ラット坐骨神経からの軸索原形質分離
2010年9月24日
我々は、ミエリンを解放し、残りの軸索に富む材料の抽出に続いて、非軸索の構造を、溶解する低張培地で神経の束とインキュベーションの解剖に基づいて、成体ラットの坐骨神経からの軸索原形質分離のためのプロトコルを示す。
この手順の全体的な目標は、純粋な軸索細胞質またはエクトプラズムを末梢神経から分離することです。これは、最初に坐骨神経を解剖することによって達成されます。手順の2番目のステップは、神経から結合組織を取り除き、骨を分離することです。
手順の3番目のステップは、低張培地での神経弛の短いセグメントのインキュベーションです。手順の最終ステップは、等張溶液遠心分離とopsmミリアンでのインキュベーションです。最終的には、ウェスタンブロット分析により、軸索成分の高度濃縮を示す結果を得ることができます。
こんにちは、私の名前は私、エルです そして、私はローゼンバウムかもしれません。私たちは、理学研究所を基盤とする生物化学部のMike F教授の研究室から来ています。今日は、Oxy Opat Mesylationの新しい技術を紹介します。
この技術の主な利点は、末梢神経の手動圧搾OISなどの既存の方法よりも優れています。つまり、この手順により、血清とグロスの汚染が軸索内容物に達するのが減少します。この新しい手法をop PLAのメチル化に使用して、坐骨神経損傷後のDベースのレトロシグナル伝達を調査しました。
それでは始めましょう。安楽死させた2匹の8〜10週齢のウィスターラットのうちの1匹を解剖マットの上に横向きに置き、坐骨神経の遠位部分に直接アプローチします。太ももの真ん中で皮膚を剃り、70%エタノールと完全に交換します。
ハサミを使って太ももの皮膚を切り取ります。大腿骨上腕二頭筋と表在性臀筋の間の脂肪と結合組織を慎重に切り取ります。鉗子を使用して、坐骨神経の露出した領域を持ち上げて取り除きます。
除去されたセクションの長さは約1.5センチメートルになります。マイクロ遠心チューブ内のプロテアーゼ阻害剤を含む500マイクロリットルの氷冷2X PBSに神経を移します。チューブを氷の上に保ちます。
ラットの反対側と2匹目のラットの両側で解剖手順を繰り返します。ペトリ皿の底をペーストピペットで引っ掻き、室温の2ミリリットルで満たします。ポイント2 X PB sとプロテアーゼ阻害剤。
解剖顕微鏡下で単一の神経を皿に移します。細い鉗子を使用して、神経からエピニアリウムを引き離して廃棄し、皿にファシレを残します。ファシルを互いに、そして皿の底から慎重に分離します。
個々のファルは曇り、溶液の表面に浮かびます。分離したファレを、プロテアーゼ阻害剤を含む0.2 X PBsの500マイクロリットルを含むマイクロ遠心チューブに直ちに移します。スレッドを氷の上に保ちます。
練習しながら、チューブ内の残りの坐骨神経からスレを分離して収集します。神経上膜の除去と股関節の分離。神経あたり10分以内で完了する必要があります。
分離されたSLESを含むチューブを氷から取り外します。室温で2時間インキュベートして、ミエリンおよびシラミの非軸索構造を放出します。洗濯のたびにスレッドを洗います。
鉗子を使用してスリーブを静かに持ち上げ、プロテアーゼ阻害剤を含む1ミリリットルの2X PBを含む新しいチューブに移します。ロッカーでチューブを5分間振ってください。洗濯後、この方法でSLESを3回洗ってください。
SLESを新しい空のエイノールチューブに移して余分な水分を取り除き、次にプロテウス阻害剤を含む300マイクロリットルのXPBSを含むチューブに移し、室温で20〜30分間インキュベートします。opsmを溶出させるには、塩濃度が高いと、その後のプロテオミクス手順が妨げられます。10, 000チーズで束を遠心分離し、摂氏4度で10分間、上清から組織と細胞の破片をピペットでピペットできれいなeinorチューブにペレット
化します。得られた上清。明確であるべきです。分光光度計を使用してタンパク質濃度を測定します。
200〜250マイクログラムのタンパク質の収量が得られるはずです。.op血漿調製物をマイナス80°Cのアリコートで最大6ヶ月間保存します。解凍と凍結のサイクルは避けてください。
これは、マニュアルスクイーズ法によって単離されたopプラズマと、このプロトコルで示されているように単離されたopsmサンプルを比較したウェスタンブロックです。アルブミンとGFAPのレベルが減少していることは、それぞれ血液タンパク質とグリア細胞の汚染を表していることに注意してください。対照的に、軸索チューブリンβ3はこの調製物に豊富に含まれており、高レベルの軸索タンパク質を示しています。
このビデオをすべて見た後、あなたはよく理解しているはずだサティック神経を解剖する方法と、適切にパコを分離する方法。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、成体ラットの坐骨神経からアクソプラズムを分離するための詳細なプロトコルを提示します。この方法は、神経束の解剖と低張培地でのインキュベーションを含み、ミエリンを効果的に放出し、非軸索構造を溶解して、軸索に富む物質の抽出につながります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 軸索研究
背景
- 軸索細胞質の分離は、神経機能の研究に不可欠です。
- 坐骨神経は末梢神経研究のモデルとして機能します。
- 軸索成分の理解は神経学研究に役立ちます。
- 以前の方法では純粋な軸索物質が得られない可能性があります。
研究の目的
- アクソプラズム分離のための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- さらなる分析のための軸索細胞質の純度を向上させること。
- 生化学的技術を用いた軸索成分の研究を促進すること。
使用された方法
- 神経束にアクセスするための坐骨神経の解剖。
- 神経を取り巻く結合組織の除去。
- 神経断片の低張培地でのインキュベーション。
- その後の遠心分離と等張溶液でのインキュベーション。
主要な結果
- このプロトコルは軸索細胞質を成功裏に分離します。
- ウェスタンブロット分析により、軸索成分の高い濃縮が確認されます。
- 結果は方法の有効性を示しています。
- 軸索生物学の研究における潜在的な応用が強調されています。
結論
- この方法はアクソプラズム分離のための堅牢なアプローチを提供します。
- 神経機能に関連する様々な研究で利用できます。
- 結果は軸索の構造と機能の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
