組織を除去する必要がある場合があります。切除組織を平らに置くためには、背側中脳が羽、菱形質（rhombomere 1）が尾に見える、蝶のような形状にする必要があります。

腹側中脳をさらに単離して、fax解析や細胞培養実験に用いるには、組織の外側部分を除去します。次に、GIFMの代表的な結果をいくつか示します。この実験では、E 8.5までにマークされたWINT one発現細胞を可視化し、wint one直接細胞が発達過程を通じてどのように神経構造に寄与するかを決定します。

例えば、E 12.5のWnt1-CreER MG FP胚では、主に中脳、後脳後部、および脊髄にGFP蛍光が認められます。高倍率では、微細な神経突起が中脳、体壁、肢、および頭顔面領域に神経支配を伸ばしている様子が観察されます。標識された細胞は、免疫組織化学染色によって細胞レベルで可視化および解析することも可能です。E 8.5にタモキシフェンを投与して標識したE 12.5胚の厚さ1 µmの光学切片に示すように、核内β-ガラクトシダーゼ抗体による赤色の標識とGFP抗体による緑色の標識は、腹側中脳における運命マッピングされた細胞を示しています。

ここでは、成体脳における条件付きMGFPリポーターの性質により、細胞がダブルポジティブとなっています。成熟組織の密度が高いため、脳内部構造から発せられるGFP蛍光が遮られる可能性があります。したがって、成体のCUI上部を全層蛍光顕微鏡で観察すると、わずかなGFP蛍光しか検出されません。

成体切片における低倍率顕微鏡観察により、E 8.5で標識された1つのリネージは、上丘および下丘を含む中脳構造に分化することが明らかになりました。ドーパミン作動性ニューロン近傍の中脳腹側から撮影したこの高倍率画像では、核内β-カテニン陽性細胞と、豊かなGFP陽性の軸索叢が確認できます。対照的に、E 9.5での標識は実質的なGFPラベル化をもたらし、ホールマウント蛍光観察により中脳の下丘で容易に観察されます。成体切片におけるE 9.5で標識されたWnt1リネージは、低倍率顕微鏡観察で示されるように、下丘に集中しています。

ドーパミン作動性ニューロンの腹側中脳から撮影したこの高倍率像では、核β-ガラクトシダーゼ陽性細胞と、豊かなGFP陽性軸索叢が観察できます。したがって、E 8.5由来のニューロンはE 9.5と比較して背側中脳への寄与が徐々に制限される一方で、WIN1リネージュは腹側中脳への寄与を維持していることがわかります。

以上の手順で、in vivoで細胞系譜を標識し追跡するための遺伝学的誘導性運命マッピングの手法について解説しました。これにより、遺伝的な系譜に基づいて細胞を標識し、遺伝子発現が消失した後でも、時間の経過に伴う細胞の追跡が可能になります。タモキシフェンを8.5日で投与することにより、wit 1ドメインが成体の中脳全体に加えて、発達中の中脳にも寄与していることを示しました。

対照的に、wit oneドメインが制限される9.5日目にタモキシフェンを投与すると、胚発生中の発達中の中脳への寄与がより制限され、その状態が成体まで持続します。この手順を行う際は、本システムが細胞をモザイク状に標識するため、特定の構造内のすべての細胞が標識されるわけではないことに留意することが重要です。これは、使用されているCRE erラインまたは条件付きレポーターアレルに起因すると考えられます。

重要な点として、細胞の標識はモザイク状になりますが、標識細胞（mar cells）のパターンと分布は極めて再現性が高いことが挙げられます。タモキシフェンの投与については、腹腔内投与に比べて経口ゾンデ投与の方が、腹腔内の炎症および胚への機械的損傷を最小限に抑えられるため有利であることが分かりました。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。