干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

本実験の全体的な目的は、Irisと呼ばれる高感度でラベルフリーなセンシングプラットフォームを用いて、表面に固定化された抗原への抗体の結合を定量化することである。これは、まず化学的に機能化された均一な二酸化ケイ素表面上に、溶液中から標的タンパク質を捕捉するためのテストプローブおよびコントロールプローブのアレイを調製することによって達成される。固定化されるプローブは、抗体または抗原、DNAまたはRNA、あるいは機能化されたポリマー表面やその他の表面化学と適合するあらゆる種類の高分子であることができる。

調製したマイクロアレイを、目的のタンパク質を含むサンプルとともにインキュベートし、研究者が指定した条件下で結合させます。次に、センサーアレイ全体を異なる波長の光で撮像します。IRISシステムでは、各ピクセルの反射強度がカスタムコード化されたアルゴリズムによって処理されます。

各試験条件または対照条件に結合したバイオマテリアルの量を定量するために、本システムの干渉計を用いたラベルフリー測定に基づき、複合混合物中の抗体の効果的な検出および絶対定量を示すインキュベーション後の結果を取得します。光学干渉および樹脂キャビティデバイスに関する10年以上の研究開発に基づき、従来のラベルフリーバイオセンサーシステムで直面した多くの混乱を招く問題を克服できるこの新しい手法を開発しました。データ収集ステップにおいて正しい正規化が必要であり、正確で再現性のあるデータ取得を確実にするための品質管理手順に従う必要があるため、この手法を視覚的に実演することが不可欠です。

二酸化ケイ素基板を自己吸収性copo dmma NASマップでコーティングするために、まず100 mgのポリマーを5 mLの脱イオン水に加えてポリマー溶液を調製します。次に、最終的な硫酸アンモニウム濃度が0.92 Mとなるように、40%飽和硫酸アンモニウムを5 mL加えます。その後、チップをポリマー溶液に浸し、シェーカーを用いて30分間インキュベートします。

チップを脱イオン水で十分にすすぎ、アルゴンまたは窒素ガスで乾燥させた後、80 °Cで15分間ベークします。ポリマーコートされた基板チップは、プローブのスポット操作まで、真空デシケーターなどの乾燥した環境で最大2〜3ヶ月間保存してください。まず、希望する最終濃度にするために、プローブストック溶液と緩衝液の適切な量を決定します。

典型的な実験では、抗原またはIgGを0.5 mg/mLの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に調製し、所定量のPBSバッファーを入れた小型エッペンドルフチューブに、各プローブストック溶液の計算量を加えて混合します。次に、これらのプローブ溶液を、スポッターのソースプレートとして使用する96ウェル低タンパク吸着プレートにピペッティングします。続いて、グリッドあたりの各条件の反復回数を決定し、プリントアレイのスポッティングパラメータを設定します。

グリッドにより、繰り返しグリッドの数とチップ上の希望のスポット位置が決定されます。基板とソースプレートをスポッターにセットし、廃棄ボトルと供給ボトルを確認してください。その後、プリンティングを開始します。

スポッティング終了後、基板を高湿度環境に一晩置き、インキュベーション後の固定化および不活性化プロセスを進行させます。チップを0.1% tween含有PBSに3分間浸し、この操作を計3回繰り返して、撹拌しながら基板を洗浄します。続いて、PBSで3分間のインキュベーションを3回行い、最後に脱イオン水で同様に3分間のインキュベーションを3回行います。

ドライ測定を行う場合は、アルゴンガスでチップを十分に乾燥させてください。シェーカープレート上で、pH 7.4に調整した50 millimolarのエタノールアミン溶液にチップを30分間浸し、共重合体表面に残っているNHS基を失活させます。インキュベーション手順を開始する前に、PBSおよび脱イオン水を用いてエタノールアミンを十分に洗浄してください。

本デモンストレーションのために、PBSを用いて適切な濃度の標的タンパク質溶液を調製します。ここでは500 ng/mLの抗ヒト血清アルブミンを使用し、陰性対照のインキュベーション用には標的を含まない同量のバッファーを用意します。アイリスシステムは、光源、センサープローブアレイを適切に照射するための光学部品、反射光強度を記録するためのカメラ、および測定のためにサンプルを設置するステージなどの基本的な要素で構成されています。

