Name: 組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: 学ぶ AAV3ベクターを用いたヒト肝がん細胞への高効率遺伝子導入法。293細胞でのベクター製造と精製、蛍光顕微鏡による発現評価の詳細プロトコルを解説。がん遺伝子治療研究に応用可能。

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我々は、博士に感謝する。寛大Hep293TT細胞を提供するための組換えAAV3とAAV - EGFPプラスミド、それぞれ、博士ゲイルトムリンソンの彼らの親切なギフトのためのR.ジュードSamulskiとシャオシャオ。この研究は国立衛生研究所からの公衆衛生サービス助成金助成金R01 HL - 076901、R01 HL - 097088、およびP01 DK - 058327（プロジェクト1）（ASの）によって部分的にサポートされていました。

1。組換えアデノ随伴ウイルス3型（rAAV3）ベクターのパッケージング<ol><li>ウェブサイトにアクセスしてください：" <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "とDNAの量を計算する。 </li><li> FBSと抗生物質を含まない培地中でプレミックスプラスミドpHelper（アデノウイルスヘルパー）、pACG2c3（AAVヘルパー）とpdsAAV - CB - EGFP（するrAAVベクトル）。総量は10 15センチメートル2プレート用8750μLにする必要があります。 </li><li>ステップ1.2のDNA溶液にPEIの1250μL（0.1％M / V、Polysciences、カタログ番号23966、pH4.5）を直接追加します。数秒間ボルテックスDNA - PEIのソリューション。 </li><li>インキュベートDNA - PEIは、溶液を室温で5分（RT）のための複合体を形成する。 </li><li> 15センチメートル2板あたりのDNA - PEI溶液1mLを追加。 </li><li>新鮮な25mLの完全培地+10％FBS（C - DMEM）に置き換えて、4時間後に培地を取り外します。 </li><li>七十二時間後にトランスフェクション、スクレープ細胞と250 mLのコニカル遠心チューブに分注する。 </li><li> 4℃、3000rpmでスピン、℃で10分間。上清を捨て。 </li><li> RB TMS緩衝液（50mMトリス- HCl、150mMのNaCl、pH8.0）を5mLに細胞ペレットを再懸濁する。新しい15 mLコニカルチューブに移す。 </li><li> 37℃で10分間解凍するためのドライアイス - エタノール浴で凍結℃で10分間。 3回繰り返します。 </li><li> 4.8 M MgCl 2とベンゾナーゼ2μL（25 U /μL、Novagen社、カタログ番号70664〜3）の1μLを追加。 37渦とインキュベート℃で40分間。 </li><li> 40分間4℃、4,000 rpmでCをスピンダウンして（ライセートを清澄化）上清を集める。 </li><li> 15％の2 mLの25％の2 mLの40％、1.5 mLおよび13 mLのクイックシールの遠心管（ベックマン、カタログ番号342413）、上から下への負荷イオジキサノール勾配（OptiPrep、カタログ番号1114542）で60％のイオジキサノール1.5mLの。イオジキサノール勾配の上清（ステップ1.12）ロードする。 RB TMS Bufferでチューブを埋める。 </li><li> ° Cベックマン90Tiローターを使用して、16で1時間75000 rpmで遠心する。 </li><li> 40〜60％の境界で注射器を挿入することにより40％イオジキサノール画分を集める。 </li><li> 1つの50 mLコニカルチューブに40％のイオジキサノール分画を転送し、バッファーを40 mLのために構成する（20mMトリス、15mMのNaClを、pHは8.5）。 </li><li>ハイトラップQ HPカラム（GE Healthcare社、カタログ番号17-1154-01）を使用してろ過装置を組み立てます。以下のバッファーでカラムを洗浄する：バッファーを25mL（20mMトリス、15mMのNaClを、pH 8.5）に、緩衝液B（10mMトリス、500mMのNaCl、pH 8.5）に25mLの、バッファー50 mLの。バッファ内のウイルスのサンプルを40 mLの、バッファー50 mLの（20mMトリス、15mMのNaClを、pH 8.5）に、緩衝液C（20mMトリス、175 mMのNaCl、pH 8.5）に20mLの。 </li><li> 20 mLのアポロコンセントレータ（オービタルサイエンス）のバッファCを収集する。 