Name: 遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぶ遺伝子誘導的運命マッピング（GIFM）を用いた細胞系統追跡法。マウスE12.5胚でWnt1発現細胞を標識し、蛍光解析で脳発生における前駆細胞の寄与を解明する強力な手法です。

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我々はMGFPのマウスのS.アーバーへと批判的に論文を読み、技術支援を提供ゼルバスの研究室のメンバーに感謝しています。 A.ブラウンは、脳科学カプランサマー大学院研究賞によってサポートされていました。 E.ノルマンは、脳科学研究プログラムの大学院研究賞によってサポートされていました。この研究はまた、スタートアップ研究資金（MZ）によって賄われていた。

タモキシフェンの準備と強制経口投与手順（E8.5） <ul><li>予め温めておいたコーン油にタモキシフェンを溶解することによりタモキシフェンの20 mg / mlのストック溶液を調製。 </li><li> 37ソリューションをインキュベート° C nutatorと断続的にボルテックスで2時間。 </li><li> 4の光、店舗° Cからタモキシフェン株式を保護し、一ヶ月までに使用。 </li><li>と遺伝子特異的クリアーT対立遺伝子とレポーターの対立遺伝子の両方を運ぶ男性の、運命のマッピングの実験のために、スイスウェブスター女性（タコニックから購入した野生型）で構成される繁殖のペアを確立する。 MGFP男性（Ellisor 2009）、デモンストレーションの目的のために、我々はWnt1 -クリアーTを使用しています。 </li><li>膣栓の外観のために毎朝スイスウェブスターの女性を確認してください。膣栓が0.5日後に性交と見られている日の朝（0900）を指定し、この出発点に基づいて、タモキシフェン投与の日付を計算する。 （この実験では、胎生8.5が使用されていた）。 </li><li>タモキシフェンのストック溶液（4 mgのタモキシフェン）の200μlを描画するために動物給餌針（20G X 1-1/2）1 mlシリンジを使用してください。 </li><li>しっかりと首の首筋をつかんで、時間妊娠スイスウェブスターの女性を抑制し、後頭部を固定し、腹側が上を向いているように裏返しますする。 </li><li>直線でボディを保つために無料の指の間に尾を保持する。 </li><li>口の端に送り針を置き、ゆっくりと口の屋根に沿って針を導く。 </li><li>それは首をまっすぐに戻すと同時に傾斜ヘッドながら、ボディと平行になるように針を回転させる。 </li><li>胃に向かって、食道の下方に針を導く。気管を入力しないように注意してください。針の抵抗、動物の咽頭反射が作動、またはマウスが闘争場合がある場合は、直ちに針を削除し、再度強制経口投与をしてみてください。 </li><li>送り針が胃になると、胃にタモキシフェンを投与し、解剖の日まで彼女の家のケージにメスを返します。 </li></ul>開頭術： <ul><li> Intracardially 4％PFAで成人の運命マッピングされたマウスを灌流し、ちょうど肩の上に脊柱を介してカットしてハサミで頭部を削除します。 </li><li>頭皮を切ってとスカルを公開するために、頭（尾に尾側）の背側正中線に沿ってメスを実行します。 </li><li>メスを使用して、頭蓋骨の側面と後部に沿ってから余分な組織や筋肉を削り取る。 </li><li>鉗子、穿刺だけで嗅球への吻側と細かいハサミの先端に対応するために小さな穴を作成正中線で頭蓋骨を持つ。 </li><li>この穴に素晴らしいはさみを挿入し、嗅球の外側約長さの切開を内側にします。このカットは、鼻の骨や前頭骨の交差点で頭蓋骨を切断し、はさみのための良好なアクセスを提供します。 </li><li>基盤となる組織の損傷を防ぐために、離れて脳からの角度、はさみのヒントをように注意しながら頭蓋骨の矢状縫合（背側正中線）に沿ってカット。 </li><li>ゆっくりと鉗子と皮離れて脳を露出させる内側の切開に沿って骨と頭蓋骨を把握する。頭蓋骨が小さな部分で、オフチップ以上のセクションに離れて壊れる可能性があります。前頭葉、頭頂葉、頭頂間、および後頭の骨のすべてを削除するには、鉗子を使用し続ける。 </li><li>両側に球状の骨をつまんでparaflocculiを（小脳のレベルでの脳の側縁に沿って位置）包む骨をクラック。ゆっくりと骨を引き離します。 </li><li>上下逆さまに頭を回して（下に背側）と脳神経を切断し、頭蓋骨から脳を解放するために鉗子を使用する。 </li></ul>全体のマウント顕微鏡：大人の脳<ul><li> GFPは、蛍光解剖スコープを使用してマーキングするために成人の脳を評価する。 </li><li> PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に脳を転送する。 </li></ul>全体のマウント顕微鏡：E12.5胚<ul><li>蛍光解剖スコープを使用してGFPマーキングのための全体のマウントの胚を評価する。 </li><li> PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に全部マウントして正のGFPであるものを転送します。 </li><li>各胚から尾の小片をオフに挟まないように鉗子を使用して、組織全体のマウント解析から見たときの結果を確認するために、両方の対立遺伝子のPCR（Ellisor 2009）を使用してPCRチューブおよび遺伝子型の各ピースを置きます。 </li></ul>顕微解剖およびE12.5胚から腹側中脳の外植片の準備<ul><li>子宮チェーンとIDから解剖以下ホールマウント蛍光、細胞培養皿の氷冷滅菌PBSに転送胚によって運命にマップされた胚のentification。 </li><li>細かいハサミを使用して、rhombomere 1〜尾横切断胚の頭部の部分を、削除してください。 </li><li>次に、間脳を介して冠状カットで頭の吻側部を削除してください。これは、背側と腹側の組織の間の導管中脳胞の形態を通じて第四脳室にチューブ状の構造を公開します。 </li><li>慎重に、"オープンブック"の準備を作成し、完全にチューブを開いて、吻側に尾側、背側正中線に沿ってはさみ第四脳室へのヒント、およびスニップを挿入します。中脳の二つ背側半分が横方向に配置される間、腹側中脳は、現在、内側に公開されます。 </li><li>もっときっぱりとレイアウトする組織のためのために、腹側中脳の下に残りのすべての非神経組織を削除します。なる必要がある場合は、外植片の背側"翼"だけでなく、平らになりますように吻側および尾側の面にノッチを作る。外植片は、今、"背側中脳の翼を表している蝶、、とrhombomere 1尾のようになります。 </li><li>さらにFACS解析や細胞培養実験の腹側中脳を単離するために、組織の外側（背側面）を取り外します。 </li></ul>代表的な結果： このGIFM実験では、Wnt1発現細胞は永久にとheritably E8.5にWnt1 - CreERTでタモキシフェンを投与することにより、胚発生中にマークされています。MGFPの胚。その後、これらの顕著な細胞はWnt1由来細胞は、開発全体の神経構造に貢献する方法を決定するために全体のマウントの蛍光とセクション免疫組織化学を介して可視化しています。全体のマウント蛍光はMGFPレポーターの膜結合型GFPのコンポーネントに依存し、従って細胞の情報だけでなく、Wnt1由来神経突起の包括的なビューを提供します。主に中脳、後脳後部と脊髄でのE12.5展示GFPの蛍光でE8.5、Wnt1 - CreERTmGFP胚（図1A）でのタモキシフェン投与で、例えば。高倍率で、微細な神経細胞の突起は、中脳、体壁、四肢、および頭蓋顔面領域の神経支配見られている。この発達段階では、胚が透明で、内部のGFP標識は容易とに識別です。しかし、脳の発達として、成熟した組織の密度は、内部の脳の構造から発生するGFPの蛍光をあいまいにしています。したがって、E8.5でのタモキシフェン投与で、わずかなGFP標識は、全体のマウント蛍光（図1C、はめ込み）による成人の上丘で観察される。また、一部の軸索突起（図示せず）後脳の腹側表面に沿って走ること見られている。これとは対照的に、タモキシフェンがE9.5で投与されている場合、実質的なGFP標識は、全体の下丘（図1B、挿入図）を通じて行われます。全体のマウントの蛍光の増加は、E9.5でWnt1発現細胞は背側中脳の表面的な地域に、より大きく寄与するまたはE8.5からWnt1発現細胞よりも、この領域内に複数のプロセスを拡張することを示している可能性があります。関係なく、全体のマウントでこの違いは、蛍光は開発中のWnt1発現の動的な性質を反映しており、GIFMが成熟した大人に胚から別個の細胞集団を追跡するために使うことができる方法を示しています。 Wnt1 - CreERTから免疫組織化学、運命マッピングされた組織切片で、MGFPの動物は、細胞レベルで分析される。 GFP、β-ガラクトシダーゼ（β- gal）に対する抗体は、神経構造と細胞タイプへWnt1系統の微細細胞の寄与を決定するために組織特異的バイオマーカーの様々な組み合わせで使用されています。 E12.5においてE8.5でのタモキシフェン投与と組織の分析で、二重陽性細胞（GFP +とβ- galを+は）腹側中脳（図1B）を介して走ることの突起を持つ中脳と後脳全体に観察される。成人の脳で、E8.5でマークWnt1系統は腹側被蓋野のドーパミン作動性細胞集団の近くでだけでなく、優れたと下丘を含む多くの脳の構造を生じさせると黒質（図1D）（参照してくださいまたゼルバス2004）。対照的に、E9.5でマークWnt1 -系統は、ドーパミン作動性細胞集団（図1F）の近傍のニューロンにだけでなく、下丘を生じさせる。 <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 Wnt1 -運命のマッピングのための代表的な結果。： MGFP胚及びE8.5（AD）で（マーク）マップされた成人の脳の運命、ホールマウントとWnt1 - CreERTにおける免疫細胞化学結果の例とE9.5（EF）。 A. Wntシグナル1 -クリアー、主に中脳でのE12.5展示GFPの蛍光でMGFP胚（MB）、後方後脳（ヘモグロビン）と脊髄（Sp）を。 B.マーク細胞が可視化し、この1 -μmの厚さの光学部（40倍目標、Zシリーズの買収）に示すように、免疫組織化学により細胞レベルで分析した。 （nβ- gal）のβ-ガラクトシダーゼ核抗体標識（赤）とGFPの抗体標識（緑）は腹側中脳に示すように運命にマップされた細胞を示す。ここでは、組換え細胞がため、条件付きMGFPレポーターの性質の（nβ- GAL + / GFP +）ダブルポジティブです。 C.ホールマウント蛍光顕微鏡では大人の上丘（SC）（挿入図）でのかすかなGFPの蛍光を明らかにする。低倍率（5倍）顕微鏡で大人のセクションでE8.5でマークWnt1系統の評価は、Wnt1の系統が（IC）（SC）スーペリア、下丘（C）を含む中脳の構造を生じさせることがわかります。 D.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 E.は、容易に全体のマウント蛍光（挿入図）で中脳の下丘で観察される実質的なGFPの標識E9.5の結果でマーキング。低倍率（5倍）顕微鏡（E）で見られるような大人のセクション（β- galの+、赤）にE9.5でマークWnt1の系統は、下丘（背後部中脳）に集中している。 F.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 Wnt1の系統は腹側中脳への貢献に持続する間E8.5対E9.5でマークWnt1由来のニューロンが徐々に、背側中脳への貢献を制限されます。

