Name: ラット坐骨神経からの軸索原形質分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学ぶラット坐骨神経から軸索原形質を分離する手法。低張性培地を用いて髄鞘を除去し、軸索成分を高純度に抽出する。ウェスタンブロットで軸索タンパク質の濃縮を確認できる神経科学研究に有用なプロトコルである。

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このプロトコルは、グリアや血管組織の汚染の最小化と軸索原形質分離が可能になります。メソッドは、単一の80〜10週齢のWistar系ラットあたり約70から100μgのトータル軸索原形質のタンパク質が得られます。 1。坐骨神経を解剖<ol><li>頸椎脱臼が続くCO 2吸入による2匹のラットを安楽死させる。最初の切開の前にハートビートの欠如のために触診によって死を確認してください。 </li><li>綿棒を70％エタノールで清エリア。 </li><li>皮膚を切り取り、別の筋肉や血管を損傷することなく、慎重にハサミとピンセットを使って坐骨神経を分離。各動物の両方から坐骨神経を（約1.5cmごとに）摘出し、氷上に置き、500μLのPBS 0.2 × +阻害剤とエッペンドルフのすべての4つの神経を、集める。 </li><li> PBS 0.2 × +プロテアーゼ阻害剤の少なくとも2 mLを含むプラスチック製の皿に神経セグメントを転送する。 </li><li>双眼鏡、スコープの下に微細な鉗子を用いて神経から神経上膜を取​​り除く。彼らが白濁するまで非常に慎重に束を分離し、液の表面に浮くし始める。それは（神経あたり10分以上を服用していない）を迅速かつ正確に実行できるまで、このステップは実施されるべきである。 </li></ol> 2。インキュベーション、洗浄および溶出<ol><li>転送は、室温で2時間インキュベーションするためのプロテアーゼ阻害剤を含むPBS 0.2 ×500μLの新鮮なエッペンドルフチュー​​ブに束を分離。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブからエッペンドルフチュー​​ブに束を転送し、転送後、5分間振とう同じバッファー1mLで少なくとも3回洗浄する。 </li><li>流体の過剰な削除するには、新しい空のエッペンドルフチュー​​ブに束を配置し、室温で20〜30分間インキュベーションするためのプロテアーゼ阻害剤を含むPBS 1Xの300μLで新しいエッペンドルフチュー​​ブに束を転送する。 </li><li> 4℃で10,000 × gで10分間遠心分離℃を</li><li>上清を測定タンパク質濃度を取る。これは軸索原形質の準備です。 </li></ol> 3。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。として、このプロトコルに示すように分離された軸索原形質のサンプルとマニュアルスクイーズ法により分離された軸索原形質を比較するウエスタンブロットは。それぞれ、血中蛋白とグリア細胞の汚染を表すアルブミンとGFAPのレベル低下を、注意してください。対照的に、軸索チューブリンb3は軸索タンパク質の高レベルを示す、この準備に富んでいる。

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

生化学的およびプロテオーム解析は、機械的なスクイーズ1による軸索原形質分離のために前述の方法に比べて、この手順では、血清およびグリア細胞のコンタミネーション3を減少させることを確認した。我々は、坐骨神経損傷2の後ダイニンベースの逆行性シグナリングを探求し、それが軸索-グリア相互作用4を含む成人の末梢神経の他の多くのプロセス、の探査の有用性を有することを期待するために、この軸索原形質分離のプロトコルを使用している。

<ul><li>雄のWistarラット（8-10週齢） </li><li> 50ミリリットルあたりのプロテアーゼ阻害剤（Roshe）2錠を含むPBS 0.2 ×とPBS 1Xソリューション</li><li> 1.5ミリリットル用Eppendorfs </li><li> 35mmプラスチック皿を滅菌</li><li>はさみと細かい鉗子：を含む解剖ツール</li><li>双眼鏡とテーブルライト</li></ul>抗体マウス抗GFAPクローンGA - 5は、シグマ（G6171）からのものであった。ウサギ抗アルブミンはCedarlane（CLAG5140）からのものであった。マウス抗チューブリンβ3およびウサギ抗gERKはシグマ（T2200およびそれぞれM5670）からのものであった。

ラット坐骨神経からの軸索原形質分離

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

末梢神経からの純粋な軸索の細胞質（軸索原形質）の分離には多くの生物学的過程の生化学的研究にとって重要です。この記事では、次の手順に基づいて、成体ラットの坐骨神経からの軸索原形質分離のためのプロトコルを示し、説明します。神経の束と結合組織の分離の（1）解剖、神経束の短いセグメントの（2）インキュベーション低張培地でミエリンを解放し、非軸索の構造を溶解すること、（3）残りの軸索に富む材料の抽出。この準備のプロテオミクスと生化学的特性は、軸索のコンポーネントのための濃縮度の高い認識しています。

我々は、ミエリンを解放し、残りの軸索に富む材料の抽出に続いて、非軸索の構造を、溶解する低張培地で神経の束とインキュベーションの解剖に基づいて、成体ラットの坐骨神経からの軸索原形質分離のためのプロトコルを示す。

末梢神経から純粋な軸索質（axoplasm）を単離することは、多くの生物学的プロセスの生化学的研究において極めて重要です。本記事では、我々は...

