使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

本手順の目的は、動物個体および単離細胞の両方において、膜修復能を評価することです。単離した骨格筋線維を回収し、FM 1 43 染料を含む培地で満たします。その後、UVレーザーを用いて細胞膜の一部を照射・損傷させ、細胞内へ染料を浸入させます。

単離した細胞に、細胞の細胞質および細胞膜に局在するGFP MG 53を発現するプラスミドDNAをトランスフェクションします。次に、マイクロ電極の先端をC two C 12膜に挿入し、損傷を誘発します。最終的に、GFP MG 53が損傷部位へ移行することを示す結果を得ることができます。

マイクロ電極の刺入と筋線維の単離技術を習得するには習熟が必要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。手順の提示は、ラボマネージャーのDr.Lin、ポストドク研究員のDr.Wazu、大学院生のMatt Orange、および当部門のリサーチアシスタント教授であるDr.Shazaが行います。まず、実験中の動物からの排泄物を回収するため、トレッドミルの下にトレイまたは青色のラボパッドを設置してください。

次に、トレッドミルの表面角度を設定します。トレッドミルによっては傾斜を調整する装置が組み込まれていますが、他の方法でトレッドミルを昇降させる必要があるものもあります。一般的に、水平面または下りか上りの7度から15度の角度が使用されます。

電気グリッドをオフにし、ベルト駆動モーターをオンにした状態でマウスをトレッドミルに乗せ、慣らします。この慣らし期間の15分後、モチベーション維持のための電気グリッドをオンにします。トレッドミルを分速約5mの初速度で始動させます。1分ごとに速度を1〜2m/分ずつ上げながら、動物に5分間のウォーミングアップ期間を設けます。

テスト中のコンプライアンスを高めるため、このウォームアップ期間を3〜10日間、毎日繰り返します。急性疲労運動を行うには、最大速度に達するまでトレッドミルの速度を徐々に上げ、疲労の兆候をモニターします。

動物がトレッドミルから外れた時間が全体の半分を超えた場合、またはグリッド上に5秒間連続して留まった場合に、疲労したとみなします。疲労したマウスを取り除き、総走行時間を記録します。持久力トレーニング。

走行プロトコルは、すべて同一のウォームアップ手順から開始します。ただし、最大速度は概して低く、走行時間はかなり長くなる場合があります。試験後、マウスをホームケージに戻し、トレッドミルを70% ethanolで清掃してください。

さらなる解析のため、足底の短趾屈筋の浅層を分離します。まず、下層の筋肉を傷つけないように注意しながら、足底の皮膚を正中線に沿って切開します。次に、水平方向に切開を加え、皮膚を除去します。

踵骨に付着しているFDB筋の扁平で白い腱を確認します。ピンセットを使用して腱を分離し、付着部位の近くで切断します。結合組織を除去しながら、腱をゆっくりと上に引き上げます。

遠位腱が各指に分かれている箇所を確認します。腱が深層の筋肉に接続している部分で切断し、FDBを除去します。FDBの筋肉束を、37 °Cに予熱した1 mLのコラゲナーゼ溶液に入れます。

チューブを37 °Cのオービタルシェーカーに水平に固定し、200 RPMで65分間振盪させます。十分な消化が進むと、外見が崩れ、色が淡くなります。1 mLピペットチップの先端をカットし、消化した束が通過できるようにします。

束を、約600 µLの2.5. Calcium tyroを含む遠心チューブに容易に移します。チューブを静かに反転させ、束から外れた繊維を振り落としてください。

次に、30 µL ピペットチップの先端を切り、直径が筋束よりもわずかに小さい状態にします。このチップを使用して筋束をピペット内に吸い込み、その後、溶液中に押し戻します。この操作を、大部分の線維が筋束から解離するまで繰り返します。

チューブをゆっくりと回転させ、分離した繊維を混ぜ合わせます。必要量を分取し、ガラス底のdelta Tディッシュに滴下します。残りの繊維は、今後の使用および追加研究のため、4 °Cで約6時間保存します。

ディッシュを5分間静置します。これにより、線維がディッシュのガラス底に付着します。UVレーザーを備えた共焦点顕微鏡にガラス底ディッシュを設置します。

位相差顕微鏡を用いて100倍以上の倍率で繊維を観察し、正常な横紋パターンの有無および直線的な棒状の形態を確認します。溶液にFM 1 43またはFM 4 64 styro perineum色素を加え、最終濃度を2.5 micromolarにします。損傷を誘発させるため、視野の左上から右下に向かって繊維を45度の角度に配置します。

プラズマ膜の5×5ピクセルの領域に照射します。最大出力に設定したUVレーザーを5秒間照射し、照射領域によってプラズマ膜を分割させます。このとき、5×5のボックスの半分がファイバーの内部に、残りがファイバーの外部に位置するようにしてください。その後、染料がファイバー内へ進入する様子を、5秒間隔で最大5分間まで撮影します。蛍光染料は最終的にファイバー内にエンドサイトーシスされるため、データ解析を困難にする恐れがあります。そのため、1つのディッシュあたり照射できるファイバーは3本までとしてください。

3本のファイバーを使用した後、新しいディッシュを準備する必要があります。解析ソフトウェアを使用して、ファイバー間での比較のために、約200平方ミクロンの領域における蛍光強度の変化を算出します。各フレームについて、delta F / F zero の計算を行います。ここで、F zeroは最初にキャプチャしたフレームにおける関心領域の平均蛍光強度であり、delta Fはそれ以降の各フレームにおける蛍光強度の変化量です。

標準的な方法を用いて、GFP MG 53を発現するプラスミドDNAを細胞に導入します。次に、マイクロピペットを準備します。Pyrexキャピラリーをマイクロピペットに取り付けます。

プリセットプログラムに従ってプル（引き出し）操作を行います。マイクロピペットを3軸マイクロマニピュレーターに装着します。delta Tディッシュから培養液を除去し、2.5 millimolar カルシウム含有タイロ緩衝液に置換します。

40 x 1.3 NA油浸対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡に、形質導入細胞を含むディッシュを設置します。マイクロピペットを細胞膜に挿入し、その後素早く細胞から引き抜くことで、生細胞に急性損傷を誘発します。トロポニンによる膜破壊について、1フレームあたり1.54秒の間隔で連続的に生細胞画像を収集します。

イメージングしている細胞の直上に、0.005% troponinを約1 mL/minの速度で灌流します。トレッドミルを用いて、走行能力の低下を測定できます。ここで示しているMG 53ノックアウトマウスは、骨格筋の損傷により走行能力が低下しています。

UVレーザーによる損傷の程度は、観察される線維の膜修復能に依存します。ここでは、正常なマウスにおける損傷前の線維を示します。この画像は200秒後に撮影されたもので、わずかな損傷が見られます。

膜修復能が損なわれたMG 53ノックアウトマウス由来の筋線維では、損傷後に、より顕著な色素の流入が見られます。ここに、未損傷のGFP MG 53導入C2C12筋管の例を示します。この画像の矢印は、損傷部位に向かって移動するGFP MG 53含有小胞を指しています。

この例では、細胞質膜を損傷させるためにサポニンを使用しました。損傷後、GFP MG 53が細胞質から細胞膜へと移行することに注目してください。この手順を行う際は、細胞膜が滑らかで横紋パターンが明瞭な、質の良い筋線維を単離することが重要です。

このビデオを視聴することで、筋肉の膜修復能の評価方法、および細胞の培養方法について深く理解することができます。