<ol><li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li>
<li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li>
</ol>

すべての著者はこの作品にも同様に貢献し、アルファベット順にリストされています。各個人の貢献は、ビデオの記事で彼または彼女の参加によって明らかである。

我々が証明したというGIFMシステムは、細胞プロセスのさまざまな問題の広い範囲に答えるために使用することができます。例えば、異なるCreをドライバで改変マウスは、任意の細胞型、組織または興味の遺伝系統を対象とするために使用することができます。タモキシフェンは、任意の胚または出生後の時点で投与することができるので、さらに、組換えは、関連する発達段階をターゲットとすることができます。このシステムの空間的および時間的な制御は、特定の遺伝子を発現する細胞は、興味だけでなく、開発中の細胞の遊走およびパターニングイベントの構造や地域に貢献する方法を調査するのに最適です。 単に免疫組織化学（図1）によって細胞をマーキングし、可視化に加えて、GIFMの方法論は様々なアプリケーションに使用することができます。条件的ノックアウト対立遺伝子とGIFMを組み合わせることにより、遺伝の機能喪失は、時間的および空間的に同時にレポーターの対立遺伝子でマークされている関連する細胞集団、をターゲットとすることができます。また、運命にマップされた動物から採取した組織は、物理的に別個の集団にレポーター遺伝子または特定の...

遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの</em

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

運命のマップは、前駆細胞が開発し、成体の組織に固有の構造と細胞型に寄与する方法を決定するために生体内で細胞をマーキングして追跡することによって生成されます。このコンセプトの進歩は、 私は遺伝系統に基づいて、運命のマップを作成するには、Fは、遺伝子発現、細胞の運命、およびin vivoでの細胞の挙動を結ぶ、M apping（GIFM）を食べたnducible G eneticです。 Xは、修正されたバクテリオファージのタンパク質、Creリコンビナーゼ（ クリアーT）の空間的な発現を付与する遺伝子調節エレメントの遺伝子またはセットです。 クリアーTはクリアーTをレンダリングされた電子 strogen R eceptorのリガンド結合ドメインを含むGIFMエクスプロイトX -クリアーライン薬のタモキシフェンの存在下で細胞質に隔離。 loxP部位によって挟まれたDNA配列の間の核と仲介の再結合に移行しタモキシフェンリリースクリアーT、の結合。 GIFMでは、組換えは一般的にGFPなどのレポーター遺伝子の前にカセットを停止両側にloxP部位の間で発生します。 マウスは、地域、または細胞型特異的クリアーと条件レポーターの対立遺伝子のいずれかを含むように飼育されています。レポーターの停止カセットは、レポーター遺伝子のさらなる転写を防止するため未処理マウスは、マーキングしていないだろう。我々は、レポーターからストップカセットを取り外す核にクリアーTリリースの時間的制御とその後の転座を提供するタイムアウト妊娠女性への強制経口投与でタモキシフェンを投与する。再結合に続いて、レポーターの対立遺伝子は構成的であるとheritably表明した。この一連のイベントは、彼らの遺伝的履歴が消えないように記録されるようにセルをマークします。組換えレポーターは、このように最初にクリアーのTを駆動するために使用される遺伝子発現から切り離され、一度で、高忠実度遺伝子系統のトレーサーとしての役割を果たします。 我々は、成体細胞型や組織への遺伝的系統の正常な発達と把握するの貢献を研究するためにマウスでGIFMを適用します。我々はまた、より良い人間の遺伝疾患の顕著な特徴を模倣する複雑な表現型を理解するために変異体の遺伝的背景のセルに従うことをGIFM使用。 実験的な手法を通じて、このビデオの記事では、ガイドの研究者をうまくGIFMを適用する。日胚でタモキシフェンを投与することによって、MGFPマウス（E）8.5落射蛍光実体顕微鏡で12.5日で解剖し、分析に続いて強制経口投与を介して、私たちは、よく特徴付けWnt1 -クリアーTを用いる方法を示しています。我々はまた、外植片の準備またはFACS分析のために運命マッピングされたドメインをマイクロ細かく分析し、全体のマウント蛍光イメージングのために成人の運命マップの脳を解剖する方法を示します。総称し、これらの手順は、研究者は、発生生物学と疾患モデルの重要な質問に対処することができます。

遺伝的誘導フェイトマッピング（GIFM）マークと細かい空間的、時間的な制御を持つトラックの細胞<em&gt; in vivoで</em&gt;と、特定の遺伝系統の細胞が開発し、成体組織に貢献する方法解明。ここに示さ落射蛍光と植分析のために運命マップE12.5マウス胚に必要なテクニックがあります。

運命地図（フェイトマップ）は、生体内で細胞を標識し追跡することで、前駆細胞が発達過程における特定の構造や細胞型にどのように寄与するかを決定することによって作成されます。

