Name: 10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学ぶ、10ナノグラムのトータルRNAからIllumina mRNA-seqライブラリを調製する方法。T7線形増幅を用いた遺伝子発現プロファイリングにより、微量サンプルからの高感度解析が可能となる。

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この作業は研究とウィスコンシン財団の大学Morgridge研究所からの資金によって支えられている。我々は編集支援のためクリスタイーストマンに感謝。

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
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<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
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<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

著者らは、JATが携帯電話ダイナミクス国際（CDI）の創設者、stockowner、コンサルタントおよびボードメンバーであることを開示している。彼はまたの科学顧問としての役割を果たし、タクティクスII幹細胞のベンチャーズの経済的利益を持っています。

ペアエンドライブラリを作るための現在のプロトコルは、1μgの9〜2.5μgのトータルRNAの10開始量の間に必要とする。ここでは、このメソッドは許可されている両方の単一の読み取りとペアエンドイルミナシーケンシングライブラリとショーを準備する私たちのリニアT7増幅系（T7LA）メソッドを提示するのに匹敵するデータを生成するトータルRNAのような低10 ngのからのライブラリの生成1000倍以上の出発原料（10μgのトータルRNA）から作られた最小限の増幅（MinAmp）ライブラリ。 10 ngのライブラリーは、遺伝子の類似の総数を特定するものではなく、また（図3aとb）類似している遺伝子発現の署名を生成しません。また、T7LA法により製造された単一の読み取りとペアエンドライブラリの両方は、研究者がどちらのプロトコルで作られたライブラリによって生成されたデータを比較できるようになる、（図3c）は互いに非常によく似ています。これらのライブラリは、ヒト胚性幹細胞のRNAから調製されて以来、我々が検索ライブラリのうち、30幹細胞特異的遺伝子のため、ほぼこれらの遺伝子のすべて（93から100パーセント）はこのように我々のプロトコルを検証する、トータルRNAを（図4）出発の少なくとも10 ngのから作られたライブラリによって識別されていることがわかります。我々は、我々のプロトコルは、特にそのようなフローソートされた細胞または出発物質が制限され、レーザーマイクロ解剖組織としての状況では、研究者にとって非常に有用ではないかと思います。このような状況では、我々のプロトコルは、我々のプロトコルが開始RNAの大きさの少なくとも3桁でほぼ同等の発現プロファイルを生成するので、はるかに大きいの開始量から作られたライブラリに匹敵する遺伝子発現データの生成をできるようになります。

