Name: STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶ末梢血由来iPSCの効率的な作製法。STEMCCAレンチウイルスベクターを用いて単核球を再プログラミングし、多能性マーカーで特性評価する簡便なプロトコルを解説。再生医療研究に応用可能です。

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これらの研究は、GJMとGMへのNIH UO1HL107443-01賞によって部分的に資金を供給した。

1。末梢血単核細胞（PBMC）の単離と拡大 0日目<ol><li>クエン酸ナトリウムのBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブに末梢血4mlを描く。チューブ8〜10回転倒し、室温で30分間1800×gで遠心分離します。理想的には、このステップは、採取後2時間以内に行う必要があります。 </li><li>滅菌15mlコニカル遠心管に軟膜（ゲルバリアーとプラズマとの間の細胞層）をピペッティングにより単核細胞（MCS）を収集します。 15分間、300×gで数回、遠心反転、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10mlに総量を持参してください。 </li><li>滅菌した10mlのPBSに細胞を再懸濁し、細胞数を実行します。 10分間、300×gで滅菌15mlコニカル遠心管と遠心分離機に1〜2×10 6個の細胞を移す。 </li><li>拡張培地2ml（EM）（50μg/ mlのASCOを含むQBSF-60幹細胞培地で細胞を再懸濁rbic酸、50 ng / mlで、SCF、10 ng / mlのIL-3、2 U / mlのEPOは、40 ng / mlで、IGF-1、1μMのデキサメタゾンおよび100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシン）とに転送12ウェルプレートのウェル1。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 300×で残った細胞を遠心 10％DMSOを含有FBS中で10分間凍結〜2×10 6細胞/バイアル用グラム。 </li><li>凍結PBMCを使用して、プロトコルを起動するには、10分間、300×gでQBSF媒体および遠心分離機10mlに細胞の1バイアルを解凍します。 EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに移す。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。 </li></ol> 3日目、6日目<ol start="17"><li>滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。 </li><li> 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。 </li><li> EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12の1つのウェルに移すウェルプレート。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。 </li></ol> 2。 STEMCCAレンチウイルスによる末梢血単核細胞の形質導入 DAY 9 <ol><li>滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。 </li><li> 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。 </li><li> 5ポリブレンとSTEMCCAレンチウイルスのμg/ mlの（MOI = 1から10）、12ウェルプレートのウェル1への転送を含む新鮮なEMの1ml中に細胞を再懸濁する。 （レンチウイルス粒子の産生を記述するプロトコルがで見つけることができます<a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a> ） </li><li> 90分間25℃で2250 rpmで皿回しをする。 </li><li>スピンした後、新鮮なEMの追加の1ミリリットルを追加 、2mlの培地の合計ポリブレンの5μg/ mlを含有し、37℃でプレートをインキュベート5％CO 2インキュベーター。 </li></ol> 10日目<ol start="16"><li>滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。 </li><li> 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。 </li><li> EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに移す。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。 </li></ol> 3。メッキのMEFに形質導入​​細胞 11日目<ol><li>コート2×10 5細胞で0.1％のゼラチンと板不活性化されたマウス胚性線維芽細胞（MEF）を持つ/ウェルのMEF培地（IMDMを10％FBS、1％非必須アミノ酸を含む、100μMのβ-6ウェルプレートのウェルメルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。感染当たり3ウェルを準備します。 </li></ol> 12日目<ol start="2"><li>滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し<html>接着した細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。 </li><li> EM培地（50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ng / mlのSCF、10 ng / mlのILで使用したのと同じ濃度で10 ng / mlのbFGFは、アスコルビン酸および成長因子を含むMEF培地3mlに細胞を再懸濁-3、2 U / mlのEPOは、40 ng / mlで、IGF-1、1μMデキサメタゾン）。 </li><li> MEFを含む6ウェルプレートのウェルあたりの細胞のプレート1ミリリットル。 /ウェルの培地を2.5mlの合計のためのbFGF、アスコルビン酸、および増殖因子とMEF培地の1.5 mlを加える。 </li><li> 25℃で500rpmで皿回しをする℃で30分間。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で静置します。 </li></ol> 14日目<ol start="6"><li> 10 ng / mlのbFGFおよび50μg/ mlのアスコルビン酸（無成長因子）を含むのMEF培地2.5 mlで一日おきに細​​胞を養う。各フィードで浮遊細胞を吸引して廃棄します。 </li><li> （通常週1回）、必要に応じて追加のMEFを追加します。 </li></ol>P &quot;&gt;〜20日目<ol start="8"><li>かつて小さなコロニーが送り細胞がヒト胚性幹細胞（hESCの）培地（DMEM/F12含む20％ノックアウト血清代替、1％非必須アミノ酸、100μMのβ-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミンの2ミリリットルとの毎日、現れる、100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10 ng / mlのbFGF）の。 </li></ol> 4。ピッキングとIPSCクローンの拡大 〜DAY 30から40 <ol><li> 12ウェルプレート不活性化されたMEFを含む1ml /ウェルのhESCの培地プラスStemolecule Y27632の1​​0μM（ROCK阻害剤）との事前作成の個々のウェルに各コロニーを拾う。 </li><li>唯一のhESC培地1ml（NO ROCK阻害剤）で、その後毎日の細胞を養う。 </li></ol> 5。多能性マーカーのための免疫蛍光染色<ol><li>染色はミリポアキット &quot;ES細胞マーカーサンプルキット&quot;を使用し、製造業者のプロトコールに従って行った。 </li></ol> 6。 INTEGの切除格STEMCCAベクトル<ol><li>カセットを再プログラミングの切除は、Cre-IRES-Puroの発現ベクターをトランスフェクション後および6に記載されているように簡単なピューロマイシンによる選択を利用して達成されています。 </li></ol>