4℃、3,000 rpmで遠心する℃で10分間を。 </li><li>フロースルーを捨て、4℃、3000rpmで冷却したPBSおよび遠心の20 mLを加え℃で10分間を。 </li><li>フロースルーを捨て、冷却したPBS 500μLを加える。 -80小アリコートで凍結シリコン処理したエッペンドルフチュー​​ブとストアへの膜と転送℃からベクトルを洗い流す</li></ol> 2。 rAAV3ベクトルの力価の決定<ol><li>氷上でエッペンドルフチュー​​ブに精製ウイルスの10μLを解凍。のddH 2 Oの40μLを追加</li><li>ベンゾナーゼの0.2μL（25 U /μL、Novagen社、カタログ番号70664）を追加し、37℃で1時間。 </li><li>別のエッペンドルフチュー​​ブにプラスミド標準（0.2 ng /μLの）50μLを取る。 </li><li> 65の各チューブとインキュベート℃で30分間に100 mMのNaOHを50μLを追加。 </li><li>少なくとも5分間、直ちに氷上で冷やします。 </li><li>バイオドットろ紙（Bio - Rad社製、カタログ番号1620161）に応じて転写膜（ミリポア、カタログ番号INYC00010）をカット。 20分のための3つのフィルター紙で10 × SSCでメンブレンを洗浄します。 </li><li>スロットブロットSF装置（バイオドット、猫＃170〜6542）を設定します。真空フラスコに接続し、スロットブロット装置に10倍のSSCの100μLを加える。 </li><li>ステップ2.5のサンプルのそれぞれに20 × SSCの100μLおよび6xローディング色素の1μLを追加。 </li><li>スロットブロット装置の膜上に各サンプル100μLをロードします。 </li><li>サンプルの各々に10倍のSSCの別の100μLを加える。 </li><li>すべてのサンプルがメンブレンを通過するまで、ステップ2.9および2.10を繰り返します。 </li><li>スロットブロット装置を分解して膜を取り除く。インスペクタのリンカSL - 1000 UV架橋剤に入れて。 "エネルギー"、"最適な架橋"（ショー1200）の電源を入れ、"開始"を押す。 </li><li>サケの精子の沸騰を1 mL（SS）DNA（フィッシャー、カタログ番号NC9753983）5分間。少なくとも5分間氷上で冷やします。 </li><li>のddH 2 O、20 × SSC、50 ×デンハルト溶液、20％SDS、1.25 mLを、ポリA 0.25mLのとステップ2.13からSS DNAを1mLの5 mLの15 mLのの27.5 mLを混合してプレハイブリダイゼーション溶液を調製します。 </li><li> 65でキャップガラスシリンダーとインキュベートでプレハイブリダイゼーション溶液で一晩ハイブリダイゼーションチャンバーのCの25 mLの膜を一時停止する。 </li><li>のddH 2 O10μlに50 ngの鋳型DNAを希釈する。 100℃沸騰℃で少なくとも5分間、直ちに氷上で5分間と寒さのため。 </li><li> 1分間、室温で3,000 rpmで遠心する。 10mMの3のdNTP（dCTPを欠いている）、ヘキサヌクレオチドミックスの2μL（Roche社、カタログ番号11277081001）、クレの1μL（Roche社、カタログ番号11008404001）とα-32 P - dCTPの5μLの2μLを加える。 37℃で10分間インキュベートする。 </li><li> 2分間、3,000 rpmでG - 50カラムを（GE Healthcare社、カタログ番号27-5330-01）心する。カラムにステップ2.17にプローブをロードする。 2分間、3,000 rpmで遠心し、フロースルーを収集する。 </li><li>放射能をカウント。 ° C、直ちに氷上で5分間と寒さのために少なくとも5分間、100℃のプローブを沸騰。 </li><li>膜とのプレハイブリダイゼーション溶液にプローブ（6 × 10 5 cpm / mlの）を追加します。 </li><li>ハイブリダイゼーションチャンバーで65℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液を捨て、15分間室温で2 × SSC 0.1パーセントSDSで膜をすすいでください。 </li><li>液を捨て、℃で30分間65℃で0.1 × SSC 0.1パーセントSDSで膜をすすいでください。 </li><li>液を捨て、室温で短時間で0.1 × SSCで膜をすすいでください。 </li><li> 6時間-80℃でフィルムを公開し、フィルムを開発する。典型的な結果を図1に示されています。 </li></ol> 3。 