複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

このビデオでは、局所的な変化を観察するために、半自動プログラムを用いて、神経突起（neurites）と総称される樹状突起および軸索の形態を解析する手順を実演します。まず、Neuron Jソフトウェアを使用してニューロンの8ビットTIFF画像をトレースし、神経突起セグメントの位置を特定します。次に、Neuron Studioソフトウェアを使用して、神経突起間の接続に関する構造情報を定義します。

最後に、bonfire MATLABプログラムを実行して、ショール解析（shoal analysis）を含む細胞の形態学的データ、およびニューライトの分岐点数と先端数を抽出します。結果は、ニューライト樹状突起のサブ領域に対してショール解析を行ったことにより、ニューライト形態の局所的な変化を示しています。手作業によるショール解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、プログラムが半自動化されていることであり、これにより解析効率が大幅に向上し、さらにデータの監査が可能になるため、解析の正確性を検証できる点にあります。

本手順の実演は、夏季にFiresteinラボで研究を行う学部生のHirsch AWA氏が行います。bonfireプログラムを用いてニューライトの8ビットTIFF画像の形態学的特性を解析するためには、まずbonfireプログラムをダウンロードし、個々のニューロンの画像を取得する必要があります。解析したい画像の解像度に基づいてプログラム設定を調整する必要があります。bonfireプログラムのbonfireパラメータセクションにて、変数「picks conversion」の現在の値を、使用する画像の解像度の値に置き換えてください。

bonfireでデータを解析するためには、マスターフォルダ、bonfireのMATLAB Mファイルを含むbonfireフォルダ、各条件ごとのサブフォルダ、および各条件フォルダ内の細胞画像ファイルという特定の構造でファイルを整理する必要があります。まず、トレースのための画像準備を行います。本実験では、樹状突起の形態変化を解析するため、樹状突起のみをトレースします。トレースのための画像準備を開始してください。

neuron Jツールバーのopenボタンを選択して画像を開き、トレースしたい画像を選択します。次に、maximizeボタンを選択して画像をリサイズし、すべての神経突起を可視化できるように画像の明るさとコントラストを調整します。neuron Jツールバーのimageを選択し、adjust brightness contrastを選択してください。トレースを開始するには、neuron Jツールバーのadd tracesボタンを選択します。細胞体の周囲をトレースしてください。

次に、Neuron Jツールバーの「label tracings」ボタンを選択し、tracing IDのドロップダウンメニューから「N1」を選択して、Neuron J属性ウィンドウでタイプ「06」を選択し、「Okay」をクリックします。神経突起のトレースを開始するには、Neuron Jツールバーの「add traces」ボタンを選択し、目的の各神経突起分枝に沿ってトレースを追加します。描画するセグメントは各分岐点で停止させ、各娘枝の分岐点を起点として新しいトレースを開始するのが最適です。

Neuron Jツールバーの「save tracings」ボタンを選択し、作成したトレーシングを元の画像ファイルと同じフォルダに保存します。次に、Neuron Jからトレースファイルとトレース識別ファイルをエクスポートします。Neuron Jツールバーの「export trace」ボタンを選択してください。Neuron Jのエクスポートダイアログボックスで「tab delimited text files separate file for each tracings」オプションを選択し、「okay」を選択して、Neuron Jにファイル名と保存場所を決定させます。

Neuron J ツールバーの 「measure tracings」 ボタンを選択し、次に Neuron J の測定ウィンドウで 「display tracings measurements」 オプションを選択して 「run」 をクリックします。Neuron J のトレースウィンドウで 「Select file」 を選択し、次に 「save as」 を選択してファイルを保存します。ファイル名は、元の画像ファイル名にアンダースコアと 「info」 を付けたものと完全に一致させる必要があり、3文字のファイル拡張子は含めてはいけません。コンピューターによって自動的に XLS 拡張子が追加されていないか確認してください。

その場合は、ファイル拡張子を手動で削除する必要があります。まず、MATLABを開き、コマンドウィンドウの右上にある三点リーダーボタンをクリックして、bonfire loadを用いてフォルダを再編成します。「フォルダの参照」ウィンドウでマスターフォルダ内のbonfireフォルダを選択し、コマンドウィンドウにbonfire loadと入力してEnterキーを押してください。

「フォルダーの参照」ウィンドウで、解析したい条件のフォルダーを選択し、「OK」をクリックします。これにより、個々の細胞の全データを含む細胞サブフォルダーが作成され、フォルダー構造が再編成されます。次に、file name_premium.swcファイルを作成するために、コマンドウィンドウにbonfire_NDF2sWCと入力し、Enterキーを押してください。

