ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

本プロトコルでは、ルシフェラーゼレポーター細胞株の作製と、それに続く生物発光発現の細胞自律的な概日リズムのモニタリングについて詳細に解説します。まず、レンチウイルスルシフェラーゼ発現レポーターを構築してレンチウイルス粒子を産生し、目的の細胞に感染させて、選択した培養細胞を増幅させます。次に、適切な記録装置を用いて、同期させたレポーター細胞における生物発光発現をモニタリングします。

最終的に、生物発光記録を用いて細胞自律的な概日リズムを実証します。一過性トランスフェクションや生殖細胞系保護などの既存の手法と比較して、この技術の主な利点は、VIRを介していることです。これにより、細胞のゲノムへの安定した組み込みが可能となり、効率と汎用性が向上します。

この手法は、概日時計研究における重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、組織特異的な概日時計は存在するのか、また、もし存在するならば、組織特異的な概日時計にはどのような特性があるのか、といった点です。

この手法は時計メカニズムへの知見を提供できるだけでなく、細胞周期のダイナミクスや腫瘍形成などの他のシステムにも適用可能です。私たちは、組織または細胞型特異的な時計を研究することを決定した際に、初めてこの手法を考案しました。

手順の実演は、ポストドク研究員のDr.Chita Norm Napkinと、私のAtory研究室の大学院生であるSandraが行います。一般的に、哺乳類の概日リズムレポーター構築物には、概日リズムプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が融合した発現カセットが含まれています。このレンチウイルスレポーターでは、不安定化ルシフェラーゼがマウスのper2プロモーターの制御下にあります。

組み換え反応によるレポーターベクターの構築に関する詳細な手順については、効率的なトランスフェクションについて述べた付属の原稿を参照してください。まず、コンフルエンシーが90～100%の低継代数のヒト胚性腎細胞の培養液を用意します。次に、6ウェル培養プレートにコーティングを行います。

トランスフェクションのため、各ウェルに0.001% poly L lycineを1 mL加え、室温で20分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄します。次に、トリプシンを用いて細胞を回収し、あらかじめコーティングしたプレートの各ウェルに細胞を播種します。プレートを回転させ、細胞を均一に分散させます。

1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、播種した細胞が80から90%のコンフルエンスに達していることを確認します。トランスフェクションおよびその後の感染の両方のコントロールとして、レンチウイルスレポータープラスミドDNAおよび3つのパッケージングベクターを含むプラスミドトランスフェクションミックスを調製します。さらに、CMVプロモーターの制御下に強化緑色蛍光タンパク質を持つレンチウイルスGFP発現ベクター用のウェルを追加します。

次に、0.25 molar 塩化カルシウムを100 µLプラスミドに加え、十分に混ぜ合わせます。その後、2X BBS溶液を100 µL加え、穏やかに、かつ十分に混ぜ合わせます。このDNA混合液を室温で15分間インキュベートします。

待機している間に、2 9 3 T細胞の培地を2 mLの新鮮な培地に交換します。プレートをインキュベーターに戻し、培地のpHを安定させるため、少なくとも10分間静置します。次に、トランスフェクションミックスを細胞に滴下し、プレートをゆっくりと回して混ぜ、顕微鏡下で粒子の形成を確認した後、細胞をインキュベーターに入れ、一晩培養します。

トランスフェクションから約16時間後に、2 mLの新鮮なDMEMを補充し、一晩培養します。次に、トランスフェクション効率を評価するため、トランスフェクションコントロール細胞におけるEGFP発現を確認します。高いEGFP発現を伴う90～100%のトランスフェクション効率は、良好なウイルス調製が行われる信頼性の高い指標となります。

分泌された感染性ウイルス粒子を含む培地を回収し、遠心分離して残存する2 9 3 T細胞を除去し、ウイルス含有上清を回収します。3日目に、約12, 003 T3細胞を12ウェルプレートに播種し、コンフルエンシーが20～30%になるまで一晩培養し、4日目に細胞を観察します。引き続き4日目に、回収したウイルス粒子含有培地にpoly brainを加え、ピペッティングにより十分に混合します。