<ol><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li>
<li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li>
<li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34%28-%29+cells%2C+outweighing+the+contribution+of+CD34%28%2B%29+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、ここたて​​採取した末梢血数ミリリットルから単離された単核細胞から人間性IPSCを生成するためにSTEMCCAレンチウイルスベクターの使用を記載している。遠い場所から取得されたドナー細胞を利用する際のプロトコルはまた、重要な実用的な含意の詳細（バフィーコートから直接取得した）凍結PBMCを再プログラムするために使用することができます。プログラミングの誘導前に、隔離されたPBMCは核初期化により適した細胞の健全な増殖人口をレンダリングクリティカル拡張ステップを経る必要があります。これは簡単に造血培養条件の拡大に応じて細胞のクラスター &#39;ブドウの房のような&#39;の存在によって観察される。未満、5×10 5個の細胞を形質導入された場合、細胞はMEFを含む6ウェルプレートの1つまたは2つのウェル上にメッキすることができる。私たちは、25日後に形質導入​​にいくつかのケースでは、hESCの様コロニーを観察するのに必要な時間内にいくつかの変動を経験している。ROCK阻害剤の使用は新興IPSCコロニーのピッキング時の生存率とクローニング効率を高めることが重要です。驚くべきことに、再プログラム線維芽細胞からのコ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウムのBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブ</td><td> BD Biosciences社</td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60幹細胞培地</td><td>生物学的な質</td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>アトランタバイオ</td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ANT-PM-2 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1の</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>シグマ</td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGFの</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td>ステムジェント社</td><td> 04から0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES細胞マーカーサンプルキット</td><td>ミリポア</td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

stemccaレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

4つの転写因子の異所性発現は、あるOct4、Klf4の、Sox2、およびCMYCを通して、人間の体細胞は、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）1-4を生成し 、多能性状態に変換することができます。患者固有性IPSCは、胚性幹細胞（ESC）を囲む、可能な免疫拒絶を回避したい倫理的な問題を欠いている。したがって、性IPSCは疾患モデル研究、薬理学的化合物のスクリーニング、及び再生治療5のためのかなりの注目を集めている。 私たちは、山中因子6をコードする単一のポリシストロン切除可能レンチ幹細胞カセット（STEMCCA）を使用して異なる肺疾患の患者から導入遺伝子を含まない人間性IPSCの発生を示している。これらIPSC行は皮膚線維芽細胞、再プログラムのために使用される最も一般的な細胞型から生成された。通常は、線維芽細胞を得ることがパンチ生検、細胞の膨張が続く肌を必要とするいくつかの通路のための文化の中での。重要なのは、グループの数は性IPSC 7月9日にヒト末梢血細胞の再プログラム化を報告している。ある研究では、STEMCCAベクトルのTet誘導性バージョンが血液細胞を同時にリバーステトラサイクリントランスアクチベーターをコードして恒常的に活性なレンチウイルスに感染していることが必要とされ、9を採用した。線維芽細胞とは対照的に、末梢血細胞が大幅に患者の不快感や苦痛を減らし、低侵襲の手順を介して収集することができます。構成単切除可能ベクターを用いて血液細胞を再プログラミングするためのシンプルで効果的なプロトコルは、より広範な研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSC技術の応用を促進することがあります。さらに、末梢血細胞の再プログラミングすることは皮膚生検を回避すべきで個人からの性IPSCの生成ができるようになります（ すなわち 。瘢痕異常）または起因する既存の疾患状態preventiにパンチ生検にngのアクセス。 ここでは、構成的に4因子を発現する単一フロックス化、切除可能レンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞（PBMC）から人間性IPSCの世代のためのプロトコルを示しています。 STEMCCAレンチウイルスで形質導入される前を含む培地アスコルビン酸、SCFは、IGF-1、IL-3およびEPOの10,11に記載されているように採取直後または解凍PBMCは9日間に展開されます。次いで、細胞をMEFの上にプレーティングとESCのようなコロニーが2週間後に感染可視化することができる。最後に、選択されたクローンを増殖させ、多能性マーカーSSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81の発現のためにテストされています。このプロトコルは、血液の容易にアクセス可能な4ミリリットルから人間性IPSCの生成のための信頼性のある方法論を提供し、シンプル、堅牢で非常に一貫しています。

