Name: 嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶ嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための四重免疫染色法。マウスを用いて軸索整列分子の発現パターンを解析し、嗅球の発生過程における軸索誘導とシナプス形成を研究する。

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本研究は、三菱財団、武田学術振興財団、JST PRESTO、学術振興会グラント番号16H06144の支援を受けました。

すべての実験手順は、東京大学の動物実験倫理委員会の承認を得て、実験動物のケアと使用に関する東京大学のガイドラインに従って行われた。 1.ソリューションの準備<ol><li> 0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の調製：PBS錠剤（0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.010M PO 4 3- 、pH7.4）を蒸留水1Lに加え、完全に溶解するまで室温で撹拌する。 </li><li> PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製する：4mLのPFAを100mLのPBSに加える。溶液が完全に溶解するまで60℃で撹拌する。 <ol><li> PBS中にPFAを溶解した後、1N水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて溶液のpHを7.4に調整する。次に、氷上で冷却し、濾紙を通して溶液をろ過して粒子状物質を除去する。 4℃で保存する。 注意：これらの試薬を使用する場合は、適切な注意を払ってください。ハンドル手袋、安全ゴーグル、および化学フードの下のラボコートを注意して使用してください。 注：2 d以内に調製した新鮮な4％PFA溶液を使用する。 </li></ol></li><li> 0.3％Triton X-100（PBST）を添加した0.01M PBSを調製する：3mLのTriton X-100を997mLのPBSに加える。溶液が完全に溶解するまで室温で撹拌する。 </li><li> 1％および5％ブロッキング溶液を調製する：スキムミルク10gをPBST200mLに加えて5％ブロッキング溶液を調製する。十分に溶解するまでRTで撹拌する。 5％ブロッキング溶液をPBSTで5倍に希釈して1％ブロッキング溶液を調製する。 </li></ol> 2.パラサギュアルOBセクションの準備<ol><li> 1〜2週齢の動物を使用する。これらの年齢群は、糸球体がはっきりと見え、頭蓋骨で脳を切断できるので、以下の実験に適している。 </li><li>ペントバルビタール（50mg / kg体重）の腹腔内注射で動物を麻酔する。氷冷した4％Pで経心的に動物を灌流するPBS中のFA。慎重に取り扱い、手袋、安全ゴーグル、および化学フードの下の実験室コートを使用する。 </li><li>灌流後、はさみで頭を切って慎重に皮膚を除去する。次に、はさみの刃を上歯と下歯の間の空間に挿入し、水平に切断して下顎骨を除去する。 OBやOEを含む嗅覚組織を残すために、過剰な組織を鉗子やハサミで切り取ってください。 注：OBを囲む頭蓋骨を取り除かないでください。これは、垂直に真っ直ぐに整列した内側の糸球体を保持するためです。 </li><li> 嗅覚組織をPBSに浸して鼻腔の空気を除去する。脳の後部を垂直に切断し、カッティングフェイスを下にして包埋モールドの底に嗅覚組織を置きます。金型をOptimal Cutting Temperature（OCT）コンパウンドで満たし、液体窒素に金型を浸します。 <ol><li>化合物中の組織が完全に凍結した後、それをクライオス-20℃で1時間反応させる。 </li></ol></li><li> OBのシリアルparasagittalセクション（10μmの）をクライオスタットで作り、MASでコーティングされたスライドガラスにくっつけてそれらを集める。貼り付けた後、ブロードライヤーでスライドを直ちに乾燥させます。 </li></ol> 3. 1日目：OBスライスの4回免疫免疫染色<ol><li> RTでPBSで5分間スライドを洗浄する。 3回繰り返します。 </li><li>スライドを室温で5％ブロッキング溶液と1時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックする。 </li><li>室温で1％ブロッキング溶液中の一次抗体カクテル（各スライド400μL）とスライドO / Nをインキュベートする。モルモット抗Kirrel2抗体（1：1000）、ヤギ抗セマフォリン7A（Sema7A）抗体（1：500）、ラット抗OL-プロトカドヘリン（OLPC）抗体（1：500）、およびマウス抗小胞グルタミン酸トランスポーター2（VGLUT2）抗体（1：500）。 </li></ol> 4. 2日目：OBの4回免疫染色スライス<ol><li>一次抗体溶液を捨て、RTでPBSTで5分間スライドを洗浄する。 3回繰り返します。 </li><li> RTでPBS中の二次抗体（各スライド400μL）のカクテルで1時間スライドをインキュベートする。ロバ抗マウスAlexa Fluor 405（1：400）、ロバ抗ヤギAlexa Fluor 488（1：400）、ロバ抗モルモットAlexa Fluor 555（1：400）ラットAlexa Fluor 647（1：400）。 注：すべての二次抗体は、同じ宿主種に由来するはずです。各一次抗体の二次抗体の異なる蛍光波長を選択して、波長が重ならないようにします。 </li><li>溶液を捨て、RTでPBSで5分間スライドを洗浄する。 3回繰り返します。 </li><li>スライド上のカバースリップをマウント媒体でマウントする。このためには、各スライドに2滴のマウントメディアを塗布し、次に気泡を除去してカバースリップを入れます。 </li></ol> 5.強度Me保証<ol><li>蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を得る。 Alexa Fluor 405シグナル、GFPフィルターキューブ（470/40 nm励起、525/50 nm発光、400 nm励起、460/50 nm発光、400 nmダイクロイックミラー）のDAPIフィルターキューブ（360/40 nm励起、460/50 nm発光、400 nmダイクロイックミラー） Alexa Fluor 558、TRITCフィルターキューブ（545/25 nm励起、605/70 nm発光、565 nmダイクロイックミラー）、Cy5フィルターキューブ（620/60 nm励起、700 / 75nm発光、および600nmダイクロイックミラー）をAlexa Fluor 647用に使用した。 注：彩度のない画像の蛍光シグナルを得るために、露光時間を調整してください。 </li><li> VGLUT2の免疫蛍光シグナルによって糸球体構造を決定する。 ImageJを用いて糸球体内の軸索選別分子の染色強度を測定する。 </li></ol>データ解析<ol><li>軸索選別分子の染色強度からバックグラウンドシグナルを差し引く。 </li><li>準備するe発現データマトリックスであり、軸索ソーティング分子および糸球体からなる列からなるカラムを有する。 </li><li>準備された発現データセットを用いて主成分分析（PCA）を行う。次に、各主成分のPCAスコア、寄与率、および因子負荷を得る。 </li></ol>