<table border="1"><tbody><tr><td>会社</td><td>キット/試薬</td><td>カタログ＃ </td><td>特別なコメント</td></tr><tr><td>アンビオン</td><td>断片化試薬</td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオン</td><td>ライナーのアクリルアミド</td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオン</td><td> MEGAscript T7キット</td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオン</td><td>非DEPCは、ヌクレアーゼフリーの水を扱わ</td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTPのセット</td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td>メチル化のdNTP </td><td> R0431 </td><td>唯一のシングルリードのサンプル調製用</td></tr><tr><td>イルミナ</td><td> TruSeq SRクラスタ生成キットV5 </td><td> GD - 203 - 5001 </td><td>唯一のシングルリードのサンプル調製用</td></tr><tr><td>イルミナ</td><td> TruSeqのSeqキットV5 36サイクル</td><td> FC - 104 - 5001 </td><td></td></tr><tr><td>イルミナ</td><td>チップのSeqサンプル調製キット</td><td> IP - 102 - 1001 </td&gt; <td>シングルリードサンプル調製用のみ。 1 CAT＃E6040S設定NEB DNAサンプルプレップマスターミックスに置き換えることができます。 </td></tr><tr><td>イルミナ</td><td> TruSeq PEクラスタ生成キットV5 </td><td> PE - 203 - 5001 </td><td>ペアエンドサンプル調製用のみ</td></tr><tr><td>イルミナ</td><td>ペアエンドサンプル前処理キッ​​ト</td><td> PE - 102 - 1001 </td><td>ペアエンドサンプル調製用のみ</td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> 1キロバイトプラスはしご</td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>大腸菌のRNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> RNaseのアウト</td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>第二鎖バッファー5倍</td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>大腸菌のDNAポリメラーゼ</td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> E -ゲルSYBR安全な2パーセント</td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>上付きIII（5X FSバッファおよび0.1M DTT付き） </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>トリゾール</td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> RNA quibitアッセイキット</td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> dsDNAをHS量子ビットアッセイキット</td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>大腸菌DNAリガーゼ</td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> T4 DNAポリメラーゼ</td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>超高純度のDNase RNaseの水</td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>スーパースクリプトII二本鎖cDNA合成キット</td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>ランダムプライマー（Invitrogen社） </td><td> 48190-011 </td><td>ペアエンドサンプル調製用のみ</td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer Bのプライマー</td><td> N / </td><td>シングルリードSAM用PLE準備のみ</td></tr><tr><td> IDT </td><td>オリゴdT T7 </td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> NOT1消化キット</td><td> R0189S </td><td>唯一のシングルリードのサンプル調製用</td></tr><tr><td>キアゲン</td><td>をRNeasyアプライキット</td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td> RNeasyミニキット（50） </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td>ゲル精製キット</td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td> DNase処理セット</td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td>したRNeasyアプライキット</td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo研究</td><td> DNAクリーンとコンセントレータ（250X） </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

10ナノグラムのトータルrnaからシングルリードとペアエンドのmrna - seqのイルミナライブラリ

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

mRNAのseqで全トランスクリプトームの配列決定は、現在、グローバルな遺伝子発現、突然変異、対立遺伝子特異的発現および他のゲノムワイドな解析を実行するために広く使用されている。 mRNAのSeqはさらに、非塩基配列ゲノムの遺伝子発現解析のためのゲートを開きます。 mRNAのSeqは高感度、広いダイナミックレンジを提供し、サンプル中の転写産物のコピー数を測定することができます。イルミナ社のGenome Analyzerは、単一の長いリードを特徴とする&quot;ペアエンド&quot;のアプローチは、両方の両端に配列決定されている。大比較的短いシーケンスの数（&gt; 10 7）（&lt;150 bp）の読み取りの配列決定を行い、選択的スプライシングのジャンクションを追跡することができます、挿 ​​入や削除、およびde novoのトランスクリプトームアセンブリするのに便利です。 研究者が直面する大きな課題の一つは、出発原料の限られた量です。トータルRNA mを開始例えば、細胞がレーザーマイクロダイセクションで採取される実験では、利用可能なナノグラムの措置をAYがつきます。このようなサンプルからのmRNA - seqのライブラリーの調製は、1、2を説明するが、バイアスを導入することが重要なPCR増幅を伴うしている。最小限のPCR増幅を持つ他のRNA - seqのライブラリー構築の手順は3、4を発表したが、全体のRNAを開始するのマイクログラムの量を必要とされている。 ここでは重要なPCR増幅を回避し、トータルRNAのわずか10ナノグラムを必要とするライブラリの準備のためのmRNA - seqのシーケンスのためのイルミナGenome AnalyzerのIIのプラットフォーム用のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、それが重要な増幅バイアスを導入せず、方向ライブラリーを作製することが示されたシングルエンドシーケンシング5、の説明で述べたと検証してきたが、ここでは、ペアエンドのプロトコルとして使用するためにさらにそれを検証する。我々は選択的に&quot;T7造語、T7ベースのEberwineリニア増幅法を用いてトータルRNAを起動ポリアデニルメッセンジャーRNAを増幅LA&quot;（T7リニア増幅）。mRNAの断片化されて増幅されたポリ、最終的なシーケンスのライブラリを生成するライゲーション転写し、アダプタを逆にする。双方単一の読み取りとペアエンドの実行では、配列がヒトのトランスクリプトーム6にマップされているとなるように正規化複数の実行からのデータを比較することができます。我々は試料7を比較するときRPKMに優れた尺度である百万ごとの転写産物の単位で遺伝子発現の測定（TPM）を、報告する。