我々は、単一のレンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞から人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。 図1Aは、プロトコルの略図を示す。血液はクエン酸ナトリウムとBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブに採取し、遠心分離後、単核細胞はポリエステルゲルと血漿（バフィーコート）（ 図1B）との間のインターフェースから収集することができる。孤立したPBMCを、9日間培養で増殖されています。 図2は、細胞が顕著に分裂していることを示す、0日目と9日目のPBMCを比較します。 STEMCCAレンチウイルスで約10-15日後の伝達、小さな明るいコロニーの外観はまだ未定義のコロニー形態と、観察される。 hESCの培地を添加した後、hESCの様コロニーを簡単に（ 図2D）を同定することができる。これらのコロニーの一部は機械的に、拾っ拡大と特徴付けられるこのような、SSEA-4、TRA-1-60とTRA-1-81（ 図3）</stron...

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4 mlから人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。容易に入手可能な血液細胞の再プログラミングすることは、より広い研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSCの技術の利用を促進することを約束します。

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

4つの転写因子（Oct4、Klf4、Sox2、およびcMyc）を異所性に発現させることで、ヒト体細胞を多能性状態に変換することができ、...

本プロトコルでは、4 mLの末梢血からヒト人工多能性幹細胞を効率的に作製する方法を実演します。0日目に、末梢血サンプルから単核細胞を分離し、拡大培養します。その後、リプログラミング用ステム共ベクターを初代細胞に導入します。9日目に、形質導入した細胞を不活化したマウス胚性線維芽細胞上に播種し、約3週間培養します。HESC様コロニーを選別し、拡大培養および特性解析を行います。SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81などの多能性マーカーの発現に関する免疫蛍光染色の結果です。ヒト人工多能性幹細胞の効率的な作製について実演します。ヒト人工多能性幹細胞の作製に幹細胞抗ウイルスベクターを用いる方法は、既存の他の手法と比較していくつかの利点があります。おそらく最も魅力的なのは、この手法の全体的な簡便さであり、ドナー組織への容易なアクセス、すなわち末梢血という readily obtainable（容易に入手可能）な検体で十分であるという点です。本手法の最も重要な要素は、Repプログラミングの効率と、得られたiPS細胞クローンの質です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるAndrea January Summerと、George Murphy研究室の大学院生であるSarah Rozelleが行います。すべて0日目に行います。クエン酸ナトリウム含有のバキュテナー細胞調製チューブに末梢血 4 mL を採取します。採取後 2 時間以内に、チューブを 8 ～ 10 回転倒混和します。室温で 1,800 G で 30 分間遠心分離し、単核細胞を回収します。血漿を吸引して除去し、ゲルバリアと血漿の間にある細胞層であるバフィーコートをピペットで吸い出します。バフィーコートを滅菌済みの15 milliliterコニカル遠心チューブに移し、滅菌PBSを加えて全量を10 millilitersにします。チューブを数回反転して混和させ、300 Gで15分間遠心分離します。細胞ペレットを10 mLの滅菌PBSで再懸濁し、細胞数を計測した後、1〜2 × 10⁶個の細胞を滅菌済みの15 mLコニカル遠心チューブに回収します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを2 mLの増殖培地で再懸濁します。次に、単離した単核細胞を12ウェルプレートの1ウェルに播種し、37 °C、5% CO₂条件下で培養します。遠心分離により残りの細胞を回収し、3日目と6日目に、10% DMSO含有FBSを用いて、1バイアルあたり約2 × 10⁶個の細胞のストックを凍結保存します。細胞を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、1 mLのQBSF 60幹細胞培地でウェルを1回洗浄します。これにより、接着細胞を回収します。遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットを2 mLのemに再懸濁します。次に、細胞懸濁液を12ウェルプレートの1ウェルに移し、9日目に培養物をインキュベーターに戻します。細胞を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、ウェルを1 mLのQB SF 60幹細胞培地で1回洗浄します。