この手順の全体的な目的は、末梢神経から純粋な軸索細胞質または外細胞質を単離することです。まず、坐骨神経を解剖し、取り出します。次に、神経から結合組織を除去し、slesを分離します。手順の3番目のステップは、低張媒における神経組織の短いセグメントのインキュベーションです。手順の最終ステップは、等張溶液でのインキュベーション、遠心分離、および浸透圧ミリアンです。最終的に、ウェスタンブロット分析によって、軸索成分が高度に濃縮されていることを示す結果を得ることができます。こんにちは、私はエル・ローゼンバウムです。私たちは、科学研究所の生物化学部門、マイク・F・ラボ教授の研究室に所属しています。本日は、オキシ・オパット・メシル化という新しい手法をご紹介します。末梢神経の手動圧迫OISなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、軸索内容物への血清およびグリアによる汚染を低減できる点にあります。我々はこの新手法をop PLAのメチル化に用い、坐骨神経損傷後のDに基づくレトロシグナリングについて検討しました。それでは、始めていきましょう。安楽死させた8〜10週齢のWistarラット1匹を、坐骨神経の遠位端へ直接的にアプローチするため、解剖マットの上に側臥位で置きます。大腿中央部の皮膚を剃毛し、70% ethanolで十分に拭き上げます。ハサミを用いて、大腿部の皮膚を切り除きます。大腿二頭筋と浅臀筋の間の脂肪および結合組織を慎重に切り開きます。ピンセットを用いて、露出した坐骨神経を挙上し、摘出します。切除した部位の長さは約1.5 cmになります。神経を、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した2X PBS 500 µLが入ったマイクロ遠心チューブに移します。チューブを氷上に保持してください。ラットの反対側、および2匹目のラットの両側で解剖手順を繰り返します。ペトリ皿の底をパステールピペットで軽くこすり、室温の2 mLのプロテアーゼ阻害剤含有2X PBSを満たします。解剖顕微鏡下で、単一の神経をディッシュに移します。微細ピンセットを用いて、神経から神経外膜を剥ぎ取るようにして取り除き、廃棄します。このとき、神経束はディッシュに残してください。神経束同士およびディッシュの底から、慎重に神経束を分離させます。個々の細胞が白濁し、溶液の表面に浮上します。分離した細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む 500 µL の 0.2 X PBS が入ったマイクロ遠心チューブに直ちに移動させてください。細胞は氷上で保持します。慣れた手つきで、チューブ内の残りの坐骨神経からslesを分離し、回収します。神経外膜を除去し、slesを分離します。この作業は、神経1本あたり10分以内に完了させてください。分離したSLESを含むチューブを氷から取り出します。室温で2時間インキュベートし、ミエリンおよび非軸索構造を放出させます。各洗浄ステップでSLESを洗浄します。ピンセットを使用してSLESを慎重に持ち上げ、プロテアーゼ阻害剤を含む2X PBS 1 mLが入った新しいチューブに移します。チューブをロッカーステアラーで5分間振盪します。洗浄後、このようにしてSLESを3回洗浄してください。過剰な液体を取り除くため、SLESを新しい空のエッペンドルフチューブに移し、次いでプロテアーゼ阻害剤を含む300 µLの1× PBSが入ったチューブに移して、室温で20〜30分間インキュベートします。opsmを溶出させる際、高濃度の塩は以降のプロテオミクス手順を妨げます。組織および細胞碎片をペレット化するため、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離し、上清をきれいなエッペンドルフチューブにピペットで回収します。得られた上清は、透明である必要があります。分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定してください。200から250 µgのタンパク質が得られるはずです。調製したop plasmは分注し、-80 °Cで最大6ヶ月間保存してください。凍結融解の繰り返しは避けてください。ここでは、手動圧搾法で分離したop plasmと、本プロトコルに従って分離したopsmサンプルを比較したウェスタンブロットを示します。血液タンパク質およびグリア細胞の混入をそれぞれ表すalbuminおよびGFAPのレベルが低下していることに注目してください。対照的に、この調製物ではaxonal tubulin beta threeが濃縮されており、軸索タンパク質が高レベルに含まれていることが示されています。本ビデオをすべて視聴することで、坐骨神経の解剖方法および、適切にPacoを分離させる方法について十分に理解できたはずです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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