Name: ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶルシフェラーゼレポーター細胞株の作製法と細胞自律的概日時計リズムのモニタリング技術。レンチウイルスベクトルを用いた安定した遺伝子発現システムで、侵襲性のない生体発光測定により概日リズムを長期観察できます。

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特別な利害関係は宣言されません。

1。現在のプロトコルへの変更 1.1記録デバイスとスループットの考慮事項なぜなら、その商業的利用可能性、LumiCycle（Actimetrics）は、リアルタイムレコーディング4,5,9,19,29-31ための最も一般的に使用される自動化されたルミノデバイスとなっています。 LumiCycleは非常に高感度、低ノイズ14を提供する光検出器として、光電子増倍管（PMTを）採用しており、それゆえ非常に薄暗いルシフェラーゼ生物発光ベースのデータ収集のために特に適している。他の同様のPMTベースのデバイス（ 例えば 、クロノス、ATTO社、およびPOLARstarオプティマ、BMG LABTECH社）も、多くの研究32,33で使用されてきた。 35-mmディッシュを用いLumiCycleアッセイは96に適合させることができます - 、384 - 偶数または...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Hyclone社</td><td> SH30243FS </td><td>定期的な細胞増殖のための</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12100-046 </td><td> luminometry用</td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone社</td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/ GLN（100倍） </td><td> Hyclone社</td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-ルシフェリン</td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td>シグマ</td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ミリポア</td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td>フォルス</td><td>シグマ</td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td>他のすべての化学物質</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td> 37℃で5％CO2の</td></tr><tr><td>組織培養フード</td><td></td><td></td><td> BSL-2の認定</td></tr><tr><td>ライト＆蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td>オプションの位相コントラスト</td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

哺乳動物では、行動や睡眠覚醒サイクルと肝臓代謝などの生理機能の多くの側面は、内因性の概日時計（1,2日 ）によって規制されている。サーカディアン計時システムは、同期や他の場所で1,2エクストラSCNおよび周辺クロックを調整する視交叉上核（SCN）に位置し、中央のクロックで、階層的なマルチ発振器ネットワークです。個々の細胞は、概日リズム3,4、および生物シェアの異なる組織型著しく類似した生化学的な負のフィードバック機構のこれらの発振器の生成と維持のための機能部である。しかし、SCNの神経ネットワークレベルおよび生物体レベルでリズミカルな、全身の手がかりを通じて相互作用のために、生物体レベルで概日リズムが細胞自律的な5-7というわけではありません。 生体とSCNの外植片のex vivo、cの自発運動の伝統的な研究に比べエルベースインビトロアッセイは、細胞自律的な概日5,8欠陥の発見を可能にします。戦略的には、細胞ベースのモデルは、表現型の特徴と基本的な時計機構5,8-13の迅速な発見のために、より実験的に扱いやすいです。 概日リズムは動的であるため、高い時間分解能で縦測定は、時計機能を評価する必要があります。近年では、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを用いたリアルタイム生物発光の記録は、それが分子リズムの永続性とダイナミクスの検討を可能にするように、哺乳類14,15の概日リズムを研究するための一般的な手法となっています。遺伝子発現の細胞自律的な概日リズムを監視するには、ルシフェラーゼレポーターは、一過性のトランスフェクション13,16,17または安定した伝達5,10,18,19を介して細胞内に導入することができる。ここでは、レンチウイルス媒介遺伝子送達を用いて安定した伝達プロトコルを記述します。 T彼は、レンチウイルスベクターシステムは、その効率性と汎用性の一過性トランスフェクション及び生殖系列伝達など、従来の方法よりも優れている：それは分割し、非分裂細胞20の両方の宿主ゲノムへの効率的な配信と安定した統合を可能にします。レポーター細胞株が確立されると、時計機能のダイナミクスは、生物発光の記録を使って調べることができます。我々は最初のP（PER2）-D Lucレポーターライン、その後これと他のサーカディアン記者から存在するデータの生成を説明します。これらのアッセイにおいて、3T3マウス線維芽細胞およびU2OSヒト骨肉腫細胞は細胞モデルとして使用されています。我々はまた、概日の研究では、これらのクロックモデルのさまざまな使用方法について説明します。ここで説明する方法は、概日時計の細胞·分子レベルで研究する細胞種の多種多様に適用することができ、かつ他の生物系で問題に取り組む上で役立つことがあります。

