ラット坐骨神経からの軸索原形質分離

この手順の全体的な目的は、末梢神経から純粋な軸索細胞質または外細胞質を単離することです。まず、坐骨神経を解剖し、取り出します。次に、神経から結合組織を除去し、slesを分離します。

手順の3番目のステップは、低張媒における神経組織の短いセグメントのインキュベーションです。手順の最終ステップは、等張溶液でのインキュベーション、遠心分離、および浸透圧ミリアンです。最終的に、ウェスタンブロット分析によって、軸索成分が高度に濃縮されていることを示す結果を得ることができます。

こんにちは、私はエル・ローゼンバウムです。私たちは、科学研究所の生物化学部門、マイク・F・ラボ教授の研究室に所属しています。本日は、オキシ・オパット・メシル化という新しい手法をご紹介します。

末梢神経の手動圧迫OISなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、軸索内容物への血清およびグリアによる汚染を低減できる点にあります。我々はこの新手法をop PLAのメチル化に用い、坐骨神経損傷後のDに基づくレトロシグナリングについて検討しました。

それでは、始めていきましょう。安楽死させた8〜10週齢のWistarラット1匹を、坐骨神経の遠位端へ直接的にアプローチするため、解剖マットの上に側臥位で置きます。大腿中央部の皮膚を剃毛し、70% ethanolで十分に拭き上げます。

ハサミを用いて、大腿部の皮膚を切り除きます。大腿二頭筋と浅臀筋の間の脂肪および結合組織を慎重に切り開きます。ピンセットを用いて、露出した坐骨神経を挙上し、摘出します。

切除した部位の長さは約1.5 cmになります。神経を、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した2X PBS 500 µLが入ったマイクロ遠心チューブに移します。チューブを氷上に保持してください。

ラットの反対側、および2匹目のラットの両側で解剖手順を繰り返します。ペトリ皿の底をパステールピペットで軽くこすり、室温の2 mLのプロテアーゼ阻害剤含有2X PBSを満たします。

解剖顕微鏡下で、単一の神経をディッシュに移します。微細ピンセットを用いて、神経から神経外膜を剥ぎ取るようにして取り除き、廃棄します。このとき、神経束はディッシュに残してください。神経束同士およびディッシュの底から、慎重に神経束を分離させます。

個々の細胞が白濁し、溶液の表面に浮上します。分離した細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む 500 µL の 0.2 X PBS が入ったマイクロ遠心チューブに直ちに移動させてください。細胞は氷上で保持します。

慣れた手つきで、チューブ内の残りの坐骨神経からslesを分離し、回収します。神経外膜を除去し、slesを分離します。この作業は、神経1本あたり10分以内に完了させてください。

分離したSLESを含むチューブを氷から取り出します。室温で2時間インキュベートし、ミエリンおよび非軸索構造を放出させます。各洗浄ステップでSLESを洗浄します。

ピンセットを使用してSLESを慎重に持ち上げ、プロテアーゼ阻害剤を含む2X PBS 1 mLが入った新しいチューブに移します。チューブをロッカーステアラーで5分間振盪します。洗浄後、このようにしてSLESを3回洗浄してください。

過剰な液体を取り除くため、SLESを新しい空のエッペンドルフチューブに移し、次いでプロテアーゼ阻害剤を含む300 µLの1× PBSが入ったチューブに移して、室温で20〜30分間インキュベートします。opsmを溶出させる際、高濃度の塩は以降のプロテオミクス手順を妨げます。組織および細胞碎片をペレット化するため、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離し、上清をきれいなエッペンドルフチューブにピペットで回収します。

得られた上清は、透明である必要があります。分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定してください。

200から250 µgのタンパク質が得られるはずです。調製したop plasmは分注し、-80 °Cで最大6ヶ月間保存してください。凍結融解の繰り返しは避けてください。

ここでは、手動圧搾法で分離したop plasmと、本プロトコルに従って分離したopsmサンプルを比較したウェスタンブロットを示します。血液タンパク質およびグリア細胞の混入をそれぞれ表すalbuminおよびGFAPのレベルが低下していることに注目してください。対照的に、この調製物ではaxonal tubulin beta threeが濃縮されており、軸索タンパク質が高レベルに含まれていることが示されています。

本ビデオをすべて視聴することで、坐骨神経の解剖方法および、適切にPacoを分離させる方法について十分に理解できたはずです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。