接着細胞を回収するため、培養物を300 Gで10分間遠心分離します。次に、5 µg/mLのpoly brainとMOIが1〜10となるSTEM lentivirusを含む1 mLの新鮮なEMで細胞ペレットを再懸濁します。その後、懸濁液を12ウェルプレートの1ウェルに移し、25 °Cで2,250 RPMで90分間遠心分離します。さらに、5 µg/mLのpoly brainを含む新鮮なEMを1 mL加え、合計2 mLのEMとして、10日目にプレートを細胞培養インキュベーターに入れます。前述の手順で細胞を回収した後、細胞ペレットを2 mLのEM培地で再懸濁します。11日目に12ウェルプレートの1ウェルにある導入細胞を、0.1%ゼラチンでコートした6ウェルプレートに播種します。その後、不活化したマウス胚性線維芽細胞を、meth培地を用いて1ウェルあたり2 × 10⁵個で播種します。感染ごとに3ウェルずつ準備してください。翌日、前述の手順に従って、形質導入された単核細胞を回収します。遠心分離後、細胞ペレットをBFGF、アスコルビン酸、および成長因子を含む3 mLのmeth培地に再懸濁します。次に、MESプレートから培地を吸引し、1ウェルあたり1 mLのMCs用OFMを分注します。続いて、1.5 mLの完全メチル化培地を添加し、プレートを500 RPM、25 °Cで30分間遠心分離します。その後、37 °C、5% CO2条件下で2日間培養します。これを14日目以降に実施してください。10 ng/mLのBFGFおよび50 µg/mLのアスコルビン酸を含み、それ以外の成長因子を含まないmeth media 2.5 mLを、1日おきに補填します。20日目付近で小さなコロニーが出現したら、30日から40日の間、ヒト胚性幹細胞培地2 mLを毎日添加します。各コロニーをピックアップし、1 mLのHESC mediumとROCK阻害剤を含む不活化mathsをあらかじめ分注した12ウェルプレートの個別のウェルに移植し、細胞に毎日給餌します。その後、ROCK阻害剤を含まないHESC培地 1 mLを用いて、ヒト単球由来多能性幹細胞を多能性マーカーの免疫蛍光染色および組み込まれたリプログラミングカセットの切除に供することが可能になります。本プロトコルにおいて、細胞はP BMCsからヒトiPSCsへと、いくつかの形態学的変化を経ます。0日目に、末梢血から単離した単核細胞を、9日後に増殖培地で培養します。細胞のクラスターのようなブドウの房状の形態が観察され、形質導入前に細胞が健全に増殖していることが示唆されます。細胞をMA上に播種してから約21日後にコロニーが形成されます。30日目には、iPS細胞コロニーに典型的なヒト胚性幹細胞様形態が見られます。pbmcから作製したiPSCsの免疫蛍光分析により、多能性マーカーであるSSEA-4、TRA-1-60、およびTRA-1-81の発現が示されています。また、これらのiPSCsはアルカリホスファターゼ陽性であることも示しています。これらの画像は、Summersら（2010年）に記載されている通り、Creリコンビナーゼとピューマイシン耐性遺伝子を共発現するプラスミドを導入することで、トランスジェニックフリーのiPSCsを作製する手順を示しています。導入後のiPSCsを導入前のiPSCsと比較すると、細胞死が観察されます。ピューマイシンによる2日間の選別後、トランスフェクションから約10日後に耐性細胞から新たなコロニーが出現します。選択したコロニーのサザンブロット解析により、導入遺伝子の切り出しが確認されます。レーン1、3、5、および7は、切り出し前のiPSCクローンにおける導入遺伝子の存在を示しています。これらのバンドは、導入遺伝子の切り出し後であるレーン2、4、6、および8では消失しています。このビデオを視聴することで、あらゆる個体の少量の末梢血から、高品質な正常または疾患特異的なヒトiPS細胞を一貫して堅牢に作製できるようになります。このアプローチにより、レポーターのプログラミング工程が簡略化され、幹細胞研究コミュニティが広く利用できるようになります。同時に、より均一な幹細胞株集団を構築するためのベースラインを提供します。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。...

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。...

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。...

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。...

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。...

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

学ぶ末梢血由来iPSCの効率的な作製法。STEMCCAレンチウイルスベクターを用いて単核球を再プログラミングし、多能性マーカーで特性評価する簡便なプロトコルを解説。再生医療研究に応用可能です。

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

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