使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

この手順の全体的な目標は、動物細胞と単離細胞の両方における膜修復能力を評価することです。単離された骨格筋線維を採取し、FM1 43色素を含有する培地で囲む。次に、UVレーザーを使用して細胞膜の一部を照射し、損傷を与えて、色素が細胞に侵入できるようにします。

単離された細胞にGFP MG 53を発現する血漿DNAをトランスフェクションすると、細胞の原形質膜と細胞質に局在します。次に、マイクロ電極の先端をC 2 C 12メンブレンに挿入して損傷を誘発します。最終的に、GFP MG 53の損傷部位への転座を示す結果を得ることができます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、マイクロ電極の浸透と筋線維の分離の技術を習得するために必要な実践のために重要です。その手順を実演するのは、研究室長のLin博士、ポスドク研究員のWazu博士、大学院生のMatt Orange博士、そして本専攻の研究助教授であるShaza博士です。まず、実験中に動物から廃棄物を収集するために、トレッドミルの下にトレイまたは青いラボパッドを置きます。

次に、トレッドミルの表面の角度を設定します。一部のトレッドミルには傾斜を調整するための一体型装置がありますが、他のトレッドミルは他の手段でトレッドミルを上昇させる必要があります。一般的には、下り坂または上り坂の平らな面または7〜15度の角度が使用されます。

電力網をオフにし、ベルト駆動モーターをオンにした状態でマウスをトレッドミルに置き、順応期間後15分間動かない場合は、やる気を起こさせる電力網をオンにします。トレッドミルは、毎分約5メートルの初速度で始動します。毎分1〜2メートルの速度が上がるため、動物には5分間のウォームアップ期間を設けます。

このウォームアップ期間を毎日3〜10日間繰り返して、テスト中のコンプライアンスを向上させます。急性疲労運動を行うため。最高速度に達するまで、時間の経過とともにトレッドミルの速度を上げ、疲労の兆候がないか監視します。

動物は、トレッドミルから離れている時間の半分以上、またはグリッド上で5秒連続して過ごしている場合、疲れ果てていると見なされます。消耗したマウスを取り外し、合計実行時間を記録します。持久力トレーニング。

実行中のプロトコルは、同じウォームアップ手順で開始します。ただし、一般的に最高速度は遅く、実行時間はかなり長くなる可能性があります。テスト後、マウスを自宅のケージに戻し、70%エタノールでトレッドミルを清掃します。

さらに分析するために、四指屈筋の表層を足から分離します。まず、足裏の皮膚を正中線で切り、下の筋肉を傷つけないように注意します。次に、横に切り込みを入れて皮膚を切除します。

踵骨に付着しているFDB筋の平らな白い腱を特定します。鉗子を使用して、付着部位に近い腱を分離し、切断します。結合組織を切り取りながら、腱をそっと引き上げます。

遠位腱が個々の指に分岐する場所を特定します。腱が筋肉のより深い層に接続されている部分を切断し、FDBを取り除きます。FDB筋束を1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液に入れ、摂氏37度に予温します。

チューブを摂氏37度のオービタルシェーカーに水平にテープで固定し、200RPMで65分間振とうします。十分な消化は、恐ろしい外観と淡い色によって特徴付けられます。1ミリリットルのピペットチップの端をカットして、消化された束が通過できるようにします。

バンドルを約600マイクロリットルの2.5を含む遠心分離管に簡単に移します。カルシウムチロ。チューブをそっと裏返して、束から緩い繊維を振り落とします。

次に、30マイクロリットルのピペットチップの端をカットして、直径が筋肉の束よりわずかに小さくなるようにします。このヒントを使用して、バンドルをピペットに引き込み、溶液に戻します。このプロセスを繰り返して、ファイバーの大部分がバンドルから関連付け解除されるまで繰り返します。

チューブを静かに回して、解離した繊維を混合します。必要な量を取り出し、ガラス底のデルタT皿に落とします。残りの繊維は、使用および追加の研究のために摂氏4度で約6時間保管します。

皿を5分間邪魔されずに置きます。これにより、繊維が皿のガラス底に付着します。ガラス底皿をUVレーザーを備えた共焦点顕微鏡に置きます。

位相顕微鏡で100倍以上の倍率で繊維を観察し、通常の縞模様と直線状の棒状形状の存在を確認します。FM 1 43またはFM 4 64スチロ会陰ダイを溶液に加え、最終濃度2.5マイクロモルにします。ファイバーを視野の左上から右下まで 45 度の角度で向き、損傷を誘発します。

原形質膜の5×5ピクセルの領域に照射します。最大出力に設定されたUVレーザーを5秒間使用して、照射領域は原形質膜を分割し、5×5ボックスの半分はファイバーの内側にあり、残りはファイバーの外側にある必要があります。最大5分間、それぞれ5秒間隔でファイバーに染料が侵入する画像をキャプチャします。1皿につき3本のファイバーのみを照射できるのは、蛍光色素が最終的にファイバーにエンドサイトースされ、データ分析を複雑にするためです。

3つの繊維を使用した後、新しい料理を準備する必要があります。解析ソフトウェアを使用して、約200平方ミクロンの領域の蛍光強度の変化を計算し、ファイバー間を比較します。次の計算は、各フレームのデルタFをFゼロで割った値に対して行う必要があります。ここで、Fゼロは最初にキャプチャされたフレームの関心領域の平均蛍光、デルタFは後続の各フレームの蛍光の変化です。

標準的な方法を使用して、GFP MG 53を発現するプラスミドDNAを細胞にトランスフェクションします。次に、マイクロピペットを準備します。パイレックスキャピラリーをマイクロピペットに置きます。

プリセットプログラムで引っ張って引っ張ります。マイクロピペットを3軸マイクロマニピュレーター培養物に取り付けます。メディアをデルタTディッシュから取り出し、2.5ミリモルのカルシウムチロバッファーと交換します。

トランスフェクションされた細胞を含むディッシュを、40 x 1.3 NAの油浸対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡に置きます。マイクロピペットを細胞膜に挿入し、マイクロピペットを細胞から迅速に引き抜くことにより、急性生細胞損傷を誘発します。トロポニン誘発性膜破壊について、フレームあたり1.54秒の間隔で連続した生細胞画像を収集します。

PERFU 0.005%トロポニンを、画像化される細胞の真上で毎分約1ミリリットルの割合で投与します。トレッドミルは、走行能力の減少を測定するために使用できます。ここで見られるMG53ノックアウトマウスは、骨格筋の損傷により走行能力が低下しています。

UVレーザーによる損傷の程度は、見られる繊維の膜修復能力によって異なります。これは、正常なマウスの損傷前の繊維です。この画像は200秒後に撮影されたもので、軽度の傷が写っています。

MG 53ノックアウトマウス由来の筋線維で、膜修復能力が低下していると、傷害後に色素の侵入が顕著になります。これは、損傷を受けていないGFP MG 53トランスフェクションされたC two C 12 myoチューブの例です。この画像の矢印は、損傷部位に向かって移動する小胞を含むGFP MG 53を指しています。

この例では、サポニンを使用して原形質膜を損傷しました。損傷後のGFP MG 53のサイトゾルから細胞膜への転座に注意してください。この手順を試みるときは、滑らかなサラール膜と明確な縞模様を持つ良好な筋線維を分離することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見れば、筋肉の膜修復能力と培養細胞の膜修復能力を評価する方法についてよく理解できるはずです。