運命地図は、生体内で細胞を標識し追跡することで、前駆細胞が発達中および成体の組織において特定の構造や細胞型にどのように寄与するかを決定することによって作成されます。この概念を進展させたのが、遺伝学的誘導性運命地図作成（GIFM）であり、生体内での遺伝子発現状態と細胞挙動を関連付けることで、遺伝学的系統に基づいた運命地図を作成します。こんにちは、ブラウン大学のマーク・サービス研究室および分子生物学・細胞生物学・生化学科のデボラ・エリスです。本日、同僚のAshley Brown、Liz Norman Neen Hagen、Steve Brownと共に、遺伝学的誘導性運命マッピングの手順を実演します。私たちは研究室で、初期の脳発達を研究するためにこの手順を用いています。また、この手法を遺伝子不活性化研究やヒト疾患の動物モデルにも適用することが可能です。それでは始めていきましょう。X cre, E-R-M-G-F-P 胚において、MGFP LAEはグレーの楕円で示されるすべての細胞に存在するレポーターアレルです。X cre, erにおいて、Xは遺伝子調節エレメントを表します。C ERの発現制御は、青色で示される遺伝子Xの発現ドメインに空間的に限定されており、CRE ERタンパク質はHSP 90によって細胞質に隔離されています。タモキシフェンが存在しない場合、レポーターはオフの状態になります。タモキシフェンを投与すると、CERがHSP 90から放出されて核へ移行し、レポーターアレルからストップカセットを除去するため、ドメインXにおいて運命マッピングされた細胞が現れます。永続的かつ遺伝的な組み換えにより、細胞は恒常的にMG FP LA Zを発現します。レポーターアレルCERとタモキシフェンの組み合わせによりマーキングが行われ、胚の原始的な脳領域において遺伝子発現に基づき最初にマーキングされた細胞集団は、CERを駆動した初期の遺伝子発現が消失した後でも、これらの運命マッピングされた細胞として追跡することが可能です。このようにして、遺伝的に定義された細胞系統の最終的な分布と末端運命を成体において特定することができます。本手順は、20 mg/mL のタモキシフェンストック溶液の調製から始まります。ガラス製の吸入バイアルの中で、タモキシフェン 200 mg をあらかじめ加温したコーンオイル 10 mL に溶解させます。その後、溶液をTatorボルテックスを用いて37 °Cで2時間インキュベートします。調製したタモキシフェンストック溶液は、バイアルをアルミホイルで包んで遮光し、4 °Cで保存してください。このストック溶液は最大1か月間使用可能です。運命マッピング実験のために、野生型Swiss Webster雌と、遺伝子特異的なCreERアレルおよびレポーターアレルの両方を保持する雄からなる交配ペアを確立します。本デモンストレーションでは、win to one CreER MG FP雄を使用します。Swiss Webster雌を毎朝確認し、膣栓（vaginal plug）の有無をチェックしてください。膣栓が確認された日の朝を交配後0.5日とし、タモキシフェンの投与日を算出します。本実験のこの起点に基づき、タモキシフェンは胚発生8.5日目に投与します。動物用経口投与針付きの1 mLシリンジを用いて、タモキシフェンストック溶液を200 µL分注します。タイミングを合わせた妊娠中のSwiss Webster雌マウスの項と背中をしっかりと掴んで頭部を固定し、腹側が上になるようにマウスを仰向けにします。空いている指で尾を保持し、体を一直線に保ちます。次に、経口投与針を口の隅に挿入し、針先がほぼ目の位置に来るまで、口蓋と平行になるようにゆっくりと針を誘導します。頭部をそっと後傾させ、食道へのアクセスを確保します。針を会厭を通り、食道に沿って胃に向かって進めます。気管に進入しないよう注意してください。給餌針を胃に挿入したら、タモキシフェンを投与し、針を抜きます。その後、解剖日まで雌をホームケージに戻します。解剖日に、タイミングを合わせた妊娠雌からE 12.5胚を摘出し、GFPマーキングを確認します。GFP陽性胚において、wind one由来のニューロンが中脳、後脳、および脊髄に寄与していることが観察されます。MG FPレポーターは軸索投射を標識しており、これらはPPSを含むペトリ皿にGFP陽性胚をホールマウントで移し、写真撮影用フレームを用いて撮影することで確認できます。胚の撮影後、ピンセットで各胚の尾部を少量切り取り、それぞれの断片をPCRチューブに入れます。これらの組織に対し、両アレルを標的としたPCRによるジェノタイピングを行い、ホールマウント解析で得られた結果を確認します。以下の手順により、開頭術を開始する前に、胚領域由来の標識細胞が成体脳にどのように分布しているかを解析することができます。足先をつねり、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認します。Nembutalで麻酔をかけた後、切開を行い、肋骨から心臓へアクセスします。次に、バタフライ針を心尖部または左心室に挿入し、Cクランプで固定します。ハサミで右心房に流出孔を作成し、液体が透明になるまで10から15 millilitersの氷冷生理食塩水で灌流します。続いて、20から25 millilitersの4%パラホルムアルデヒドを灌流します。心腔内灌流が完了したら、肩のすぐ上の脊柱を切断し、ハサミで頭部を取り出します。頭部の背側正中線に沿って、吻側から尾側に向かってメスで切り込みを入れ、頭皮を切開して頭蓋骨を露出させます。メスを用いて、頭蓋骨の側面および後面の余分な組織や筋肉を掻き出します。ピンセットを用いて、嗅球のすぐ吻側の中線上で頭蓋骨を穿刺し、精密剪刀の先端が入る小さな穴を開けます。この穴に精密剪刀を挿入し、中線から嗅球の長さに沿って左右両側に2本の切開を加えます。この切断により、鼻骨と前頭骨の接合部で頭蓋骨が分断され、剪刀によるアプローチが容易になります。頭蓋骨の正中縫合に沿って切開します。その際、下層の組織を損傷しないよう、ハサミの先端を脳から遠ざける角度に保つようにしてください。