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。

哺乳類において、睡眠・覚醒サイクルや肝臓の代謝などの行動および生理機能の多くの側面は、内在性の概日時計によって調節されています。

本プロトコルでは、ルシフェラーゼレポーター細胞株の作製と、それに続く細胞自律的な生物発光発現の概日リズムのモニタリングについて詳述します。まず、レンチウイルスルシフェラーゼ発現レポーターを構築してレンチウイルス粒子を産生し、目的の細胞に感染させて選択した培養細胞を増幅させます。次に、適切な記録装置を用いて、同期させたレポーター細胞における生物発光発現をモニタリングします。最終的に、生物発光記録を用いて細胞自律的な概日リズムを実証します。一過性トランスフェクションや生殖細胞系列保護などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、VIRが介在していることです。これにより、細胞ゲノムへの安定した組み込みが可能となり、効率性と汎用性も向上します。この手法は、概日時計研究の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、組織特異的な概日時計は存在するのか、また、もし存在するならば、組織特異的な概日時計にはどのような特性があるのか、といった点です。この手法は時計機構に関する洞察を得るだけでなく、細胞周期のダイナミクスや腫瘍形成などの他のシステムにも適用可能です。私たちは、組織または細胞型特異的なエピジェネティッククロックを研究することを決定した際に、初めてこの手法を考案しました。本手順のデモンストレーションを行うのは、博士研究員であるDr. Chita Norm Napkinと、私のAtory研究室の大学院生であるSandraです。通常、哺乳類の概日リズムリポーター構成体は、概日リズムプロモーターがルシフェラーゼ遺伝子と融合した発現カセットを含んでいます。このレンチウイルスリポーターでは、不安定化ルシフェラーゼがマウスのper2プロモーターの制御下にあります。組換え反応によるレポーターベクターの構築に関する詳細な手順については、効率的なトランスフェクションに関する付随する原稿を参照してください。まず、コンフルエンスが90〜100%に達した低継代数のヒト胚性腎細胞の培養液を用意します。次に、6ウェル培養プレートをコーティングします。トランスフェクションのために、各ウェルに0.001% poly L lycineを1 mL加え、室温で20分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄します。次に、トリプシンを用いて細胞を回収し、あらかじめコーティングしたプレートの各ウェルに細胞を播種します。プレートを円を描くように揺らし、細胞を均等に分散させます。1.5 mLマイクロ遠心チューブ内において、播種した細胞が80〜90%のコンフルエンスに達していることを確認します。トランスフェクションおよびその後の感染の両方のコントロールとして、レンチウイルスリポータープラスミド、DNA、および3つのパッケージングベクターを含むプラスミドトランスフェクションミックスを調製します。さらに、CMVプロモーターの制御下で強化緑色蛍光タンパク質を保持するレンチウイルスGFP発現ベクター用のウェルを1つ追加します。次に、0.25 M 塩化カルシウムを 100 µL プラスミドに加え、十分に混合します。その後、2x BBS 溶液を 100 µL 加え、穏やかに、かつ十分に混合します。この DNA 混合液を室温で 15 分間インキュベートします。待機している間に、2 9 3 T細胞の培地を2 mLの新鮮な培地に交換します。プレートをインキュベーターに戻し、培地のpHを平衡化させるため、少なくとも10分間保持します。次に、トランスフェクションミックスを細胞に滴下し、プレートを静かに回しながら顕微鏡下で粒子の形成を確認し、その後、細胞をオーバーナイトでインキュベーターに入れます。トランスフェクションから約16時間後、2 mLの新鮮なDMEMを補充し、一晩培養します。次に、トランスフェクション効率を評価するため、トランスフェクションコントロール細胞におけるEGFPの発現を確認します。高いEGFP発現を伴う90から100%のトランスフェクション効率は、ウイルス調製が良好であることの信頼できる予測指標となります。分泌された感染性ウイルス粒子を含む培地を回収し、遠心分離して残存する293T細胞を除去し、ウイルスを含む上清を回収します。3日目に、12ウェルプレートに約12,000個の293T細胞を播種し、コンフルエンシーが20～30%になるまで一晩培養し、4日目に細胞を観察します。同じく4日目に、回収したウイルス粒子含有培地にpolybreneを加え、ピペッティングにより十分に混合します。次に、3つのT3細胞から培地を吸引し、1ウェルあたり1 mLのウイルス混合液を加えます。37 °Cで一晩インキュベートした後、細胞をPBSで1回洗浄し、培地を補充して、回復と増殖のために37 °Cで一晩インキュベートします。細胞がコンフルエントになったら、細胞を継代し、翌日まで一晩培養します。感染細胞の選択を開始するには、10 µg/mLを含む新鮮な培地を添加します。Blasticidinによる死滅濃度は、各細胞株ごとに実証的に決定する必要があります。抗生物質耐性細胞を継続的に選択するため、Blasticidinを含む培地を2〜3日ごとに補充してください。時計リポーターの発現。ブラスチン耐性リポーター細胞の培養液を35 mm培養ディッシュに播種し、コンフルエントになるまで増殖させます。通常、各条件における表現型解析のため、各リポーター細胞株につき3枚以上のディッシュを用意します。PBSで1回洗浄した後、10 µMのフォルリンまたは200 nMのデキサメタゾンを含むDMEMを加え、37 °Cで1時間インキュベートして細胞を同期させます。次に、細胞を新しく調製した記録用培地に置換します。培養ディッシュを40 mmの滅菌カバーガラスで覆い、蒸発を防ぐために真空グリースで密封します。ディッシュをlumous cycleルミノメーターにセットし、リアルタイム生物発光測定を開始します。記録：96ウェルプレートを用いた記録について。GSR 2記録装置の詳細については、付属の原稿を参照してください。lum cycle解析プログラムを用いて、5〜7日間のリズムを容易に記録できます。まず、生データに対してベースライン補正を行います。次に、ベースライン除去後のデータを用いて正弦波へのフィッティングを行い、持続的なリズムを示す試料について必要なパラメータを決定します。高い過渡ルミネッセンスにより、90%以上の良好なフィッティング精度が容易に得られます。センサーの感度調整と培地交換を行います。通常、データ提示のための解析では、最初のサイクルのデータは除外します。必要に応じて、時間に対する生データをプロットしてください。ベースライン補正後のデータをプロットし、2 9 3 T細胞の一過性トランスフェクションと細胞株への感染における振幅と位相を比較します。トランスフェクションおよびトランスダクションされたGFP発現細胞の蛍光画像は、レンチウイルスを介した遺伝子導入システムが非常に効率的であることを示しています。概日時計のコアフィードバックループは、概日エンハンサーエレメントに作用してリズムのある遺伝子発現を生じさせる転写因子で構成されています。ここでは、3種類のT three細胞における4つの異なるレポーター構築物が、それぞれ異なるレポーター発現相を産生します。RNAiによる遺伝子ノックダウンおよび薬理活性化合物を用いて、複数の概日リズム要素によって組み合わせ的に制御することで、新たな中間相を生成することが可能です。本実験では、35 mmディッシュで培養したU2 OS細胞の生物発光記録に、lum cycleルミノメーターを使用しました。cry oneおよびcry two遺伝子のノックダウン効果を明らかにするために、Irnaが用いられました。ここでは、細胞の生物発光を記録するためにシナジールミノメーターが使用されました。96ウェルプレート内で、3つのT3レポーター細胞を用いて行われました。細胞リズムに対するtriuneノックダウンの影響を評価するために、RNAが使用されました。この例では、UXシステムとTecanルミノメーターを用いて、384ウェルプレート内の細胞の生物発光記録が行われました。選択されたプレートにおいて、低分子化合物を用いて、U2 OSレポーター細胞の細胞リズムにおけるタンパク質機能を薬理学的に標的化し、摂動させることができます。本手法の開発後、概日生物学の分野における研究が加速し、さまざまな細胞や組織における時計メカニズムと生理学的機能の探索が可能となりました。このビデオを視聴することで、ルシフェラーゼ・リポーター細胞株の作製方法およびその活性のモニタリング方法について深く理解することができます。また、ウイルスを取り扱う操作は極めて危険を伴う場合があることを忘れず、本手順の実施に際しては、個人用保護具の着用やウイルスの除染などの予防措置を常に講じてください。

