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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの

Full Text

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13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

遺伝的誘導フェイトマッピング（GIFM）マークと細かい空間的、時間的な制御を持つトラックの細胞

Transcript

運命マップは、in vivoで細胞をマーキングおよび追跡することにより生成され、前駆細胞が発生組織および成体組織の特定の構造および細胞タイプにどのように寄与しているかを決定します。そして、この概念の進歩は、遺伝子発現硫酸塩と生体内の細胞挙動をリンクして遺伝的系統に基づく運命マップを作成するGIFMである。こんにちは、私の名前はデボラ・エリザーで、マーク・サービス研究所とブラウン大学の分子生物学・細胞生物学・生化学部に所属しています。

今日は、同僚のアシュリー・ブラウン、リズ・ノーマン・ニーン・ハーゲン、スティーブ・ブラウン、そして私が、遺伝的誘導性運命マッピングの手順を実演します。私たちはこの手順を研究室で使用して、初期の脳の発達を研究しています。また、この手法は、遺伝子不活性化研究やヒト疾患の動物モデルにも応用できます。

それでは、X cre、E-R-M-G-F-P胚から始めましょう。MGFP LAEは、灰色の楕円形X cre、erで表されるすべての細胞に存在するレポーター対立遺伝子であり、Xは遺伝子調節要素を表します。小胞体発現の制御は、青色で示された遺伝子Xの発現ドメインに空間的に制限され、CRE ERタンパク質はHSP 90によって細胞質に隔離されます。

タモキシフェンの投与は、CERがHSP 90から放出され、核に移行し、レポーター対立遺伝子からストップカセットを除去するため、ドメインXの運命マッピング細胞をもたらします。レポーター対立遺伝子CERとタモキシフェンの組み合わせは、細胞集団が最初に遺伝子発現に基づいて胚の原始脳領域にマークされると、これらの運命マッピングされた細胞は、CERを駆動するために使用される初期遺伝子発現が消滅した後でも追跡されます。

このように。遺伝的に定義された細胞系譜の最終的な分布と最終運命は、成人で特定できます。この手順は、タモキシフェンの20ミリグラム/ミリリットルの茎溶液をガラス吸入バイアル内の戦前のコーン油10ミリリットルに溶解するタモキシフェンの茎溶液の調製から始まります。

次に、溶液を摂氏37度でTatorボルテックスで2時間インキュベートします。この溶液は、調製したタモキシフェンストック溶液をホイルで包み、摂氏4度で保存することにより、調製したタモキシフェンストック溶液を光から断続的に保護します。在庫は最大1ヶ月間使用できます。

運命マッピング実験では、野生型のスイスウェブスターの雌と、遺伝子特異的なCreER対立遺伝子とレポーター対立遺伝子の両方を持つ雄からなる繁殖ペアを確立します。このデモンストレーションでは、CreER MG FPの雄1機に対して1機の勝利を使用します。毎朝、スイスのウェブスターの女性をチェックして、膣栓の外観を確認してください。

膣栓の日の朝を ?? 栓の0.5日後として指定し、タモキシフェン投与の日付を計算します。.この実験のこの出発点に基づいて、タモキシフェンは胚の 8.5 日目に投与されます。動物用給餌針付きの1ミリリットルの注射器を使用して、200マイクロリットルのタモキシフェン茎溶液を吸い上げます。

首と背中の昼寝をつかんで頭を固定し、腹側が上を向くようにマウスを裏返すことで、時限妊娠中のスイスウェブスターメスをしっかりと拘束します。空いている指でテールを挟み、体をまっすぐに保ちます。次に、栄養針を口の隅に置き、栄養針の先端がほぼ目の位置に来るまで、針を口蓋と平行にゆっくりと導きます。

食道にアクセスするために、頭をゆっくりと後ろに傾けます。針を喉頭蓋を通り過ぎて食道を下り、胃に向かって導きます。気管に入らないように注意してください。

栄養針が胃に入ったら、タモキシフェンを投与し、針を抜きます。その後、解剖の日までメスを自宅のケージに戻します。解剖の日に、時限妊娠女性からのE 12.5胚は自由に解剖され、その後GFPマーキングについて評価されます。