rAAV3ベクターによる形質導入し、ヒト肝癌細胞における導入遺伝子発現<ol><li> 96ウェルプレートの各ウェル内のシード1 × 10 4細胞（したHuh7またはHep293TTのどちらか）。少なくとも18時間加湿CO 2インキュベーター内でインキュベートする。 </li><li> 96ウェルプレートから培地を取り除く。 </li><li> FBSと抗生物質を含まない培地50μLで細胞を2回洗浄し、削除する。 </li><li> 5000 VGS /細胞でFBSと抗生物質とするrAAVベクターを含まない培地50μLを加える。 </li><li> 4時間CO 2インキュベーターで培養する。 </li><li>培地を捨てる。完全培地50μLで細胞を2回洗浄し、削除します。 </li><li>各ウェルに、C - DMEMを150μLを追加し、72時間CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートし、蛍光顕微鏡（DMI 4000B、ライカマイクロシステムズ）を用いてEGFPの発現を可視化する。 </li><li>ウイルス感染細胞の3つのウエルからの画像は、ImageJの解析ソフト（NIH、ベセスダ、MD、米国）によって定量的に解析されています。 </li><li>導入遺伝子の発現は、視野あたりの緑色蛍光の総面積（画素2）として評価される。典型的な結果を図2に示されています。 </li><li>導入遺伝子の発現は、フローサイトメトリーによって決定することができる。 </li></ol> 4。代表的な結果： 上記のプロトコルに続いて、一つは効率的にAAVの血清型のベクトルを生成することができます。典型的な収量は、ベクトルの株式を精製〜10 11 VGS /μLを含む〜500μLです。ベクトルの株式の純度は、ベンゾナーゼの消化がある場合とない場合の、定量的なDNAのスロットブロットでハイブリダイゼーションシグナルを比較することによって決定されます。効率的に細胞株 - 肝芽腫（HB）と肝細胞癌（HCC） - rAAV3ベクトル形質導入ヒト肝癌を精製。 <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。rAAV3ベクトルの力価を決定するための定量的DNAスロット-ブロット分析。ベンゾナーゼ（一番上の行）で消化し ​​たウイルス株を、精製の​​2倍希釈を32 P -標識したEGFP特異的DNAプローブを用いて定量的なDNAのスロットブロットで分析した。 AAV3ベクトルの力価は、1 ngの（中段）または膜にロードされたAAV - EGFPプラスミド基準の10ngの（一番下の行）との比較により決定した。数字は、DNAのコピーに対応しています。 <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2組換えAAVヒト肝癌細胞におけるベクターによる導入遺伝子の発現。 Hep293TT細胞、最近設立されたヒト肝芽細胞の4行目は 、どちらかのモック感染（左パネル）だった、または2時間、37℃でscAAV2 - EGFPまたはscAAV3 - EGFPベクターのどちらかの5000 VGS /セルで形質導入。導入遺伝子の発現は72時間後の形質導入は、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。

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利害の衝突は宣言されません。

非病原性ヒトパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づいて組換えベクターを開発し、遺伝子治療臨床試験5の数で現在使用されていますされています。以前は、10の最も一般的に使用されるAAV血清型の、一般的にAAV3ベクトルの導入効率は、in vitroおよび in vivo 1 の両方、特に低いことが報告されている。しかし、我々の最近非常によくAAV3ベクトル形質導入ヒト肝癌細胞株は、のようなフローサイトメトリー2で定量的に決定した観察、とAAV3はこれらの結合とエントリの細胞共受容体としてのヒト肝細胞増殖因子受容体（hHGFR）を利用しているセル3は 、強く、特に一般的にヒト肝細胞、およびヒト肝癌細胞に対してAAV3の選択的な組織親和性を示唆している。しかし、AAV3ベクターはまた、効率的に2正常ヒト肝細胞を形質導入するので、in vivoでのがんの遺伝子治療のアプリケーションでそれらの潜在的な利用に悪影響を及ぼす可能になります。この潜在的な問題を回避する一つの可能​​な戦略は選択的に腫瘍ではなく、正常な肝細胞によって産生される遺伝子産物を識別することによって癌細胞の転写標的を伴います。