スキャンを行う前に、その後収集されるすべてのデータを正規化するため、まず洗浄済みのベアシリコンチップを用いてシリコンミラーのスキャンから開始します。実験に合わせてパラメータを調整し、アイリスシステムを準備します。これには、カメラが記録する光強度のヒストグラムを測定し、最適な強度が得られるよう露光時間を設定することが含まれます。

ノーマライゼーションスキャン後、準備したプローブアレイをirisシステムにロードし、前述と同様にセットアップを行い、基板表面を正しく結像するようにフォーカスを調整します。反射光強度の記録されたヒストグラムを確認し、サンプルステージが水平であることを確認してください。最後に、データを保存するためのファイル名を選択します。

ソフトウェアを初期化してアレイをスキャンします。これにより、異なる波長で表面を何度も照射し、収集した画像を平均化します。まず、ティーチスポットの初期光学的な高さが決定され、これにより初期スキャンの後のインキュベーションに伴う表面上の質量変化を適切に分析することが可能になります。初期スキャンの後、チップを調製したインキュベーション溶液に浸し、シェーカープレート上で1時間置きます。インキュベーション時間は、植生レベル、検出対象の濃度、およびターゲットとプローブのペアの親和性によって大きく異なります。

インキュベーション後、前述した洗浄手順を繰り返します。irisシステムを用いて同じプロアレイをスキャンし、インキュベーション前の状態と比較するためのインキュベーション後の画像を取得します。必要に応じて、この工程を異なるインキュベーションステップで繰り返すことができます。

例えば、二次抗体を用いるサンドイッチアッセイ形式では、市販のソフトウェアを使用して各アイリススキャンの収集画像をフィッティングし、光学的厚さの形成を含むプローブの画像を生成します。インキュベーション後と前の画像を差し引くことで、結合の簡易的な定性分析を行うことができます。結合は、質量の変化が観察されたスポットにおける強度の変化として現れます。

定量分析を行うには、スポット内の各ピクセルの光学厚さの情報と、スポット外の環状領域（アニュラス）の情報を平均化することにより、背景と比較した各スポットの質量密度を決定します。次に、ここに示すこれら2つの領域を直接比較します。例として、代表的な抗体アレイがスポットされた、層状のシリコンおよび二酸化ケイ素アイリス基板の概略図を示します。

各抗体アンサンブルは、異なるタンパク質を標的とする異なるエピトープへの特異性を持ち、重複してスポットされています。例として、2種類の全ウイルスと1種類のウイルスタンパク質を示しています。ターゲットについて。陰性対照抗体はアッセイによって異なり、非特異的、あるいはウイルス特異的である場合があります。

ヒト血清アルブミン（HSA）特異的抗体と、ここに示されているスポット済みのHSAおよびコントロールのウサギIgGスポットとの結合に関する定性的結果の例を以下に示します。インキュベーション前後の画像についてフィッティングを行い、光学的厚さを決定した後、結合アレイの差分画像を作成することで、結合状態を迅速に評価できます。さらに定量的な解析を行うと、抗HSA抗体のインキュベーション濃度 500 nanograms per milliliter において、HSAスポットでは 2.05 nanometer、ウサギIgGスポットでは 0.13 nanometer の平均光学的高さの変化が観察されました。

この棒グラフは、irisによる測定で得られる定量データの例を示しています。この例では、タンパク質結合のタンパク質濃度および二本鎖リガメント長への依存性が示されています。この棒グラフは、初期の固定化リガメントプロープの高さ、および結合後のインキュベーション後の絶対光学的高さの測定値を示しています。

furタンパク質の濃度を5、100、200 nanomolarに増加させると、DNAプローブへの結合が増加しました。ここでは、二本鎖DNAリガメントあたりの計算されたfurタンパク質二量体の結合量を示します。furタンパク質濃度が200 nanomolarにおいて二量体結合が有意に増加しており、これは高レベルの非特異的なリガメント間相互作用、あるいは複数の二量体の凝集などの異なるfurタンパク質結合メカニズムを示唆しています。

この手順を行う際は、適切な酸化膜厚を持つ、清潔で均一な基板から開始すること、およびピンセットを用いて慎重に取り扱い、サンプルの清潔さを維持することが重要です。また、適切に保存され、機能することが確認されている試薬を使用することも極めて重要です。このビデオを視聴することで、二酸化ケイ素表面への機能性プローブアレイの作製を通じた、ラベルフリー形式でのバイオ分子挙動の測定方法に加え、干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いたデータ収集および解析方法について十分に理解できるはずです。