複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

このビデオでは、局所的な変化を観察するために、半自動プログラムを用いて樹状突起と軸索（総称してニューライト）の形態を解析する手順を解説します。まず、Neuron Jソフトウェアを使用してニューロンの8ビットTIFF画像をトレースし、ニューライトセグメントの位置を特定します。次に、Neuron Studioソフトウェアを使用して、ニューライト間の接続に関する構造情報を定義します。

最後に、bonfire MATLABプログラムを実行して、ショール解析（shoal analysis）を含む細胞の形態学的データ、ならびにニューライトの分岐点数およびニューライト先端数を抽出します。解析結果は、ニューライト樹状突起のサブ領域に対してショール解析を行った結果に基づいた、ニューライト形態の局所的な変化を示しています。手動によるショール解析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、プログラムが半自動化されていることで解析効率が大幅に向上し、さらにデータの監査が可能なため、解析の正確性を検証できる点にあります。

本手順の実演を行うのは、夏季にFirestein研究室で研究に従事している学部生のHirsch AWA氏です。Bonfireプログラムを使用してNeuriteの8ビットTIFF画像の形態学的特性を解析するためには、まずBonfireプログラムをダウンロードした後、個々のニューロンの画像を取得する必要があります。解析したい画像の解像度に基づいて、Bonfireプログラムのパラメータセクションでプログラム設定を調整してください。変数「pix conversion」の現在の値を、使用する画像の解像度の値に置き換えます。

bonfireでデータを解析するためには、マスターフォルダ、bonfireのMATLAB Mファイルを含むbonfireフォルダ、各条件を含むサブフォルダ、および各条件フォルダ内の細胞画像ファイルという特定の構造でファイルを整理する必要があります。まず、トレース用の画像準備から始めてください。本実験では、樹状突起の形態変化を解析するため、樹状突起のみをトレースします。トレース用の画像準備を開始してください。

Neuron J ツールバーの open ボタンを選択して画像を開き、トレースしたい画像を選択します。次に、maximize ボタンを選択して画像をリサイズし、すべての神経突起を可視化できるように画像の輝度とコントラストを調整します。Neuron J ツールバーの image を選択し、adjust brightness contrast を選択してください。トレースを開始するには、Neuron J ツールバーの add traces ボタンを選択します。細胞体の周囲をトレースしてください。

次に、neuron Jツールバーのlabel tracingsボタンを選択し、tracing IDドロップダウンメニューからN oneを選択します。neuron J属性ウィンドウでtype zero sixを選択し、Okayを選択してください。 neuritesのトレースを開始するには、neuron Jツールバーのadd tracesボタンを選択し、目的のneurite分枝に沿ってトレースを追加します。描画するセグメントは各分枝点で終了させ、それぞれの娘分枝の開始点を新しいトレースとして開始させるのが最適です。

Neuron Jツールバーの「save tracings」ボタンを選択し、作成したトレースを元の画像ファイルと同じフォルダに保存します。次に、Neuron Jからトレースファイルとトレース識別ファイルをエクスポートします。Neuron Jツールバーの「export trace」ボタンを選択してください。続いて、Neuron Jのエクスポートダイアログボックスで「tab delimited text files separate file for each tracings」オプションを選択し、「OK」を選択して、Neuron Jにファイル名と保存場所を決定させます。

Neuron Jツールバーのmeasure tracingsボタンを選択し、次にNeuron J測定ウィンドウのdisplay tracings measurementsオプションを選択してrunをクリックします。Neuron JトレースウィンドウでSelect fileを選択し、save asを選択してファイルを保存します。ファイル名は元の画像ファイル名にアンダースコアとinfoを付けたものと完全に一致させる必要があり、3文字のファイル拡張子を含めてはいけません。コンピューターによって自動的にXLSファイル拡張子が追加されていないか確認してください。

その場合は、ファイル拡張子を手動で削除する必要があります。まず、MATLABを起動し、コマンドウィンドウの右上にある3つの点のボタンをクリックして、bonfire loadを用いてフォルダを再編成します。「フォルダの参照」ウィンドウでマスターフォルダ内のbonfireフォルダを選択し、コマンドウィンドウにbonfire loadと入力してEnterキーを押してください。

「フォルダの参照」ウィンドウで、解析したい条件フォルダを選択し、「OK」をクリックします。これにより、個々の細胞のすべてのデータを含む細胞サブフォルダが作成され、フォルダ構造が再編成されます。次に、file name_premium.swcファイルを作成するため、コマンドウィンドウにbonfire_NDF2swcと入力し、Enterキーを押します。

フォルダの参照ウィンドウで、先ほどbonfire loadを用いて再編成した条件フォルダを選択し、「OK」をクリックします。これにより、選択した条件の各セルフォルダにWCファイルが作成されます。各セルフォルダには5つのファイルが含まれます。