ここでは、T7リニアRNA増幅に基づく遺伝子発現解析用のライブラリーのシークエンシングの両方シングルリードとペアエンドイルミナのmRNA - seqの製造方法を説明します。このプロトコルは、トータルRNAを始めるのは10ナノグラムを必要とし、全体の転写産物を表す非常に一貫性のあるライブラリを生成します。

10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ

mRNA-Seqによる全トランスクリプトーム解析は、現在、全般的な遺伝子発現、変異、アレル特異的発現などの解析に広く用いられており...

この手順の全体的な目的は、少量の出発材料からIllumina mRNAシーケンスライブラリを構築することです。まず、DTTおよび7種類のプライマーを用いて全RNAを逆転写し、cDNAを合成します。このcDNAを用いて、in vitro転写によるRNA増幅を行います。その後、増幅されたRNAをランダムに断片化します。断片化したRNAを逆転写してcDNAを合成し、アダプターライゲーション、サイズ選択、およびPCR増幅を行います。最終的に、このプロトコルでは遺伝子コピー数を測定することにより、サンプルの遺伝子発現プロファイルを明らかにします。この手法の主な利点は、開始材料としてわずか10 nanogramsの全RNAで十分である点にあります。これは、他の既存のプロトコルで必要とされる量よりも桁違いに少ない量です。さらに、このような少量の開始RNA量から、ペアエンドライブラリを構築することが可能です。本手法により、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションやフローサイトメトリーによって得られた細胞集団など、採取が困難な細胞群からの遺伝子発現プロファイルの決定が可能となり、科学者が生物学における新たな課題を探索できるようになります。ヒト羊膜幹細胞から分化させた極めて少数の細胞から遺伝子発現をプロファイリングする必要が生じた際、私たちはこの手法の開発を考案しました。RNAの量が極めて少なく分解されやすいため、RNAの取り扱いステップを習得するのは困難であり、本手法を視覚的に提示することが不可欠です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のAngela Elwell、Jennifer Bolen、およびBaal Kimm Wynnが行います。シングルリードおよびペアエンドの両方のシーケンシングライブラリを並行して調製する方法は、このフローチャートに示すような多段階の手順になります。まず、目的の細胞または組織から全RNAを単離し、二本鎖 cDNA を調製します。次に、T7ベースのcDNA線形増幅法を用いて、cDNAからポリA付加メッセンジャーRNAを選択的に増幅させます。続いて、増幅したpoly Aをランダムに断片化します。断片化したRNAを精製した後、cDNAに逆転写します。cDNAの末端修復を行い、DNA断片の3'末端にA塩基を付加します。その後、DNAにアダプターをライゲートし、NotI消化を行います。シングルリードライブラリーの場合、その後、ゲル精製によってDNAライブラリーを単離し、PCRで増幅してIlluminaアダプターをライゲートします。最後に、DNAライブラリーの定量後、シーケンス準備が整います。本ビデオでは、このプロトコルの中から選択した手順のみを実演します。断片化されたpolyA mRNAからcDNAへの逆転写には、第1鎖および第2鎖の合成が含まれます。シングルリードライブラリの第一鎖合成のため、PCRチューブに以下の試薬を加えます。断片化されたpoly mRNA 10 µLと、Not1ランダムノナマープライマー1 µLです。Not1ノナマープライマーの配列をここに示します。緑色で示されている5'末端近傍の配列がNot1制限酵素部位です。青色で示された配列は、チップシーケンスキットに含まれるIlluminaアダプターB配列の相補鎖である。混合液をサーモサイクラーを用いて70 °Cで5分間インキュベートし、その後、速やかに氷上で冷却する。混合液を氷上に保持したまま、SuperScript IIIキットから以下の試薬を添加する：5×第一ストランドバッファー 4 µL、DTT 2 µL、およびdNTP混合液 1.5 µL。