例えば、以前の研究は、正常な肝細胞は一般に非常に少量のを生成するのでα-フェトプロテイン（AFP）の血清レベルは、特定の存在を追跡するためのマーカー、進行、および/または肝臓癌の特定の種類の再発として使用されていることが示されているこのタンパク質。実際、我々は肝癌細胞ではなく、正常な肝細胞2、および研究において導入遺伝子の発現を標的とするAFPプロモーターを含むAAV3ベクトルを使用している現在、肝癌のマウス異種移植モデルでは、このアプローチの有効性をテストするために進行中です。私たちのさらなる研究では、我々は様々なAAVの血清型のベクターの導入効率が大幅に6月14日ウイルスキャプシドの表面に露出したチロシン残基の部位特異的突然変異誘発により増強することができることを観察した。 6 7の表面に露出したチロシンもAAV3に保存されているので、我々はこれらの残基の部位特異的突然変異誘発を実施し、チロシンに変異がAAV3ベクトルの導入効率が大幅にヒト肝癌細胞（未発表データ）に増強されることを観察した。研究はまた、ヒト肝と肝細胞癌のためのマウス異種移植モデルにおけるチロシン変異AAV3ベクトルの安全性と有効性を評価するために現在進行中であり、そして成功した場合、最適なチロシン変異AAV3の血清型のベクターは、ヒトの肝臓を標的とするために有用であることが証明されるかもしれない潜在的な遺伝子治療のためのがん。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HPカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>イオジキサノール勾配液</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>G-50カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

非病原性ヒトパルボウイルスに基づいて組換えベクターは、アデノ随伴ウイルス2（AAV2）を開発し、遺伝子治療臨床試験の数で現在使用されていますされています。さらに最近では、追加のAAV血清型の数も様々な大小の動物モデル1で組織親和性選択を示すことが示されている、単離されている。 10の最も一般的に使用されるAAV血清型のうち、AAV3は群を抜いて試験管内でだけでなく、in vivoでの細胞や組織を形質導入における最も効率的です。 AAV3がバインディングの共受容体の細胞としてのヒト肝細胞増殖因子受容体を使用しているため非常に効率的に細胞株 - 肝芽腫（HB）と肝細胞癌（HCC） - しかし、私たちの最近発表された研究で、我々はAAV3ベクターはヒト肝癌を伝達することが文書化されているこれらの細胞2,3のとエントリー。 この記事では、レポーター遺伝子を有する組換えAAV3ベクターによるヒト肝癌細胞の高効率伝達を達成するために必要な手順を説明します。治療用遺伝子を有する組換えAAV3ベクターの使用は、最終的にヒトの肝癌の潜在的な遺伝子治療につながる可能性があります。

この記事では、我々はヒト肝癌細胞を標的とするための最も効率的なベクターとしてアデノ随伴ウイルス3型（AAV3）の識別について説明します。

非病原性のヒトパルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス2（AAV2）に基づいた組換えベクターが開発され、現在は...で使用されています。

本手順の全体的な目的は、ヒト肝がん細胞に効率的に導入できる活性型の腺随伴ウイルス（AAV）セロタイプ3ベクターを作製することです。これは、まず3種類の異なるプラスミドを293細胞に同時に導入することで達成されます。本手順の第2段階では、293細胞内で構築されたAAV3ビリオンを精製します。本手順の第3ステップは、精製したAAV3ベクターストックのタイターを決定することです。最終ステップでは、精製したAAV3ベクターを用いてヒト肝がん細胞に導入を行います。最終的に、蛍光顕微鏡観察により、ヒト肝がん細胞においてEGFPタンパク質が高発現している結果を得ることができます。本手法の既存の手法に対する主な利点は、ヒト肝細胞癌において高い遺伝子導入効率と発現効率を達成できることです。本手法はAAV3ベクターの作製に関する知見を提供しますが、より広く利用されているAAV2ベクターなどの他のシステムにも適用可能です。一般的に、本手法に不慣れな方は、煩雑な工程が多く含まれているため習得に苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、当研究室の生物学者が行います。本プロトコルのこのセクションにおける実験操作は、本手順を開始する48時間前に、組織培養フード内で行います。