<ol><li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?</a> Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li>
<li>Takeuchi, H., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+map+formation+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural map formation in the mouse olfactory system.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+an+olfactory+sensory+map%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing an olfactory sensory map.</a> Cell. 87, 675-686 (1996).</li>
<li>Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contextual+model+for+axonal+sorting+into+glomeruli+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system.</a> Cell. 117, 817-831 (2004).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoallelic+expression+of+the+odourant+receptor+gene+and+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cell%22%5BJournal%5D)">Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones.</a> Genes Cell. 6, 71-78 (2001).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-independent+GPCR+activity+regulates+anterior-posterior+targeting+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons.</a> Cell. 154, 1314-1325 (2013).</li>
<li>Serizawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+identity+code+for+the+odorant+receptor-specific+and+activity-dependent+axon+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting.</a> Cell. 127, 1057-1069 (2006).</li>
<li>Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIG-2+mediates+olfactory+axon+convergence+to+target+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli.</a> Neuron. 57, 834-846 (2008).</li>
<li>Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+axon-sorting+molecules+in+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons.</a> Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).</li>
<li>Williams, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta+Protocadherin+10+is+Regulated+by+Activity+in+the+Mouse+Main+Olfactory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System.</a> Front Neural Circuits. 5, 9(2011).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