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概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。...

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

ここでは、ヒト膵島細胞と初代筋管の概日生物発光と分泌活性を並行して監視するための設定について説明します。このために、ルシフェラーゼコアクロックレポーターのレンチウイルス遺伝子導入を採用し、続いてin...

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

乳腺上皮細胞での細胞の概日リズムを決定するための in vitro生物発光アッセイが表示されます。このメソッドは、期間...

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

遺伝的コード化ルシフェラーゼは、遺伝子発現の人気のある非侵襲的なレポーターです。ガスと温度最適化レコーダー (ワニ)...

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

この新しく開発された蛍光ベースの技術は、リアルタイムで、高時間分解能でマウスを自由に移動を視交叉上核 (SCN)...

生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング...

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。...

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

概日リズムは、ほとんどの生物に存在し、生物学的プロセスの時間的組織を調節しています。3Dオルガノイドは、最近、生理学的に重要な in vitro モデルとして浮上しています。このプロトコルでは、オルガノイドの概日リズムを観察するための生物発光レポーターの使用について説明し、多細胞系の概日リズムの in vitro...

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング

本レポートでは、オープンソースソフトウェアRStudioのRスクリプトを使用して、時系列実験から得られた大規模なデータセットを解析する方法について説明します。...

大規模データセットのユーザーフレンドリーで強力なR分析

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

学ぶルシフェラーゼレポーター細胞株の作製法と細胞自律的概日時計リズムのモニタリング技術。レンチウイルスベクトルを用いた安定した遺伝子発現システムで、侵襲性のない生体発光測定により概日リズムを長期観察できます。

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

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