ヒト胚性腎細胞株 2, 9 3を15 cmの組織培養ディッシュ10枚に播種し、トランスフェクション当日に細胞密度が70〜80%のコンフルエントになるようにします。ウェブサイト www. を使用してください。ge shae. com/calc を使用して、トランスフェクションに使用するプラスミド DNA の量を算出します。プラスミド DNA の適切な量が見積もられたら、トランスフェクションに進みます。FBS および抗生物質を含まない細胞培養培地の適切な量を、滅菌済みの 15 milliliter チューブにピペットで分注してください。次に、必要量のP helper、PACG two、C3、およびPDSA AAV C-B-E-G-F-Pを培地にピペットで加えます。10 15 centimeterプレート10枚分の場合、全量は8,750 microlitersになります。1,250 microlitersのPEIをプラスミドDNAを含む培地にピペットで加え、DNA-PEI溶液を数秒間ボルテックスした後、DNA-PEI複合体を形成させるため、DNA-PEI溶液を室温で5分間インキュベートします。組織培養インキュベーターからHEC 2 9 3細胞を播種した10 15 centimeterプレートを取り出します。次に、D-N-A-P-E-I溶液を1 µLずつ各プレートにピペットで分注します。プレートを組織培養インキュベーターを用い、37 °C、5% CO2の条件下で4〜6時間インキュベートします。4〜6時間後、プレートから培地を慎重に吸引除去します。次に、10% FBSを含む完全培地25 millilitersを各プレートにピペッティングします。細胞を37°C、5% CO2で約72時間インキュベートします。72時間が経過したら、プレートをインキュベーターから取り出し、組織培養フードに戻します。次に、プレートから培地を吸引することなく、セルスクレイパーを用いてプレート底面から細胞層を培地中に剥離させます。細胞を含む培地を250 milliliterの円錐型遠心チューブに移します。この手順を各トランスフェクション済みプレートに対して繰り返し、すべてのプレートの内容物を同じ250 milliliterの円錐型遠心チューブに回収します。細胞と培地を含むチューブを、冷却した遠心機で遠心分離します。4 °C、3000 rpmで10分間処理してください。遠心分離後、上清を捨て、5 mLのRB TMSバッファーをペレットに加えて再懸濁します。その後、細胞溶液を清潔な15 mLコニカル遠心チューブに移します。15 mLチューブをドライアイス・エタノールバスに入れ、10分間凍結させます。インキュベーション時間が経過した後、チューブを取り出し、37 °Cで10分間置きます。融解させるため、この凍結融解サイクルをさらに2回繰り返します。チューブを数秒間ボルテックスします。最終解凍期間後の各解凍後に、4.8 molar 塩化マグネシウム 1 µLと25 units/µLのBenzon nase 2 µLを細胞溶液にピペットで加え、ボルテックスで混合します。その後、37 °Cで40分間インキュベートします。チューブを4 °Cに冷却した遠心機にかけ、4,000 rpmで40分間遠心分離します。遠心分離の終了間際に、ウイルスの精製に使用するIAL勾配を調製します。具体的には、13 mL密閉遠心チューブに、15% IALを2 mL、25% IALを2 mL、40% IALを1.5 mL、および60% IALを1.5 mL順にピペッティングします。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、遠心管からS上清をピペットで吸い出し、それをIALグラジエントの上にピペットで加えます。その後、管がいっぱいになるまで十分な量のRB TMSバッファーをピペットで加えます。ローターのバランスが適切に取れていることを確認し、管をBeckman 90 TIローターにセットします。16 °Cで、75,000 rpmで1時間遠心分離します。遠心分離後、18ゲージの針を装着した5 mLシリンジをIdAL勾配の40〜60%境界に挿入し、40% IdAL画分を回収します。慎重にシリンジで吸引し、40% IdAL画分を回収してください。シリンジから40%IAL分画を50 milliliterのコニカルチューブに排出します。次に、buffer aを加えて、チューブの最終容量を40 millilitersにします。製造元の指示に従い、high trap Q HPカラムを用いてろ過装置を組み立てます。次に、以下の溶液でカラムを洗浄します。緩衝液Aを25 mL、緩衝液Bを25 mL、緩衝液Aを50 mL、緩衝液Aで調製した viral sample を40 mL、緩衝液Aを50 mL、最後に緩衝液Cを20 mL流します。緩衝液Cを20 mLの Apollo concentrator で回収します。