次に、3つのT3細胞から培地を吸引し、各ウェルに1 mLのウイルス混合液を加えます。37 °Cで一晩インキュベートした後、PBSで一度細胞を洗浄し、培地を補充して37 °Cで一晩インキュベートし、細胞を回復・増殖させます。コンフルエントになったら細胞を継代し、翌日まで一晩培養します。

感染細胞の選択を開始するには、10 µg/mLを含む新鮮な培地を加えます。Blasticidinの殺細胞濃度は、各細胞株について経験的に決定する必要があります。抗生物質耐性細胞を継続的に選択させるため、Blasticidinを含む培地を2〜3日ごとに補充してください。

時計リポーターの発現。ブラスチン耐性リポーター細胞を35 mm培養皿でコンフルエントになるまで増殖させた後、通常、各条件下で各リポーター細胞株につき3皿以上を準備し、サーカディアン表現型を解析します。PBSで1回洗浄した後、10 µMのフォルリンまたは200 nMのデキサメタゾンを含むDMEMを加え、37 °Cで1時間インキュベートして細胞を同調させます。

次に、細胞を調製したばかりの記録用培地に移します。培養ディッシュを40 mmの滅菌カバーガラスで覆い、蒸発を防ぐために真空グリースで密閉します。ディッシュをLuminous Cycleルミノメーターにセットし、リアルタイム生物発光測定を開始します。

記録：96ウェルプレートを用いて記録を行います。GSR 2記録装置については、添付の原稿を参照してください。lum cycle解析プログラムを用いて、5〜7日間のリズムを容易に記録できます。

まず、生データのベースライン補正を行います。次に、ベースライン除去後のデータを正弦波にフィットさせ、持続的なリズムを示すサンプルの必要パラメータを決定します。高い過渡ルミネッセンスにより、90%以上の適合度は容易に達成できます。

感度調整および培地交換を行います。データ提示のための解析では、通常、最初のサイクルのデータは除外します。必要に応じて、生データを時間に対してプロットしてください。

293T細胞の一過性 transfection および細胞株への感染における振幅と位相を比較するため、ベースライン補正後のデータをプロットします。transfection および transduction を行ったGFP発現細胞の蛍光画像は、レンチウイルス媒介遺伝子導入システムが非常に効率的であることを示しています。概日時計のコアフィードバックループは、概日エンハンサーエレメントに作用してリズム的な遺伝子発現を生成する転写因子で構成されています。

ここでは、3種類のT3細胞における4つの異なるレポーター構築物を用いて、レポーター発現の異なる位相を生成します。RNAiによる遺伝子ノックダウンと薬理学的に活性な化合物を用い、複数の概日リズム要素による複合的な調節を行うことで、新規の中間位相を生成することが可能です。本実験では、U2 OS細胞を35 mmディッシュで培養し、lum cycleルミノメーターを用いて生物発光の記録を行いました。

cry oneおよびcry two遺伝子のノックダウン効果を明らかにするために、Irnaが使用されました。ここでは、細胞の生物発光を記録するためにシナジールミノメーターが使用されました。96ウェルプレートにおいて、3つのT3レポーター細胞を用いました。

細胞リズムに対するtriuneノックダウンの影響を評価するために、RNAが使用されました。この例では、UXシステムとtecanルミノメーターを用いて、3 84ウェルプレート内の細胞の生物発光記録が行われました。プレートが選択されている間、低分子化合物を用いてU2 OSリポーター細胞の細胞リズムにおけるタンパク質機能を薬理学的に標的化し、撹乱させることができます。

本手法の開発後、概日生物学の分野における研究は、さまざまな細胞および組織型における時計メカニズムと生理学の探索へと道を切り開かれました。本ビデオを視聴することで、ルシフェラーゼレポーター細胞株の作製方法およびその活性のモニタリング方法について、十分に理解できるはずです。

また、ウイルスを扱う作業は極めて危険である可能性があるため、本手順の実施中は、個人用保護具の着用やウイルスの除染などの予防措置を必ず講じてください。