parasagittal OB切片の4回免疫染色により、より多くの糸球体において4つの軸索選別分子の発現レベルの視覚化および定量化が可能になった。これらの多変量データをPCAで分析することにより、これらの分子の発現の特徴を推測することができる。 染色を成功させるためには、組織試料の調製が非常に重要である。いくつかのプロトコルは、組織が4％PFAで後固定され、凍結保護のために30％スクロースで処理されるべきであることを示唆している。しかしながら、これらの工程はこのプロトコールでは省略された。これは、多くの場合、これらの工程が染色信号強度を低下させ、バックグラウンドを増加させるためである。さらに、染色中の高いバックグラウンドを避けるために、切片を任意の段階で乾燥させてはならない。 最適な染色条件は、使用する組織や抗体の種類によって異なります。したがって、それは必須です各実験の特異的染色条件を決定する。さらに、一次抗体の濃度もまた重要である。濃度が高すぎると、背景が増えます。しかし、濃度が低すぎると、信号が減少します。したがって、...

開発中、ニューロンは、正常な脳機能にとって重要な、適切な神経回路を形成するために相互に正確に接続される。脳の異常な神経回路は自閉症や統合失調症などの精神障害の原因であると考えられているため、神経回路形成のメカニズムを理解することは神経科学の分野における大きな課題の1つです。 マウス嗅覚系では、嗅覚上皮（OE）の各嗅覚ニューロン（OSN）は機能的な嗅覚受容器（OR）遺伝子を1つしか発現せず、同じORを発現するOSNは軸索を特定の糸球体対に収束させる。嗅球（OB） 1,2 。マウスの嗅覚系は、神経回路形成の分子メカニズムを研究するための優れたモデル系であり、研究者はOR発現を利用して特定のsOSNsのサブタイプを同定し、OSN軸索の投影部位を明確な糸球体構造として視覚化する。 OSN投影の顕著な特徴は、OSN軸索をOB 3、4、5、6に投影する際にORが有益な役割を果たすことである。より具体的には、OSN軸索が標的領域に近づくように誘導された後、それらは偏向されてOR依存的に糸球体を形成する。以前の研究では、OR分子が糸球体分離を調節する軸索選別分子の発現を制御することが示されている7,8 。さらに、蓄積している証拠は、OR分子が軸索選別分子のユニークな組み合わせによってニューロンの識別コードを生成することを示唆している9 。したがって、OR依存性糸球体分離のメカニズムを理解するためには、軸索選別モルの発現プロファイルを特徴付けることが必要であるOSNのecules。 蛍光免疫染色は、特定の遺伝子の発現を視覚化するための一般的な方法である。軸索選別分子のタンパク質は主にOSN軸索に局在するため、研究者はOSNの発現パターンを特徴づけるためにOB切片を使用する必要がある。 OBの冠状切片は免疫染色のために日常的に使用されている。しかし、この準備は、同じOBセクション内の前後軸に沿った地形情報を失う。したがって、我々はOBの内側の傍脊柱側枝の準備を開発しました。これは同じOBセクションにできるだけ多くの周囲の糸球体をマウントすることができます。複数の抗体を用いた免疫染色と組み合わせることにより、OB切片間の染色変異を伴わずに、軸索選別分子の発現パターンの比較および分析が可能になる。 さらに、免疫組織化学的染色方法が、PFAαスクロース処理。この方法により、研究者は多変量解析に十分な高品質の染色データを得ることができます。ここに提示されたプロトコルは、嗅覚神経回路形成を研究する研究者のための強力な方法の詳細を提供する。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤、pH7.4</td><td>TAKARA BIO</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク</td><td>ナカライテスク</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗Sema7A抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF2068</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗 OLPC 抗体</td><td>メルク ミリポア</td><td>MABT20</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 VGLUT2 抗体</td><td>メルク ミリポア</td><td>MAB5504</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗 BIG-2 抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF2205</td><td></td></tr><tr><td>gunea pig anti-Kirrel2 antibody</td><td>Operon Biotechnologies</td><td></td><td>Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP</td></tr><tr><td>ロバ anti-mouse Alexa Fluor 405</td><td>Abcam</td><td>ab175658</td><td></td></tr><tr><td>ロバ anti-goat Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-545-003</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗モルモット Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ネズミ Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>和光</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>MASコーティングスライドグラス</td><td>MASTSUNAMI</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11253-27</td><td></td></tr><tr><td>バンナス スプリングシザース</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>キーエンス</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>DAPIフィルターキューブ</td><td>キーエンス</td><td>OP-87762</td><td></td></tr><tr><td>GFPフィルターキューブ</td><td>キーエンス</td><td>OP-87763</td><td></td></tr><tr><td>TRITCフィルターキューブ</td><td>キーエンス</td><td>OP-87764</td><td></td></tr><tr><td>Cy5フィルターキューブ</td><td>キーエンス</td><td>OP-87766</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>アドバンテック</td><td>00011185</td><td></td></tr><tr><td>O.C.Tコンパウンド</td><td>さくらファインテック</td><td>M71484</td><td></td></tr></tbody></table>

