光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動
2011年10月31日
この記事では、マウスの嗅球の表面にマップ臭気誘発活動に固有の光信号とflavoproteins自家蛍光信号のイメージングのプロトコルを示す。
この実験の全体的な目標は、マウスに麻酔をかけ、頭蓋骨を露出させた後、固有の光学信号とフラビンタンパク質自己蛍光シグナル、またはFASイメージングを使用して、マウスの嗅球の表面で匂い誘発活動をマッピングすることです。嗅球の上の骨が薄くなっています。メスの刃先で骨の皮弁を引いてから取り出し、歯科用セメントでできたチャンバーを取り出し、嗅球の露出面を囲みます。
それはアロスで満たされ、カバーグラスがこの準備の上に置かれます。嗅覚マップは、固有の光学信号とFASイメージングを使用して同じマウスで連続的に取得され、光反射率と自己蛍光信号を使用してマウスの嗅球内の他の誘発活動をイメージングすることは、嗅球の秩序の特別なコーティングに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法が2つのドキシグルコースイメージングやFMRIなどの既存の方法よりも優れている点は、1つのグラマーリストの特別な解像度でオーダーエボク活性を記録できることです。
一般に、これらの方法に不慣れな個人は、外科的スキルと器械的スキルの両方の習得が遅いため、仕事の開始時に困難を抱えます。この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、外科的およびイメージング手順の重要なステップに注意を引くために重要です。マウスの後足をつまんで麻酔を確認し、バリカンを使用して頭皮から毛を取り除きます。
蒸留水に浸した滅菌ガーゼパッドで皮膚に残った髪の毛を拭き取ります。マウスを脳定位固定装置フレームに配置し、鼻が後頭部と同じ平面になるようにします。嗅球を水平に配置するには、動きを防ぐために耳と鼻のバーをしっかりと固定してください。
画像撮影時の乾燥を防ぐために眼軟膏を目に塗布した後、滅菌ハサミで頭皮周辺をベタジンで消毒します。後頭部の耳と耳の間を切開し、耳の付け根に向かって両側を、まぶたに沿って額に向かって前後方向に切り込みを入れます。鼻の皮膚を切って頭皮を取り除きます。
ノーズバーをガイドとして使用します。動物を実体顕微鏡の下に置き、生理食塩水に浸した綿棒を使用して、頭蓋骨上部の骨膜をそっと剥がします。一対の鉗子を使用して残りの組織を取り除き、メスで頭蓋骨の表面をこすり落とし、実験全体で嗅球領域を湿らせておくために、きれいな準備を確保します。
吸収性ゼラチン、蒸留水に浸したスポンジを、目の間にある嗅球の上の骨の上に置きます。ゼラチンスポンジを取り外し、10番のメスの刃で骨を優しくこすり落とすことから始めます。ブレードと骨の間の角度を45度一定に保ち、ブレードをまぶたから球根領域の矢状側に移動します。
薄くなる過程で骨に垂直方向の圧力をかけたり、静脈洞の上の骨を傷つけたりしないように注意してください。5分ごとに停止し、水和ゼラチンスポンジを骨に置き、準備を冷やします。スポンジで頭蓋骨を綿棒で拭いて骨を取り除き、ほこりを取り除き、メスの先端を定期的に拭いて、清潔に保ち、鋭利に保ちます。
海綿状の骨層または小柱が見えるまで続けます。嗅球の細かい血管系が見えてきたら、骨を引っ掻くのをやめて、11番のメスの先端で長方形の領域を描き、嗅球を閉じます。窓を静脈洞の境界内に保つと、長方形の領域内の骨が引っ掻かれ続けます。
メスの先端の深さには特に注意して、硬膜の表面に触れないように注意してください。残った骨の厚みを実感するために、鉗子のパラの先端で優しく押します。圧力がかかると骨が折れてしまう場合は、次のステップに進みます。
生理食塩水を一滴加え、メスの先端を水平に向け、骨フラップを持ち上げます。残りの骨が引き裂かれないように、鉗子を使用してフラップを慎重に取り外します。嗅球の表面が露出したら、出血や血管がないことを確認します。吻合。
生理食塩水に浸したゼラチンスポンジでその部分を拭きます。嗅球を湿らせておくために、29ゲージの注射器を使用してポリアクリレート歯科用セメントを塗布し、頭蓋窓の周りの骨にウェルを形成します。硬膜の上に低融点のアロスを滴下し、頭蓋窓に滅菌カバーガラスを置いてイメージングします。.