GFP陽性胚では、風1由来のニューロンが中脳、甘えた後脳、脊髄に寄与していることが観察されます。MG FPレポーターは軸索突起を標識し、これはGFP陽性の胚を家庭用マウントによってPPSを含むシャーレに移し、額縁を使用してそれらを撮影することもできます胚が撮影された後、鉗子を使用して各胚から尾の小片をつまみ取り、各ピースをPCRチューブに入れます。組織は、両方の対立遺伝子の PCR を使用して遺伝子型決定され、ホールマウント分析で確認された結果を確認します。

次の手順により、開頭術を開始する前に、胚領域に由来するマークされた細胞が成体の脳にどのように存在するかを分析できます。つま先をつまむことで、マウスが完全にインヌであることを確認。ネンブタールで化した人は、胸郭を通して心臓にアクセスするために切開を行います。

次に、蝶の針を心臓の頂点または左心室に配置し、Cクランプで固定します。ハサミで右側の心房に液体の出口サイトを作成し、液体が透明になるまで10〜15ミリリットルの氷冷生理食塩水で灌流します。20〜25ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドが続きます。

心臓内の充血が完了したら、肩のすぐ上の脊柱をはさみで切り裂いて頭を取り除きます。頭の背側正中線に沿ってメスを走らせ、吻側を走らせて頭皮を切り裂き、S頭蓋骨を露出させます。メスを使用して、頭蓋骨の側面と後部に沿って余分な組織や筋肉をこすり落とします。

鉗子を使用して、頭蓋骨を正中線で穿刺し、嗅球に吻側だけを突き刺し、細かいはさみの先端を収容するための小さな穴を作ります。この穴に細いハサミを挿入し、嗅球の長さに従って正中線から2つの両側切開を行います。この切り傷は、鼻骨と前頭骨の交差点で頭蓋骨を壊し、ハサミのアクセスを容易にします。

頭蓋骨の矢状縫合糸に沿って切り込み、ハサミの先端が脳から離れるように角度をつけて、下にある組織に損傷を与えないようにします。次に、鉗子で頭蓋骨を優しくつかみ、内側切開部に沿って骨を剥がして脳を露出させます。頭蓋骨は小さな破片で欠けたり、大きな部分で壊れたりすることがあります。

鉗子を引き続き使用して、前頭頭頂骨、頭頂間骨、後頭骨をすべて取り除きます。小脳のレベルで脳の外側の縁に沿って位置する傍眼部を、両側の球形骨を優しくつまむことにより解放します。ハサミを使って、脳幹を囲む骨の背側部分を丁寧に切ります。

はさみの片側を骨の背側の端のすぐ下に挿入し、脊髄が切断された場所から始まり、小脳に向かって切断します。脳幹と小脳を解放するため。鉗子で脳幹の周りから残りの骨を取り除きます。

骨をそっと引き離し、頭の背側を下にして、鉗子を使用して脳神経を切断し、頭蓋骨から脳を解放します。氷の入ったシャーレに脳を入れます。コールドPPS 蛍光解剖スコープと額縁を使用した写真を使用して、成人の脳のGFPマーキングを評価します。

この例では、中脳はGFPによってマークされ、胚形成中の系統解析での使用に加えて、成体ではGIFMは、顕微解剖や組織外植片実験など、発生生物学で一般的に使用される他のアプリケーションと組み合わせることができます。例えば、腹側中脳は、遺伝子風を発現するドーパミンニューロンを発達させるための前駆細胞である。したがって、マイクロダイセクションによって腹側中脳を単離することで、その発生をさらに調査するためのin vitro設定を確立することができます。

これは、GIFMを使用して、遺伝的履歴によって定義される対象の前駆細胞ゾーンを分離する一例にすぎません。この手順を開始するには、以前に同定したGFP陽性胚を、細いハサミを使用して細胞培養皿内の氷冷滅菌PBSに移します。横方向に甘やかされてロミーに切断することにより、胚の頭の部分を取り除きます。