その後、4°Cに設定した冷却遠心機を用いて、3,000 rpmで10分間遠心分離し、遠心分離後にフロースルーを捨てます。次に、Apolloコンセントレーターに冷却したPBSを20 milliliters加え、冷却遠心機を用いて4 °Cで3000 rotations per minuteで10分間、再度遠心分離を行います。再び上清を廃棄した後、冷却したPBSを500 microlitersピペットでメンブレンに滴下し、メンブレンからウイルスを再懸濁させます。その後、ウイルスベクターを10 microliterずつシリコン処理済みのエッペンドルフチューブに分注し、使用時まで-80 °Cで保存します。精製ウイルスの10 microliter分注液を1本、氷上で融解させます。ウイルスの希釈のため、二回蒸留水 40 µL をチューブに分注します。次に、25 units/µL の Ben Nase を 0.2 µL 加え、混合液を 37 °C で 1 時間インキュベートします。その間に、0.2 ng/µL のプラスミド標準液 50 µL を清潔な Eppendorf チューブに分注します。インキュベーション後、ウイルスの入ったチューブに100 millimolar 水酸化ナトリウムを50 microliters加えます。同様に、プラスミド標準の入ったチューブにも加えます。両方のチューブを65 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。30分が経過後、すぐに両方のチューブを氷上で少なくとも5分間冷却します。次に、バイオドットフィルターペーパーと同サイズの転写膜を切り出します。転写膜と3枚のバイオフィルターペーパーを浅いトレイに入れます。トレイに10倍SSCを満たし、メンブレンを20分間浸します。製造元の指示に従って、スロットブロックSF装置をセットアップします。装置を真空フラスコに接続し、ウイルスサンプルの希釈液およびプラスミド標準をロードする各スロットに、10倍SSCを100 µLずつピペットで分注します。4°Cに設定し、13,000 rpmで1分間遠心分離したチューブを、冷却遠心機から取り出します。次に、各チューブに20× SSCを100 µL、6× ローディングダイを1 µL加えます。さらに、各チューブに10× SSCを100 µL分注し、各サンプルを100 µLずつ隣接するスロットにロードします。各サンプルの全量がスロットブロック装置にロードされ、さらに10倍SSCを100 µL以下追加しなくなるまで、希釈およびロードの手順を繰り返します。すべてのサンプルがメンブレンを通過したら、スロットロス装置を分解し、ピンセットでメンブレンを取り出します。メンブレンの端を持つように注意し、inspector linker SL 1000 UVクロスリンカーのチャンバーにメンブレンを設置してください。次に、エネルギー最適（energy optimal）を選択します。架橋には約30秒かかります。1 mLのサケ精子DNAを5分間煮沸し、ハイブリダイゼーションの準備を行います。5分間の煮沸後、サケ精子DNAを直ちに氷上で少なくとも5分間冷却してください。次に、記載されたプロトコルに従って前ハイブリダイゼーション溶液を調製します。サモン精子DNAを含む前ハイブリダイゼーション溶液25 millilitersをハイブリダイゼーションチューブにピペッティングします。架橋したメンブレンを慎重にハイブリダイゼーションチューブに移し、チューブにキャップを閉め、前ハイブリダイゼーション溶液がメンブレンを完全に覆っていることを確認します。水平の状態にしたまま、ハイブリダイゼーションチャンバー内で65 °Cで一晩インキュベートします。翌日、プローブの調製を開始するため、エッペンドルフチューブに50 ngのDNAテンプレートをピペッティングし、10 µLの二回蒸留水を加えて希釈します。希釈したDNAを5分間煮沸し、その後直ちに氷上で少なくとも5分間冷却します。希釈したDNAテンプレートを、室温で13,000 rpmで1分間遠心分離します。その後、施設の放射能安全ガイドラインに従い、DCTPを含まない10 mM DN TPS 2 µLとヘキサヌクレオチド 2 µLを加えて、放射性プローブを調製します。AU 1 µLと³²P-D-C-T-P 5 µLを混合し、37 °Cで1時間インキュベートします。G 50カラムを3000 rpmで2分間遠心分離して調製します。次に、プローブをカラムにロードし、3000 rpmで2分間遠心分離して、フロースルーを回収します。この時点で、標準的な手順を用いてフロースルーの放射能を測定し、プローブの1 mLあたりのcpm（counts per minute）を決定します。次に、プローブを5分間沸騰させます。その後、直ちにプローブを氷上で5分間冷却します。