なお、dNTP混合液にはdCTPの代わりに5-methyl-dCTPを使用すること。チューブをサーモサイクラーに入れ、42 °Cで2分間保持した後、SuperScript III逆転写酵素を1 µL添加し、42 °Cで1時間インキュベートする。次に、para末端ライブラリの第1ストランド合成のための反応を準備します。PCRチューブに、10 µLの断片化poly NNAと1 µLのランダムヘキサマープライマーを加えてください。サーモサイクラーを用いて65 °Cで5分間インキュベートし、その後、速やかに氷上で冷却します。チューブを氷上に置いたまま、superscript three First strand kitから以下の試薬を加えます：5x first strand bufferを4 µL、DTTを2 µL、そしてDN NTPsを1.5 µL。サーモサイクラーを用いて45 °Cで1分間インキュベートします。その後、superscript three reverse transcriptaseを1 µL加え、45 °Cで1時間インキュベートします。両方の反応液で、2本鎖合成の準備が整いました。氷上にて、それぞれの混合液に、キット2（上付き文字2）から以下の試薬を加えます：nuclease-free waterを91 µL、5x second strand bufferを30 µL、dNTPsを3 µL、E. coli DNA Ligaseを1 µL、E. coli DNA polymeraseを4 µL、およびE. coli RNase Hを1 µL。各チューブを転倒混和し、軽く遠心分離した後、16 °Cで2時間インキュベートします。シングルリードライブラリ用のcDNA末端修復には、40 µLの精製cDNAに、以下の試薬を添加します。10 mM ATP含有T4 DNAリガーゼバッファー 5 µL、dNTPミックス 2 µL、T4 DNAポリメラーゼ 1 µL、Klenow酵素 1 µL、およびT4 PNK 1 µLです。ペアエンドライブラリの場合、30 µLの精製cDNAに、RNase-free water 45 µLを添加します。10 mM ATPを含むT4 DNAリガーゼバッファー10 µL、10 mM dNTPミックス4 µL、T4 DNAポリメラーゼ5 µL、Klenow酵素1 µL、およびT4 PNK 5 µLを添加します。末端修復後、両方のチューブをサーモサイクラーを用いて20 °Cで30分間インキュベートします。本プロトコルの次のステップは、シングルリードライブラリ用にDNA断片の3'末端にアデニン塩基を付加することです。DNAサンプル 34 µL、Klenowバッファー 5 µL、dATP 10 µL、Klenow exo 1 µLの反応混合液を調製します。ペアエンドライブラリの場合は、DNAサンプル 32 µL、Klenowバッファー 5 µLの反応混合液を調製します。10 µLのDATPと3 µLのclin out exoを加え、アダプターライゲーションの反応準備を行う前に、両方の反応混合物を37 °Cで30分間インキュベートします。アダプターを氷上で解凍し、シングルリードライブラリ用に1:20に希釈します。Illumina chip sequence sample prep kitを用いて、DNAサンプル10 µL、アダプターオリゴミックス1 µL、2 XDNA Ligase buffer 15 µL、DNA Ligase 4 µLを含む反応混合物を調製し、15分間インキュベートします。ペアエンドライブラリについて、室温でIllumina paired end sample prep kitを用いて以下の反応液を調製します。10 µLのDNAサンプル、10 µLのPE adapter oligo mix、25 µLの2 X DNA ligase buffer、および5 µLのDNA Ligaseを混合し、20 °Cで15分間インキュベートします。それぞれのインキュベーション終了後、XMOカラムを用いて両方のライゲーション反応液を精製します。シングルリードライブラリを6 µLの elution buffer で溶出し、ペアエンドライブラリを44 µLの水で溶出した後、さらに5 µLの EB で溶出します。シングルリードライブラリのみ Not1 消化を行います。37 °C で2時間から一晩インキュベートし、ZY IMO カラムを用いて反応物を精製します。