シンプルでコンピュータ支援嗅覚テストマウス用

本実験の目的は、マウスにおける先天的な嗅覚識別能、嗅覚的な嗜好性または忌避性、および嗅覚感度を検証することです。これは、マウスを新規の誘引物質（アトラクタント）または忌避物質（アペラント）と、中性臭である水に曝露させることで行われます。その間、ビデオカメラで行動セッションを記録します。

次に、提供されたマクロを用いてImage Jでビデオを解析し、 odor（臭気）およびwater（水）のパラメータに費やした時間を算出します。事後的なコンピュータ支援解析に基づいた結果から、異なる遺伝子型間における水と比較した臭気への嗜好性または回避行動が示されます。専用のアリーナや嗅覚測定装置を使用する場合と比較して、この嗅覚試験の主な利点は、使い慣れたアリーナを使用するため、セットアップが簡単で迅速に完了できることです。

さらに、本手法では安価なハードウェアを使用します。手順のデモンストレーションは、当研究室の学生であるEmmanuel Abryが行います。本実験では、3〜5ヶ月齢のC57BL/6野生型およびトランスジェニックの雄マウスを使用します。このデモンストレーションでは、2つのノックアウト系統と、そのリッターメイト（同腹）コントロールを使用しています。

実験用アリーナには、3 cmの敷材を入れた清潔で滅菌済みのマウスケージを使用します。次に、カメラを設置します。特製の三脚マウントを用い、ケージの底面から58 cm上の位置に配置してください。

ケージを配置する位置がわかるように、カウンター上に印を付けます。中心の画像を撮影する場合、カメラを320×240ピクセルの解像度、約15 fpsで録画するように設定してください。テストの準備として、可能な限り各香りの濃縮液を溶媒に保存しておいてください。

嗜好性試験では、ピーナッツオイルを用いて10% (w/v) のピーナッツバター溶液を作製します。忌避試験では、98% のメチル酪酸溶液を用意します。感受性試験では、試験の1～2日前に同系統のマウスから雌尿を回収します。

雌の個体をケージのグリッドの上に腹部が来るように固定し、プラスチック製のディッシュに尿を滴下させて回収します。標準化のため、複数の雌からサンプルを回収してください。個体差がある場合は、すべてのサンプルを1.5 milliliterチューブにまとめ、minus 20 degrees Celsiusで保存してください。

まず動物を慣らすため、洗浄済みのケージに1匹入れて探索させます。5分間、テストケージの環境をホームケージと同様の状態にしてください。この慣らし時間を各テスト日に1回繰り返し、慣らし時間が終了したら記録を開始し、心地よい香りの液を60 µLピペットで滴下します。

このケースでは、一方の壁にピーナッツバターを塗り、反対側の壁に同量の水をピペットで滴下します。中性の香りを、各壁の高さ約10センチメートルの位置に滴下してください。その後、動物に2分間探索させ、録画を停止してマウスをホームケージに戻します。

テスト対象のマウスごとにこのプロセスを繰り返します。その際、常に新しいテストケージを使用してください。すべての好みのテストを実施してから3〜5日後に、新しいテストケージを用いて回避テストを行います。

各マウスについて、回避試験を行います。誘引試験と同様に、快い香り（pleasant scent）を回避香である2-メチル酪酸に置き換えるのみです。感受性試験では、同一マウスの試行間において、1つのケージを再利用することが可能です。

ケージの水側を印付けし、試行の間に短辺の壁を70%ethanolを浸したペーパーで清掃できるよう準備します。実験当日、10倍希釈系列を用いて、尿を4つの濃度で調製します。回避試験と同様に、二回蒸留水を用いて、各動物を5分間テストケージに慣らします。

次に、まず最も高い希釈倍率である10,000倍に希釈した尿に各マウスをさらします。録画しながら、テストケージに希釈尿を塗布し、反対側の壁面には水を塗布します。他のテストと同様に、動物に探索させます。

2分間維持します。その後、動物を清潔なマウスケージに移します。すべての動物に最低濃度での処置が行われた後、すべてのテストケージの壁面を清掃し、次の高濃度尿を用いて各マウスでテストを繰り返します。

純粋な尿の検査が完了するまで、この工程を繰り返します。1つの実験におけるすべてのデータを収集した後、ImageJで動画を開き、記載されたプロトコルに従って、テキストプロトコルに記載されている調整および処理の詳細を実行します。2種類の異なるノックアウト株を使用します。

グループBおよびCを、リターメイドの対照群であるグループAと比較した。ジェノタイプ内における臭気と水の間に費やされた時間の比較には、等分散または不等分散を想定した非方向性Studentのt検定を用いた。ジェノタイプ間の行動比較には、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いた。実験群であるBおよびCの両群において、誘引性臭気への嗜好性は認められなかった。忌避試験では、忌避的な2-メチル酪酸の臭気に対する反応はグループAおよびBでは予想通りであったが、グループCではこの臭気に対する忌避行動を示さなかった。

感度テストにおいて、誘引閾値は、1:1000に希釈して好まれた尿と水のそれぞれに費やした時間の差（水に費やした時間から尿に費やした時間を差し引いた値）によって算出されました。一方、実験群BおよびCの両方において、嗜好性を示すには100倍高い濃度が必要でした。この手法を習得すれば、適切に実施することで数時間で完了させることができます。本手順に続き、嗅覚学習や消去などの他の手法を行うことで、嗅覚の可塑性と学習を調査することが可能です。