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

マウスの嗅覚系は、単純な解剖学的構造のために神経回路形成のメカニズムを研究するためにしばしば用いられる。嗅覚ニューロン（OSN）は、単一の樹状突起および単一の分枝していない軸索を有する双極細胞である。 OSNは1つの嗅覚受容器（OR）遺伝子しか発現しないが、特定のタイプのORを発現するOSNは、嗅球（OB）の不変糸球体のいくつかのセットに軸索を収束させる。 OSN予測の顕著な特徴は、表現されたORが軸索投影において有益な役割を果たすことである。 ORは、複数の軸索選別分子の発現を調節し、OSN軸索末端に軸索選別分子のコンビナトリアル分子コードを生成する。したがって、OR特異的軸索誘導機構の分子機構を理解するためには、同じ糸球体内のOSN軸索末端での発現プロファイルを特徴付けることが重要である。この記事の目的は、可能な限り多くの糸球体を採取するための方法を紹介することでしたeを1つのOBセクションに、複数の抗体を用いて免疫染色を行うために使用します。これは、OB切片間の染色変異を伴わずに、軸索選別分子の発現パターンの比較および分析を可能にする。

嗅糸球体マップは、OSN軸索1,2の初期の全身ターゲッティングおよびその後の糸球体分離によって形成される。糸球体分離は、発現レベルが発現したOR分子によって決定される軸索選別分子によって媒介される接着性/斥力性軸索相互作用によって調節される7 。糸球体分離に関与する軸索選別分子は、OB 9において位置非依存モザイク様式で発現される。この研究では、 Kirrel2 、 Sema7A 、 OLPC 、 BIG-2、およびPCDH17遺伝子を選択した。これらの軸索選別分子のいくつかは、活性依存的に7,8,10で発現される。 四倍免疫ここに示されている方法は、同じセクション上で同時に4つの分子の発現パターンの可視化を可能にした。これらの軸索選別分子...

嗅覚ニューロンは、種々の軸索選別分子を発現して適切な神経回路を確立する。このプロトコルは、嗅覚ニューロンの軸索末端における軸索ソーティング分子のコンビナトリアル発現を視覚化する免疫組織化学的染色方法を記載している。