フォルダ参照ウィンドウで、先ほどbonfire loadで再編成したのと同じ条件フォルダを選択し、「OK」をクリックします。これにより、選択した条件の各セルフォルダにWCファイルが作成されます。各セルフォルダには5つのファイルが含まれます。

元のTIF画像、NDFファイル、アンダースコア情報、トレース識別子ファイル、TXTファイル、およびswcファイル。Neuron Studioを使用する前に、プログラムの機能とショートカットを習熟しておくことを推奨します。優れたオンラインユーザーマニュアルが提供されており、キーボードショートカットを把握しておくことで大幅な時間の短縮になります。

まず、Neuron Studioプログラムを起動し、Neuron Studioツールバーの「File」から「Open」を選択して、編集したいニューロンのTIF画像を探して開きます。「Run settings」を選択し、3つのボックスそれぞれに「1」を入力してください。

ボクセルサイズウィンドウで、「file import s wc」を選択します。作業対象のファイルに対応する適切な s WC ファイルを選択してください。これで、画像ファイルにトレース画像が重ねて表示されます。

細胞体は、神経突起を連結させるために赤色の円で重ねて表示してください。神経突起ツールを使用してノードを結合し、黄色のノードで示される各分岐点から2つの分岐のみが形成されるようにします。すべてのトレースは細胞体と連続していなければなりません。

Neuron Studioからデータをエクスポートするには、[File]を選択し、[Save neurites]からデフォルトの名前で保存して、swcファイルの形式にエラーがないか確認します。コマンドウィンドウにbonfire traceと入力し、Enterキーを押してください。[Browse for Folder]ウィンドウで、先ほど処理したデータが含まれている条件フォルダを選択し、[OK]をクリックして、フォルダ内の画像にエラーがないか確認します。

このプログラムは、.swcファイルから形態学的データを抽出する際に、エラーが発生している箇所を示す画像を出力します。コマンドウィンドウにbonfireと入力し、Enterキーを押してください。「フォルダの参照」ウィンドウで解析したい条件フォルダを選択し、対象となる各ニューロンについて「OK」を選択してください。

bonfire解析では、解析に使用したショルダーリングと共に、ニューロン形態のグラフが生成されます。さらに、bonfireコマンドによって、解析から得られたすべての形態情報を格納したMATファイルが生成されます。データの予備的なグラフを表示するには、MATLABのコマンドウィンドウにbonfireの結果を入力し、「フォルダの参照」ウィンドウで表示したい条件のフォルダを選択して、「OK」をクリックしてください。

フォルダの参照ウィンドウが一時的に閉じ、再度開いて追加の条件を選択できるようになります。条件を選択したら、「キャンセル」を選択して選択プロセスを終了してください。Bonfireの結果として、エクスポート用に選択した条件フォルダからのデータを含む概要チャートが返されます。形態データをExcel形式で出力するには、MATLABコマンドウィンドウでbonfire Exportを実行してください。

フォルダ参照ウィンドウで、エクスポートしたいデータが含まれている条件フォルダを選択し、「OK」をクリックします。Bonfireのエクスポート機能により、形態データのExcelファイルが作成され、選択した条件フォルダ内に保存されます。次に、2つの条件を含むデータセットを用いて、Bonfireプログラムによって生成されたデータの例を示します。

これらは両方の条件における反転画像の例です。これらの画像から、条件1は条件2よりも樹状突起が多いことがわかります。この現象は、bonfireプログラムによって生成されるさまざまなグラフでも観察できます。

bonfireプログラムは樹状突起のサブ領域に対して解析を行うため、条件1における樹状突起の増加を容易に特定できます。全樹状突起樹のショール曲線（sholl curve）をプロットすると、条件1のニューロンでは細胞体から遠位にある樹状突起が多いことがわかります。また、細胞あたりの分枝点および終末点の平均数をプロットした結果、条件1は条件2よりも分枝点と終末点の両方が多いことが示されました。一次、二次、三次元またはそれ以上の次数の樹状突起について、細胞あたりの突起の平均数を示しています。条件1では、三次およびそれ以上の次数の樹状突起が多く存在します。さらに、根、中間、および終末樹状突起について細胞あたりの突起の平均数をプロットすると、条件1は条件2よりも中間突起または終末突起が多いことがわかります。

ここでは、セグメントを一次、二次、または三次以上に分類したセグメント同一性特異的ショール分析曲線を示しています。条件1のニューロンでは、三次樹状突起の増加が細胞体から離れた部位で起こっています。また、セグメントを根セグメント、中間セグメント、または末端セグメントに分類したセグメント同一性特異的ショール分析曲線も示されています。

条件1における中間および終末樹状突起の両方の増加は、細胞体から離れた部位で起こります。このビデオを視聴することで、神経形態の局所的な変化を観察するための、bonfireプログラムを用いたsholl解析の実行方法について十分に理解できるはずです。