頭蓋窓を視野の中央に合わせ、脳位固定装置フレームを実体顕微鏡の下に置いて、毛細血管を視界に浮かべます。580ナノメートルの緑色光に切り替えて解剖学的制御画像を取得し、イメージング中の準備の状態を確認します。次いで、630ナノメートルの照明下での内因性光学信号イメージングまたは480ナノメートルの照明下でのフラビンタンパク質自己蛍光シグナルイメージングのいずれかを使用して刺激試験を捕捉することに進む、標準的なイメージングセッションは、空気のみが供給される5〜10秒のベースラインを含み、その後、選択された臭気濃度に応じて3〜10秒間の臭気刺激が続く。
そして最後に、ベースラインの回復のために70〜82秒の空気供給が記録されます。ここでは、嗅球の血管系を頭蓋窓を通して画像化し、続いて、iOSとFASの両方のイメージングを使用して捕捉された匂い物質としてh sinalを使用した刺激試験の結果を示します。iOSイメージングでは、ALによって活性化された吸光度領域の暗い領域を白い矢印で示し、活性領域は単一および平均化された複数の試行で確認できるため、臭気誘発活動が表示されます。
同じマウスOD誘発活性でFASイメージングに切り替えると、黒色の矢印で示される自家蛍光発光の白い領域として表示され、単一および平均化された複数の試験でも見ることができます。iOSイメージングで見られる吸収のブラックゾーンと、FASイメージングで見られる自家蛍光発光のホワイトエリアの両方が重なっていることに注目してください。この空間的な一致は、2つの技術が同じ嗅覚糸球体の視覚化を可能にすることを確認しています 一度マスターイメージング順序を呼び起こす 光反射率と自家蛍光信号を使用して、手術で1時間、画像取得で数時間で行うことができます。
これらの光学イメージング方法を使用することの主な欠点は、自由に動くマウスのように嗅覚マップを視覚化するために適用できないという事実です。そして、生体組織への光子の浸透が限られているため、90年代後半に発症した後、腹側嗅覚糸球体へのアクセスを得られず、嗅覚系に内因性信号を記録します。おそらく、光学イメージングの分野の研究者がODの特殊コーティングの特性を探求する方法です。
嗅球フラビンタンパク質自家蛍光イメージングは、内因性光信号を用いたODの特殊コーティングに新たな知見をもたらす有望な技術です。
概要
この記事では、マウスの嗅球表面における臭気誘発活動をマッピングするための固有光学信号とフラボプロテイン自己蛍光信号のイメージングプロトコルを紹介します。説明されている方法により、嗅球活動の高解像度イメージングが可能となり、嗅覚の神経メカニズムについての洞察が得られます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 嗅覚処理
- イメージング技術
背景
- 嗅覚処理の理解は、感覚知覚への洞察に不可欠です。
- 固有光学信号やフラボプロテイン自己蛍光などのイメージング技術は、脳活動の研究に有用です。
- 臭気誘発活動のマッピングは、感覚反応の空間組織を明らかにすることができます。
- 既存の方法では、詳細な分析に必要な解像度が不足している可能性があります。
研究の目的
- 嗅球における臭気誘発活動のマッピングプロトコルを開発すること。
- 固有光学信号とフラボプロテイン自己蛍光を用いて高解像度イメージングを実現すること。
- これらのイメージング技術の従来の方法に対する利点を実証すること。
使用した方法
- マウスを麻酔し、嗅球の露出によってイメージングの準備を行います。
- 嗅球の上の骨を薄くして、イメージングを可能にします。
- 連続的なイメージングにより、固有光学信号とフラボプロテイン自己蛍光の両方を使用して、臭気刺激に対する反応を捉えます。
- イメージングセッションには、誘発活動を評価するためのベースラインと臭気刺激フェーズが含まれます。
主な結果
- 臭気誘発活動は、吸収と自己蛍光の領域として可視化されます。
- 結果は、異なる臭気に対する反応における活性化の異なるパターンを示します。
- 両方のイメージング技術は、嗅球活動に関する補完的な情報を提供します。
- 高い空間分解能により、感覚反応の詳細なマッピングが可能になります。
結論
- 開発されたプロトコルにより、嗅球活動の効果的なマッピングが可能になります。
- 固有光学信号とフラボプロテイン自己蛍光は、神経科学研究のための強力なツールです。
- これらの方法により、脳における感覚処理の理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Mapping odor-evoked neural activity in the olfactory bulb supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling visualization of functional neural circuits involved in sensory processing. This approach provides mechanistic de-risking for compounds targeting olfactory pathways or related neurological disorders by linking molecular interventions to measurable changes in neural activation patterns. The technique enhances predictive confidence in early discovery by offering a disease-relevant system to assess target engagement and circuit-level effects prior to phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing odor-evoked activation patterns in glomeruli as functional modules of sensory processing.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of neural circuit engagement in response to sensory stimuli.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking target modulation to measurable changes in spatial activation maps.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and evoked activity profiles in the olfactory bulb.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential imaging of intrinsic optical signals and flavoprotein autofluorescence under controlled stimulation.
- Scalability: Highlights platform reuse across stimulation trials and odorants to enable reliable compound evaluation in sensory neuroscience.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to neurological disorders.
- Mechanistic De-risking: Describes continuity from discovery through preclinical validation by mapping neural responses that reflect target-mediated changes in brain activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by providing quantitative spatial readouts that correlate with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation by providing neural activity readouts that inform target confidence and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by visualizing odor-evoked activation in glomeruli.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through sequential baseline and stimulation imaging using 630 nm and 480 nm illumination.
- Analytics: Highlights measurements such as absorbance changes (intrinsic optical signals) and autofluorescence emission (flavoprotein signals) that enable comparison of neural activation across conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to therapeutic targeting.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for longitudinal studies and cross-compound comparison in the same preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in sensory processing pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of neural activity mapping across trials and subjects.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuroscience programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on neural activation thresholds and spatial patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroscience, surgical preparation, and optical imaging techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including stereotaxic frame, stereo microscope, light sources at 580 nm, 630 nm, and 480 nm, and image acquisition systems.
- Cross-team standardization requirements for surgical preparation, anesthesia depth, and imaging parameters across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, noting current application in mouse olfactory bulb with potential for extension to other sensory regions.
- Practical limitations supported by source material: inability to visualize olfactory maps in freely moving mice and limited photon penetration restricting access to ventral olfactory glomeruli.