元のTIF画像、NDFファイル、アンダースコア情報、トレース識別子ファイル、TXTファイル、およびswcファイルを用意します。Neuron Studioを使用する前に、プログラムの機能とショートカットに習熟しておくことを推奨します。優れたオンラインユーザーマニュアルが提供されており、キーボードショートカットを習得することで大幅に時間を節約できます。

まず、Neuron Studioプログラムを起動し、ツールバーの「File」から「Open」を選択して、編集したいニューロンのTIF画像を探して開きます。「Run settings」を選択し、3つのボックスそれぞれに「1」を入力してください。

ボクセルサイズウィンドウで、「file import s wc」を選択します。操作したいファイルに対応する適切な s WC ファイルを選択してください。これにより、画像ファイルにトレース画像が重ねて表示されます。

細胞体は、ニューライトを連結させるために赤色の円で重ねて表示する必要があります。ニューライトツールを使用してノードを結合し、黄色いノードで示される各分岐点から2本の枝しか出ないようにしてください。すべてのトレースは細胞体と連続していなければなりません。

Neuron Studioからデータをエクスポートするには、[file]を選択し、[save neurites]をクリックして、デフォルトの名前で保存し、swcファイルのエラーを確認するためにbonfire traceというタイプを指定します。コマンドウィンドウを確認し、Enterキーを押してください。[browse for folder]ウィンドウで、先ほど処理したデータが含まれている条件フォルダを選択し、フォルダ内の画像にエラーがある場合は[okay]を選択してください。

プログラムは、dot S WCファイルから形態学的データを抽出する際に、エラーが発生している箇所を示す画像を出力します。コマンドウィンドウにbonfireと入力し、Enterキーを押してください。「フォルダの参照」ウィンドウで解析したい条件フォルダを選択し、対象となる各ニューロンについて「OK」を選択します。

bonfire解析では、解析に使用したショルダーリングとともに、ニューロン形態のグラフが生成されます。さらに、bonfireコマンドにより、解析から得られたすべての形態情報を含むMATファイルが生成されます。データタイプの予備グラフを確認するには、MATLABのコマンドウィンドウにbonfireの結果を入力し、「フォルダの参照」ウィンドウで確認したい条件のフォルダを選択して「OK」をクリックしてください。

フォルダの参照ウィンドウが一時的に閉じ、再度開くことで追加の条件を選択できるようになります。条件を選択したら、「キャンセル」を選択して選択プロセスを終了してください。Bonfireの結果として、エクスポート用に選択した条件フォルダのデータを含むサマリーチャートが返されます。形態データをExcel形式でエクスポートするには、MATLABコマンドウィンドウでbonfire Exportを入力してください。

フォルダの参照ウィンドウで、エクスポートしたいデータが含まれている条件フォルダを選択し、「OK」をクリックします。Bonfire Exportによって形態データのExcelファイルが作成され、選択した条件フォルダ内に保存されます。ここで、2つの条件を含むデータセットを用いてBonfireプログラムによって生成されたデータの例を示します。

これらは両方の条件における反転画像の例である。これらの画像から、条件1は条件2よりも樹状突起が多く含まれていることがわかる。この現象は、bonfireプログラムによって生成されるさまざまなグラフでも観察できる。

bonfireプログラムは樹状突起のサブ領域に対して解析を行うため、条件1における樹状突起の増加を容易に特定することができます。全樹状突起樹のショール曲線（sholl curve）をプロットすると、条件1のニューロンでは細胞体から遠位に位置する樹状突起が多くなっていることがわかります。また、細胞あたりの分枝点および終末点の平均数をプロットすると、条件1は条件2よりも分枝点と終末点の両方が多いことが示されます。一次、二次、三次またはそれ以上の高次樹状突起について、細胞あたりの突起の平均数を示しています。条件1では三次および高次樹状突起が多く存在します。さらに、根、中間、および終末樹状突起における細胞あたりの突起の平均数をプロットすると、条件1は条件2よりも中間突起または終末突起が多いことがわかります。

ここでは、セグメントを一次、二次、または三次以上に分類したセグメントアイデンティティ特異的ショール解析曲線を示します。条件1のニューロンでは、三次樹状突起の増加が細胞体から遠位で起こっています。また、セグメントをルートセグメント、中間セグメント、または末端セグメントに分類したセグメントアイデンティティ特異的ショール解析曲線も示されています。

条件1における中間樹状突起および末梢樹状突起の両方の増加は、細胞体から離れた部位で起こります。このビデオを視聴することで、bonfireプログラムを用いてsholl解析を行い、神経形態の局所的な変化を観察する方法を十分に理解できるはずです。