次に、ピンセットで頭蓋骨をそっと掴み、正中切開に沿って骨を剥がして脳を露出させます。頭蓋骨は小さな破片となって欠けたり、大きな塊となって剥がれたりすることがあります。さらにピンセットを使用して、前頭頂骨、間頂骨、および後頭骨をすべて除去します。小脳の高さの脳の外縁に沿って位置する傍眼骨を、両側の球状の骨を軽くつまむようにして取り除きます。はさみを用いて、脳幹を囲む骨の背側部分を注意深く切断します。ハサミの片側を骨の背側縁の直下に挿入し、脊髄を切断した位置から小脳に向かって切断します。これにより、脳幹と小脳を露出させます。ピンセットを用いて、脳幹周囲に残っている骨を取り除きます。骨を慎重に剥がし、頭部を背側が下になるように向け、ピンセットを使用して脳神経を切断し、脳を頭蓋骨から取り出します。脳を氷を入れたペトリ皿に入れます。冷却したPPSを用い、蛍光解剖顕微鏡を使用して成体脳のGFP標識を確認し、ピクチャーフレームを用いて撮影します。この例では、中脳がGFPで標識されており、胚発生期の系譜解析に加えて、成体におけるGIFMを、マイクロダイセクションや組織外植え実験など、発生生物学で一般的に用いられる他の手法と組み合わせることが可能です。例えば、腹側中脳はwind one遺伝子を発現するドーパミン神経細胞の発達における前駆細胞領域です。したがって、マイクロダイセクションによって腹側中脳を単離することで、その発達をさらに調査するためのin vitro環境を構築することができます。これは、遺伝的履歴によって定義される目的の前駆細胞領域を単離するためにGIFMを使用する一例に過ぎません。この手順を開始するには、事前に特定したGFP陽性胚を、細い鋏を用いて細胞培養皿内の氷冷滅菌PBSに移します。胚の頭部を横方向に切断して取り除きます。次に、頭部の吻側部分を頭冠面で切断して取り除きます。これにより、第四脳室から中脳胞にかけて、背側組織と腹側組織を結ぶ管状の構造が露出します。ハサミの先端を第四脳室に慎重に挿入し、背側正中線を沿って尾側から吻側へ切り開き、チューブを完全に開放してオープンブック標本作製を行います。次に、中脳の腹側を内側に向かって露出させます。中脳の背側の2つの半分は外側に配置されますが、腹側中脳の下にある残りの非神経組織を除去する必要がある場合があります。切除組織を平らに置くためには、背側中脳が羽、菱形質（rhombomere 1）が尾に見える、蝶のような形状にする必要があります。腹側中脳をさらに単離して、fax解析や細胞培養実験に用いるには、組織の外側部分を除去します。次に、GIFMの代表的な結果をいくつか示します。この実験では、E 8.5までにマークされたWINT one発現細胞を可視化し、wint one直接細胞が発達過程を通じてどのように神経構造に寄与するかを決定します。例えば、E 12.5のWnt1-CreER MG FP胚では、主に中脳、後脳後部、および脊髄にGFP蛍光が認められます。高倍率では、微細な神経突起が中脳、体壁、肢、および頭顔面領域に神経支配を伸ばしている様子が観察されます。標識された細胞は、免疫組織化学染色によって細胞レベルで可視化および解析することも可能です。E 8.5にタモキシフェンを投与して標識したE 12.5胚の厚さ1 µmの光学切片に示すように、核内β-ガラクトシダーゼ抗体による赤色の標識とGFP抗体による緑色の標識は、腹側中脳における運命マッピングされた細胞を示しています。ここでは、成体脳における条件付きMGFPリポーターの性質により、細胞がダブルポジティブとなっています。成熟組織の密度が高いため、脳内部構造から発せられるGFP蛍光が遮られる可能性があります。したがって、成体のCUI上部を全層蛍光顕微鏡で観察すると、わずかなGFP蛍光しか検出されません。成体切片における低倍率顕微鏡観察により、E 8.5で標識された1つのリネージは、上丘および下丘を含む中脳構造に分化することが明らかになりました。ドーパミン作動性ニューロン近傍の中脳腹側から撮影したこの高倍率画像では、核内β-カテニン陽性細胞と、豊かなGFP陽性の軸索叢が確認できます。対照的に、E 9.5での標識は実質的なGFPラベル化をもたらし、ホールマウント蛍光観察により中脳の下丘で容易に観察されます。成体切片におけるE 9.5で標識されたWnt1リネージは、低倍率顕微鏡観察で示されるように、下丘に集中しています。ドーパミン作動性ニューロンの腹側中脳から撮影したこの高倍率像では、核β-ガラクトシダーゼ陽性細胞と、豊かなGFP陽性軸索叢が観察できます。したがって、E 8.5由来のニューロンはE 9.5と比較して背側中脳への寄与が徐々に制限される一方で、WIN1リネージュは腹側中脳への寄与を維持していることがわかります。以上の手順で、in vivoで細胞系譜を標識し追跡するための遺伝学的誘導性運命マッピングの手法について解説しました。これにより、遺伝的な系譜に基づいて細胞を標識し、遺伝子発現が消失した後でも、時間の経過に伴う細胞の追跡が可能になります。タモキシフェンを8.5日で投与することにより、wit 1ドメインが成体の中脳全体に加えて、発達中の中脳にも寄与していることを示しました。対照的に、wit oneドメインが制限される9.5日目にタモキシフェンを投与すると、胚発生中の発達中の中脳への寄与がより制限され、その状態が成体まで持続します。この手順を行う際は、本システムが細胞をモザイク状に標識するため、特定の構造内のすべての細胞が標識されるわけではないことに留意することが重要です。これは、使用されているCRE erラインまたは条件付きレポーターアレルに起因すると考えられます。重要な点として、細胞の標識はモザイク状になりますが、標識細胞（mar cells）のパターンと分布は極めて再現性が高いことが挙げられます。タモキシフェンの投与については、腹腔内投与に比べて経口ゾンデ投与の方が、腹腔内の炎症および胚への機械的損傷を最小限に抑えられるため有利であることが分かりました。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Biology

