嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色
June 5th, 2017
嗅覚ニューロンは、種々の軸索選別分子を発現して適切な神経回路を確立する。このプロトコルは、嗅覚ニューロンの軸索末端における軸索ソーティング分子のコンビナトリアル発現を視覚化する免疫組織化学的染色方法を記載している。
この免疫組織化学染色法の全体的な目標は、嗅覚ニューロンの軸索末端における軸索選別分子の複合発現を視覚化することです。この方法は、軸索誘導、シナプス形成、嗅覚ニューロンの再生など、嗅覚発達の分野における主要なプロセスを特徴付けるのに役立ちます。この技術の主な利点は、科学者が切片間のばらつきを維持せずに、嗅球内の軸索選別分子の発現パターンを比較および分析できることです。
型内の嗅覚組織サンプルの位置と角度を言葉で説明するのが難しいため、埋め込みステップを学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。4%パラホルムアルデヒドの心臓内灌流によって固定された1〜2週齢のマウスの頭部から始めます。上下の歯の隙間にハサミの刃を差し込み、水平に切って下顎の骨を取り除きます。
次に、鉗子とはさみで余分な組織を切り取り、嗅球や嗅上皮などの嗅組織を残します。嗅組織をPBSに浸して鼻腔内の空気を取り除き、次に垂直に切り込みを入れて脳の後部を取り除き、嗅組織を埋め込み型の下部に切り込み端を下にして置きます。最適な切削温度のコンパウンドを金型に充填し、液体窒素に浸します。
組織とOCTが完全に凍結した後、クライオスタット内の組織を摂氏20度で1時間平衡化します。次に、クライオスタットで嗅球の連続傍嚢切片を作成し、MASコーティングされたスライドガラスに貼り付けてそれらを収集します。貼り付けた後、スライドをすぐにブロードライヤーで乾かします。
免疫染色を開始するには、乾燥させたスライドをPBSで室温で5分間洗浄します。スライドを室温で5%ブロッキング溶液と1時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックします。次に、1%ブロッキング溶液で希釈した一次抗体のカクテル400マイクロリットルを各スライドに加えます。
スライドを室温で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を廃棄し、スライドをPBSTで室温で5分間ずつ3回洗浄します。次に、各スライドに400マイクロリットルの二次抗体とPBSのカクテルを追加します。
光から保護し、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を廃棄し、スライドを室温でPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。最後に、各スライドに2滴の封入剤を塗布し、カバースリップを配置し、気泡を取り除き、スライドにカバースリップを取り付けます。
蛍光顕微鏡で、各蛍光色素に適したフィルターを使用して蛍光画像を取得します。露光時間を調整して、飽和せずに画像の蛍光信号を取得します。GLUT2の免疫蛍光シグナルにより糸球体構造を定義します。
画像Jを使用して、糸球体内の軸索選別分子の染色強度を測定します。この画像は、VGLUT2、Kirrel2を赤、Semaphorin 7Aを緑、OLPCを青の抗体で免疫染色した2週齢マウスの傍甲状腺嗅球切片を示しています。マージされた画像は、糸球体分離に関与する軸索選別分子が位置に依存しないモザイクパターンで表されることを示しています。
各糸球体は、シナプス前マーカーVGLUT2の蛍光シグナルによって定義されます。糸球体の構造は破線で囲まれています。軸索選別分子のシグナル強度を各糸球体で測定した。
ここに見られるように、軸索選別分子は各糸球体で異なる発現をしています。例えば、糸球体3はOLPCを高く、セマフォリン7Aは中程度、Kirrel2は低く、この差は染色強度を測定することで定量化できます。一方、糸球体4はOLPCのレベルが高く、Kirrel2とSemaphorin 7Aのレベルは低くなっています。
繰り返しになりますが、この差は染色強度を測定することで定量化できます。この手順を試みる際には、PFAによる後固定と、通常は推奨されるショ糖溶液による治療を省略することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、単一嗅球切片により多くの糸球体を配置する方法や、他の脳領域に適用できる複数の抗体による高品質な免疫染色を行う方法について、よく理解できるはずです。
この方法が将来の実験で成功するのに役立つことを願うことを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、嗅覚感覚ニューロンの軸索端における軸索選別分子の発現を視覚化するための免疫組織化学的染色法を概説しています。この技術は、軸索誘導やシナプス形成などの嗅覚発達プロセスを理解する上で重要です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 嗅覚発達
- 免疫組織化学
背景
- 嗅覚感覚ニューロンは嗅覚において重要な役割を果たします。
- 軸索選別分子は適切な神経回路を確立するために不可欠です。
- これらの発現パターンを理解することで、嗅覚系の機能に関する洞察が得られます。
- これらの発現を視覚化することで、嗅覚感覚ニューロンの再生プロセスの研究に役立ちます。
研究の目的
- 軸索選別分子の複合発現を視覚化する。
- 嗅覚発達における主要プロセスを特徴づける。
- 嗅球における発現パターンの比較を容易にする。
使用方法
- 免疫組織化学的染色技術。
- 1〜2週齢のマウスの頭部を使用。
- 固定のために4%パラホルムアルデヒドによる心臓内注入。
- 嗅覚組織サンプルの埋め込みと切片化。
主な結果
- 軸索選別分子の発現の成功的な視覚化。
- 切片間の変動なしに発現パターンを分析する能力の実証。
- 嗅覚組織の埋め込みの明確な方法の提供。
- 技術の学習における視覚的実演の重要性の強調。
結論
- 免疫組織化学的方法は嗅覚感覚ニューロンを研究するのに効果的です。
- 軸索選別分子を理解することで、嗅覚系の発達に関する知識を深めることができます。
- この技術は嗅覚再生に関する将来の研究に貴重なツールとなり得ます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