6 µLのバッファーEBを用いてシングルリードライブラリを溶出させ、続いて5 µLのEBで2回目の希釈を行います。これで、両方のライブラリのアダプターライゲーション済みDNAのサイズセレクション準備が整いました。アダプターライゲーション済みDNAのサイズセレクション手順には、Vitrogen社製の2% CyberSafe EEを使用します。この手順を開始するために、プログラム0のプリランを2分間実行してください。プリラン後、1 KB plus ladderおよび2D NAサンプルを10 µLずつロードします。空いたレーンには10 µLの水を注入し、One egel 2%のプログラムで28分間電気泳動を行います。ランが完了したら、新しいカミソリの刃を用いて、200から300ベースペアのゲルスライスを選択します。各種ライブラリによって同定された遺伝子数を評価し、この表にクラスター数に関する情報をまとめました。シングルリードおよびペアエンドの両ライブラリにおける、同定された遺伝子のエラー率とアライメント率を示します。10 nanogramのT7 LAライブラリは、TPMが10以上の10 microgramの非増幅ライブラリとほぼ同数の遺伝子を同定しました。シングルリードライブラリの場合、パラダイムライブラリにおいて、10 nanogramのT7 LAライブラリは、10 microgramの非増幅ライブラリによって同定された8,500個の遺伝子の100%を同定しました。また、10 nanogramのT7 LAライブラリは、非増幅ライブラリによって同定された遺伝子の86%を同定しました。10 nanograms未満で作成したライブラリでは、同定できる遺伝子数が少なくなりました。例えば、シングルリードプロトコルの場合、1 nanogramのT seven LAライブラリで同定された遺伝子は、10 microgramのmin ampライブラリで同定された遺伝子の約50%に留まりました。したがって、T seven LAプロトコルに使用する全RNAの最低量は、ハウスキーピング遺伝子のマッピングに基づき、10 nanogramsに制限されるべきです。GA DHの結果から、少なくとも10 nanogramsの開始RNAを用いて作製されたすべてのT seven LAライブラリにおいて、最端の5'エキソンを含むすべてのエキソンが同定されたことが示されています。シングルリードライブラリの左側にあるスケールバーは、総リード数350を示しています。DENライブラリの中央にあるスケールバーは、総リード数5, 000を示しています。10 nanogramのT seven LAシングルリードライブラリおよびペアエンドライブラリをmin ampライブラリと比較したところ、高度な類似性が認められました。10 nanogramのT seven LAシングルリードライブラリと10 microgramのmin ampライブラリとの間で0.90のスピアマン相関が得られ、PEREN 10 nanogram T seven LAライブラリと10 microgramのmin ampライブラリとの間では0.95の相関が得られました。さらに、10 nanogramsの全RNAから作製した2種類のシングルリードおよびPERENライブラリの比較を行ったところ、相関係数が非常に高く、T seven LAプロトコルを用いて作製された両方のタイプのライブラリが、非常に類似した遺伝子発現シグネチャーを生成することが示されました。最後に、これらのライブラリはヒト胚性幹細胞RNA 30個の幹細胞から調製されたため、ライブラリの中から特定の遺伝子を探索しました。これらの遺伝子のほぼすべてが、10 nanograms以上の開始全RNAから作成されたライブラリによって同定され、これにより本プロトコルの妥当性が検証されました。本プロトコルを実施する際は、分解を防ぐため、小型RNAサンプルを極めて慎重に扱うことが重要です。このビデオを視聴することで、ごく少量の出発物質からIllumina、Mr.Aeqシングルリード、およびParadigmライブラリを調製する方法について、深く理解することができます。

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

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