STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

本プロトコルでは、4 mLの末梢血からヒト人工多能性幹細胞を効率的に作製する方法を実演します。0日目に、末梢血サンプルから単核細胞を分離し、拡大培養します。その後、リプログラミング用ステム共ベクターを初代細胞に導入します。

9日目に、形質導入した細胞を不活化したマウス胚性線維芽細胞上に播種し、約3週間培養します。HESC様コロニーを選別し、拡大培養および特性解析を行います。SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81などの多能性マーカーの発現に関する免疫蛍光染色の結果です。

ヒト人工多能性幹細胞の効率的な作製について実演します。ヒト人工多能性幹細胞の作製に幹細胞抗ウイルスベクターを用いる方法は、既存の他の手法と比較していくつかの利点があります。おそらく最も魅力的なのは、この手法の全体的な簡便さであり、ドナー組織への容易なアクセス、すなわち末梢血という readily obtainable（容易に入手可能）な検体で十分であるという点です。

本手法の最も重要な要素は、Repプログラミングの効率と、得られたiPS細胞クローンの質です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるAndrea January Summerと、George Murphy研究室の大学院生であるSarah Rozelleが行います。すべて0日目に行います。

クエン酸ナトリウム含有のバキュテナー細胞調製チューブに末梢血 4 mL を採取します。採取後 2 時間以内に、チューブを 8 ～ 10 回転倒混和します。室温で 1,800 G で 30 分間遠心分離し、単核細胞を回収します。

血漿を吸引して除去し、ゲルバリアと血漿の間にある細胞層であるバフィーコートをピペットで吸い出します。バフィーコートを滅菌済みの15 milliliterコニカル遠心チューブに移し、滅菌PBSを加えて全量を10 millilitersにします。チューブを数回反転して混和させ、300 Gで15分間遠心分離します。

細胞ペレットを10 mLの滅菌PBSで再懸濁し、細胞数を計測した後、1〜2 × 10⁶個の細胞を滅菌済みの15 mLコニカル遠心チューブに回収します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを2 mLの増殖培地で再懸濁します。次に、単離した単核細胞を12ウェルプレートの1ウェルに播種し、37 °C、5% CO₂条件下で培養します。

遠心分離により残りの細胞を回収し、3日目と6日目に、10% DMSO含有FBSを用いて、1バイアルあたり約2 × 10⁶個の細胞のストックを凍結保存します。細胞を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、1 mLのQBSF 60幹細胞培地でウェルを1回洗浄します。これにより、接着細胞を回収します。

遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットを2 mLのemに再懸濁します。次に、細胞懸濁液を12ウェルプレートの1ウェルに移し、9日目に培養物をインキュベーターに戻します。細胞を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移し、ウェルを1 mLのQB SF 60幹細胞培地で1回洗浄します。接着細胞を回収するため、培養物を300 Gで10分間遠心分離します。

次に、5 µg/mLのpoly brainとMOIが1〜10となるSTEM lentivirusを含む1 mLの新鮮なEMで細胞ペレットを再懸濁します。その後、懸濁液を12ウェルプレートの1ウェルに移し、25 °Cで2,250 RPMで90分間遠心分離します。さらに、5 µg/mLのpoly brainを含む新鮮なEMを1 mL加え、合計2 mLのEMとして、10日目にプレートを細胞培養インキュベーターに入れます。

前述の手順で細胞を回収した後、細胞ペレットを2 mLのEM培地で再懸濁します。11日目に12ウェルプレートの1ウェルにある導入細胞を、0.1%ゼラチンでコートした6ウェルプレートに播種します。その後、不活化したマウス胚性線維芽細胞を、meth培地を用いて1ウェルあたり2 × 10⁵個で播種します。感染ごとに3ウェルずつ準備してください。

翌日、前述の手順に従って、形質導入された単核細胞を回収します。遠心分離後、細胞ペレットをBFGF、アスコルビン酸、および成長因子を含む3 mLのmeth培地に再懸濁します。

次に、MESプレートから培地を吸引し、1ウェルあたり1 mLのMCs用OFMを分注します。続いて、1.5 mLの完全メチル化培地を添加し、プレートを500 RPM、25 °Cで30分間遠心分離します。その後、37 °C、5% CO2条件下で2日間培養します。これを14日目以降に実施してください。

10 ng/mLのBFGFおよび50 µg/mLのアスコルビン酸を含み、それ以外の成長因子を含まないmeth media 2.5 mLを、1日おきに補填します。20日目付近で小さなコロニーが出現したら、30日から40日の間、ヒト胚性幹細胞培地2 mLを毎日添加します。各コロニーをピックアップし、1 mLのHESC mediumとROCK阻害剤を含む不活化mathsをあらかじめ分注した12ウェルプレートの個別のウェルに移植し、細胞に毎日給餌します。

その後、ROCK阻害剤を含まないHESC培地 1 mLを用いて、ヒト単球由来多能性幹細胞を多能性マーカーの免疫蛍光染色および組み込まれたリプログラミングカセットの切除に供することが可能になります。本プロトコルにおいて、細胞はP BMCsからヒトiPSCsへと、いくつかの形態学的変化を経ます。0日目に、末梢血から単離した単核細胞を、9日後に増殖培地で培養します。

細胞のクラスターのようなブドウの房状の形態が観察され、形質導入前に細胞が健全に増殖していることが示唆されます。細胞をMA上に播種してから約21日後にコロニーが形成されます。30日目には、iPS細胞コロニーに典型的なヒト胚性幹細胞様形態が見られます。

pbmcから作製したiPSCsの免疫蛍光分析により、多能性マーカーであるSSEA-4、TRA-1-60、およびTRA-1-81の発現が示されています。また、これらのiPSCsはアルカリホスファターゼ陽性であることも示しています。これらの画像は、Summersら（2010年）に記載されている通り、Creリコンビナーゼとピューマイシン耐性遺伝子を共発現するプラスミドを導入することで、トランスジェニックフリーのiPSCsを作製する手順を示しています。導入後のiPSCsを導入前のiPSCsと比較すると、細胞死が観察されます。

ピューマイシンによる2日間の選別後、トランスフェクションから約10日後に耐性細胞から新たなコロニーが出現します。選択したコロニーのサザンブロット解析により、導入遺伝子の切り出しが確認されます。レーン1、3、5、および7は、切り出し前のiPSCクローンにおける導入遺伝子の存在を示しています。これらのバンドは、導入遺伝子の切り出し後であるレーン2、4、6、および8では消失しています。このビデオを視聴することで、あらゆる個体の少量の末梢血から、高品質な正常または疾患特異的なヒトiPS細胞を一貫して堅牢に作製できるようになります。

このアプローチにより、レポーターのプログラミング工程が簡略化され、幹細胞研究コミュニティが広く利用できるようになります。同時に、より均一な幹細胞株集団を構築するためのベースラインを提供します。