生物学

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このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。...

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

この記事では、R26R-Confettiマウスを使用した多色系統追跡実験を設計し実行するための原理について説明します。私たちは、他の関心のある組織に修飾できる角膜上皮細胞を追跡するための特定のプロトコルを提供します。...

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

細胞移植、細胞骨格標識、機能喪失/獲得アプローチを組み合わせて、このプロトコルは、移動するゼブラフィッシュの有望な脊索前板を使用して、in vivo細胞移動における候補遺伝子の機能を分析する方法を説明しています。...

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

ここで説明されているプロトコルは、超腸サイトにコロンから移住免疫細胞を特定する新生児マウスの photolabeling アプローチを採用しています。この戦略は、初期の生活におけるホスト...

生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling

ここで提示する方法は、マイクロパターニングと定量イメージングを使用して、哺乳類培養における空間的組織を明らかにする。この技術は、標準的な細胞生物学研究室で確立することが容易であり、インビトロでのパターニングを研究するための扱いやすいシステムを提供しています。...

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキシング(TB/TB)マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。...

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

学ぶ遺伝子誘導的運命マッピング（GIFM）を用いた細胞系統追跡法。マウスE12.5胚でWnt1発現細胞を標識し、蛍光解析で脳発生における前駆細胞の寄与を解明する強力な手法です。

遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの

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