次に、頭蓋骨を冠状に切って頭の吻側部分を取り除きます。これにより、中頭蓋小胞を通る第4脳室が背側組織と腹側組織の間に導管を形成する管状の構造が露出します。はさみの先端を第4脳室に慎重に挿入し、吻側に寄り添った背側の正中線に沿って切り取り、チューブを完全に開いて、オープンブックの準備を作成します。

腹側中脳は内側に露出します。中脳の2つの背側半分は横方向に存在しますが、腹側中脳の下に残っている非神経組織を取り除く必要がある場合があります。エクスプランを平らにするためには、エクスプランは、背側中脳が翼を表し、血栓が尾の1つを表す蝶に似ている必要があります。

FAX分析または細胞培養実験のために腹側中脳をさらに単離するには、組織の外側の側面を取り除きます。次に、GIFMの代表的な結果をいくつか紹介します。この実験では、E 8.5にマークされた細胞を発現するWINT Oneを視覚化して、wint one直接細胞が発生全体の神経構造にどのように寄与しているかを判断します。

例えば、E 12.5で1つのC EER MG FP胚は、主に中脳、後脳、後脳、脊髄にGFP蛍光を呈し、高倍率で微細な神経突起が神経支配しているのが見られる。中脳、体壁、四肢、頭蓋顔面領域にマークされた細胞も、免疫組織化学によって細胞レベルで視覚化および分析できます。この図に示すように、タモキシフェン投与によるE 12.5胚の厚さ1マイクロメートルの光学切片は、E 8.5での核βガラクト抗体の標識が赤、GFP抗体の標識が緑で示され、腹側中脳に示された運命マッピング細胞を示しています。

ここでは、結合された細胞は、成人の脳内の条件付きMGFPレポーターの性質のために二重陽性です。成熟組織の密度は、脳の内部構造から発せられるGFP蛍光を覆い隠す可能性があります。したがって、ホールマウント蛍光顕微鏡では、勝利を評価する成人の優れたCUIにかすかなGFP蛍光のみが明らかになります。

低倍率顕微鏡で成人切片にE 8.5でマークされた1つの系統は、WIN 1系統が上唐弔と下唐を含む中脳構造を生じさせることを示しています。ドーパミン作動性ニューロンの近くの腹側中脳から撮影されたこの高倍率画像では、核ベータカル陽性細胞と豊富なGFP陽性軸索神経叢がE 9.5でのコントラストマーキングで見ることができ、その結果、中脳の下眼部で全マウント蛍光によって容易に観察される実質的なGFP標識が得られます。成体切片にE 9.5でマークされたWINT one系統は、低倍率顕微鏡で見られるように、下カウルに集中しています。

ドーパミン作動性ニューロンの腹側中脳から撮影されたこの高倍率画像では、核ベータゲル陽性細胞と豊富なGFP陽性軸索神経叢が見られます。したがって、E 8.5 と E 9.5 にマークされた win 1 派生ニューロンは、背側中脳への寄与が徐々に制限されます。WIN one系統は、腹側中脳に寄与することに固執します。

ここでは

、生体内で細胞系譜をマークし追跡するための遺伝的誘導性運命マッピングの手順を紹介しました。これにより、遺伝子の系統に基づいて細胞をマークし、遺伝子発現が消滅した後でも経時的に追跡することができます。タモキシフェンを8年半で投与すると、ウィット1ドメインが成人の中脳全体に加えて中脳の発達に寄与することを示しました。

対照的に、1つのドメインが制限されるようになったときに9.5でタモキシフェンを投与すると、胚形成中の発達中の中脳への寄与がより制限され、これは成体まで持続します。この手順を実行するときは、システムがセルをモザイク状にマークするため、特定の構造内のすべてのセルにラベルが付けられるわけではないことを考慮することが重要です。これは、CRE erラインまたは使用されている条件付きレポーター対立遺伝子が原因である可能性があります。

重要なことは、細胞のマーキングはモザイクですが、mar細胞のパターンと分布は非常に再現性が高いことです。タモキシフェンの経口強制経口投与は、腹腔間注射による投与と比較して、腹腔腔の炎症や胚への機械的損傷を最小限に抑えることができるため、有利であることを発見しました。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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