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

この免疫組織化学染色の全般的な目的は、嗅覚感覚ニューロンの軸索末端における軸索ソート分子の複合的な発現を可視化することです。本手法は、軸索誘導、シナプス形成、嗅覚感覚ニューロンの再生など、嗅覚発生分野における重要なプロセスの特性解析に寄与します。この技術の主な利点は、切片間のばらつきを抑えながら、嗅球における軸索ソート分子の発現パターンを比較・分析できる点にあります。埋包ステップは、モールド内における嗅覚組織サンプルの位置と角度を言葉で説明することが困難であるため、習得が難しく、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。まず、4%パラホルムアルデヒドの心腔内灌流によって固定した、生後1〜2週齢のマウスの頭部を用意します。上顎と下顎の歯の隙間にハサミの刃を挿入し、水平に切断して下顎骨を取り除きます。次に、ピンセットとハサミを用いて余分な組織を切り取り、嗅球と嗅上皮を含む嗅覚組織を残します。嗅覚組織をPBSに浸して鼻腔内の空気を除去した後、垂直に切断して脳の後部を取り除き、切断端を下にして埋め込みモールドの底に嗅覚組織を配置します。モールドにOCTコンパウンドを充填し、液体窒素に浸漬します。組織とOCTが完全に凍結した後、クライオスタット内で組織を20 °Cで1時間静置し、温度を順応させます。次に、クライオスタットを用いて嗅球のパラサジタール連続切片を作成し、MASコートガラススライドに貼り付けて回収します。貼り付け後、すぐにドライヤーでスライドを乾燥させます。乾燥させたスライドを室温で5分間PBSで洗浄し、免疫染色を開始します。室温で5%ブロッキング溶液を用いてスライドを1時間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックします。その後、1%ブロッキング溶液で希釈した一次抗体カクテル400 µLを各スライドに加えます。スライドを室温で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を除去し、室温でPBSTを用いて5分間ずつ3回スライドを洗浄します。その後、二次抗体とPBSのカクテル400 µLを各スライドに添加します。遮光して室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を廃棄し、室温のPBSでスライドを再び5分間ずつ3回洗浄します。最後に、各スライドに封入剤を2滴滴下し、カバーガラスを載せて気泡を除去し、封入します。各蛍光色素に適したフィルターを用いて、蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します。画像が飽和しないように露光時間を調整し、蛍光信号を得てください。GLUT2の免疫蛍光信号によって、糸球体構造を定義します。Image Jを使用して、糸球体内の軸索選別分子の染色強度を測定します。この画像は、VGLUT2、Kirrel2（赤色）、Semaphorin 7A（緑色）、およびOLPC（青色）に対する抗体で免疫染色した、2週齢マウスの嗅球の正中矢状断切片を示しています。マージ画像は、糸球体分離に関与する軸索選別分子が、位置に依存しないモザイクパターンで発現していることを示しています。各糸球体は、シナプス前マーカーであるVGLUT2の蛍光シグナルによって定義されます。糸球体構造は破線で囲まれています。各糸球体において、軸索ソート分子のシグナル強度が測定されました。ここに見られるように、軸索分級分子は各糸球体で特異的に発現しています。例えば、糸球体3ではOLPCが高レベルで、Semaphorin 7Aが中レベル、Kirrel2が低レベルであり、この差は染色強度の測定によって定量化できます。一方、糸球体4ではOLPCが高レベルであり、Kirrel2とSemaphorin 7Aは低レベルです。繰り返しになりますが、この違いは染色の強度を測定することで定量化できます。この手順を試みる際は、通常推奨されているPFAによる後固定およびショ糖溶液による処理を省略することが重要であるという点に留意してください。このビデオを視聴することで、単一の嗅球切片により多くの糸球体を配置する方法、および他の脳領域にも適用可能な複数の抗体を用いた高品質な免疫染色の方法について、十分に理解できたはずです。希望を捨てないでください。この手法が、あなたの今後の実験の成功に役立つことを願っています。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、単一の嗅覚ニューロンの軸索とその終末分枝の遺伝子操作と可視化のためのレンチウイルス技術を提示...

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

この記事では、マウスの嗅球の表面にマップ臭気誘発活動に固有の光信号とflavoproteins自家蛍光信号のイメージングのプロトコルを示す。...

光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動

ここでは、ショウジョウバエのアンテナの全マウント免疫染色のプロセスについて説明し、これにより、嗅覚受容体ニューロン(ORN)の多様化に関与する分子メカニズムをよりよく理解することができます。...

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

私たちは、ニューロンの形態とその経時的な発達を視覚化するためのエレクトロポレーションとその後の共焦点レーザースキャンまたは多光子顕微鏡による嗅覚ニューロンのin...

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究するインビボ

嗅覚ニューロンの繊毛はシグナル伝達カスケードのタンパク質を含んでいますが、その分布の詳細な空間分析は凍結切片では困難です。ここでは、毛様体タンパク質のホールマウントラベリングとエンフェイスビジュアリゼーションのための最適化されたアプローチについて説明します。...

マウスの主嗅覚系における繊毛のホールマウントのラベリング

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。...

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。...

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ -...

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

学ぶ嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための四重免疫染色法。マウスを用いて軸索整列分子の発現パターンを解析し、嗅球の発生過程における軸索誘導とシナプス形成を研究する。

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

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