これで、メンブレンを取り出すことなく、プローブをハイブリダイゼーションに使用できる状態になります。5 counts per minute per milliliterの6倍濃度のプローブを、ハイブリダイゼーションチューブ内のプレハイブリダイゼーション溶液に直接ピペットで加えます。ハイブリダイゼーションチャンバーを65 °Cで一晩インキュベートします。翌日、施設内の放射能管理プロトコルに従ってハイブリダイゼーション溶液を廃棄し、25 mLの2×SSCおよび0.1% SDSをチューブにピペットで加え、室温で15分間メンブレンを洗浄します。溶液を廃棄し、0.1倍SSCおよび0.1% SDSを25 mLチューブに入れます。65 °Cで30分間、メンブレンを洗浄します。洗浄後、溶液を廃棄し、室温の0.1倍SSC 25 mLでメンブレンを短時間すすぎます。メンブレンをラップで包み、暗室で露光カセットに入れる。メンブレンの上にフィルムを置き、遮光のためにカセットを閉じる。露光カセットを−80°Cのフリーザーに6時間入れる。6時間後、フィルムを現像し、ウイルスバンドの密度をプラスミド標準のバンドと比較して、ウイルスストックのタイターを決定します。タイターが決定したら、そのウイルスを用いて細胞に導入（トランスダクション）することができます。まず、1×10⁴個のHEK 293 TT細胞を播種します。96ウェルプレートの各ウェルにおいて、37 °C、5% carbon dioxide インキュベーター内で細胞を少なくとも18時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから培地を吸引し、抗生物質およびFBSを含まない培地50 µLを各ウェルに慎重にピペッティングします。この培地を吸引し、細胞を洗浄するためにこの工程を繰り返します。組換えa a vベクターを、FBSおよび抗生物質を含まない培地で、最終濃度が細胞当たり5,000 VGSになるように希釈します。この溶液50 µL、または陰性対照としてFBSを含まない培地50 µLを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、37 °C、5% CO2インキュベーターで2時間インキュベートします。インキュベート後、ウイルスを含む培地を除去し、1ウェルあたり50 µLの完全培地を用いて、前述と同様に細胞を2回洗浄します。最後の洗浄液を捨てた後、各ウェルに150 µLの完全培地を加え、37 °C、5% CO2インキュベーター内で72時間培養します。最後に、蛍光顕微鏡を用いてEGFPの発現を可視化します。蛍光強度はImage Jソフトウェアを用いて定量でき、トランス遺伝子の発現は視野あたりの緑色蛍光の総面積として評価されます。RAV3ベクターの力価を決定するための定量的DNAスロットブロットの例をここに示します。このメンブレンは、$^{32}\text{P}$標識されたEGFP特異的DNAプローブでハイブリダイゼーションされています。ブロットの上段は、BenNaseで消化した精製ウイルスストックの2倍希釈系列で構成されています。中段および下段の行は、それぞれ1 ngまたは10 ngのプラスミドから希釈したA-A-V-E-G-F-P標準試料で構成されています。ウイルスストックのタイターは、これらのプラスミド標準試料との比較によって決定されます。ブロット上に示されている数値は、プラスミドDNAのコピー数に対応しています。これは、組換えAAVベクターを用いた導入遺伝子の発現例です。ヒト肝芽腫細胞株において、トランスダクションから72時間後に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察しました。最初の画像は、モック感染の結果を示しています。2枚目の画像は、37°Cで2時間、全AAV2-EGFPベクターを1細胞あたり5,000 VGで導入したHEP 2 93 TT細胞を示しています。最後の画像は、同じ条件下で1細胞あたり5,000 VGのRAAV3-EGFPを導入した結果を示しています。RAAV3は、RAAV2と比較して、この細胞種への導入効率が格段に高いことがわかります。この手法は、ヒト肝細胞がん細胞をどのように標的とするかなど、遺伝子治療分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。V3はヒト肝細胞がんにおいて特異的に治療用遺伝子を高レベルで発現させる能力を持つため、この技術の意義はヒト肝細胞がんの治療へと広がります。

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Medicine

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