プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

この手順の全体的な目標は、シンクロトロンベースのX線マイクロトモグラフィー技術を利用して、植物の血管輸送の構造と機能を調査することです。これは、最初にチャックホルダーまたは生きた植物ホルダーに取り付けるサンプルを準備し、スキャンする部分ができるだけ垂直であることを確認し、必要な予備的な生理学的測定を行うことによって達成されます。第2ステップは、調製した試料または生きた植物をA LSビームライン8.3 0.2ハッチにセットし、スキャンのためにハッチを固定することです。次に。

サンプルが適切に配置された後、スキャンが開始されます。最後のステップは、ワークステーションコンピュータを使用してスキャンの品質を正規化、再構築、および評価してから、データをVISOに渡して3D視覚化プロセスを行うことです。最終的に、X線マイクロトモグラフィーを使用して、植物の水伝導性血管系の相互接続と機能状態の詳細を明らかにします。

この手法は、連続切片作製や光学顕微鏡などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、植物組織を前例のない解像度で任意の方向で探索できることです。この方法は、植物の水輸送の基本的な側面から干ばつ、凍結耐性、病原体が宿主植物内でどのように移動するかまで、植物生物学の分野における重要な問題を理解するのに役立ちます。このプロトコルは、前述のように、高度な光源での作業用に設計されています。

8.3 0.2.他のシンクロトロン施設での作業には、ビームラインの適応が必要となる場合があります。これらの施設の使用に必要な安全および放射線トレーニングに従って、生きた植物のサンプル調製を開始してください。

まず、直径約10センチメートルの鉢で植物を育て、スキャンする植物の主茎またはその他の部分ができるだけ中央に配置され、鉢に垂直に向けられるようにします。HRCT装置ハッチの物理的寸法は、生きている植物の高さを約1メートルに制限しています。そのため、生きた植物のイメージングは、苗木や苗木で行うのが最適です。

小さな鉢で育てられたものは、カスタムメイドの硬質アルミ製ポットホルダーを使用して、生きた鉢植えの植物を取り付けます。トッププレートの高さは、さまざまなポットの高さに対応するように調整する必要があります。ここでは、プレートの上部が土壌表面の上部と揃うように設計されており、植物は2つの部分からなるプレートの中心から突き出ています。

ホルダーに取り付けたら、SHOランダースタイルの圧力チャンバーまたはクリップオンリーフパラメータを使用して茎の水電位を測定し、スキャンする前に植物の生理学的状態を判断します。茎の周りに銅線の小片をねじって受託者として機能し、繰り返しスキャンされる植物のスキャン位置が一貫していることを確認します。次に、アルミニウムプラントホルダーの上の植物の上に薄い壁のアクリルシリンダーを置き、ネジで所定の位置に固定してサンプルを安定させます。

画像の歪みの原因となる植物部分の振動や動きをさらに最小限に抑えるために、追加のラップペーパータオルとテープを使用する必要があります。カスタムポットホルダーをエアベアリングステージに取り付け、X線源とイメージングセンサーおよびカメラ機器の間にある位置にロックします。ステムをできるだけ垂直に配置し、サンプルを磁気チャックベースの中央に配置して、視野内に留まるようにしてください 回転中、新鮮な植物材料、通常は茎やペットは、生きた植物からすぐに取り除いた後にスキャンできます。

実験の目的が木部ネットワーク全体を視覚化することである場合、まず血管内の水を排気し、空気に置き換える必要があります。これを行うには、サンプルを中傷スタイルの圧力チャンバーに取り付け、圧縮空気または窒素を低圧で約5分間サンプルに押し込みます。船舶ネットワークからの避難に必要な時間は種によって異なります。

意図が新鮮な植物組織における塞栓症形成の程度を評価することである場合、新鮮なかみそりの刃を使用して植物からサンプルを採取し、水中で切り込みを入れます。次に、スキャン中の乾燥を防ぐためにサンプルをパラフォームの層で包み、エアベアリングステージの中央にねじ込まれた金属プレートに固定されたドリルチャックにサンプルを取り付け、サンプルが視野内に留まるように、前述のようにサンプルを垂直に向けます。乾燥した木質組織からサンプルを調製するには、まずサンプルを約6cmの長さにカットします。

ターゲットスキャン領域内でできるだけまっすぐで、直径が約1cmのサンプルを選択します。次のステップは、サンプル全体をゆっくりと脱水して、最適な組織サンプルの視覚化と画像のコントラストを確保することです。木質組織サンプルを低温の乾燥オーブンに入れて、組織の亀裂や裂け目を引き起こさずにサンプルをゆっくりと乾燥させます。

状況によっては、サンプルに受託マーカーを添付することが望ましい場合があります。これにより、走査型電子顕微鏡を用いたその後の解剖と可視化をHRCT画像の特定の点に向けることができます。これを行うには、パルファムを使用して金属またはガラスのビーズまたはワイヤーをステムの外側に貼り付けます。

最後に、スキャンする前に、サンプルをドリルチェックに取り付け、上記のように中央に配置します。アプリケーションに最適な倍率を決定します。ここで使用するA LSビームライン8.3 0.2は、倍率2倍×5倍および倍率10倍で走査できる機能を備えています。

X線のエネルギーを15キロ電子ボルトに設定します。露光時間は、通常、サンプルの厚さと密度に依存し、100〜1000ミリ秒の範囲です。アプリケーションに適した角度増分を選択します。

スキャン中にサンプルは180度回転し、回転中に撮影される画像の数は、データセットのサイズ、スキャン間隔の長さ、および最終的な画像品質に大きな影響を与える可能性があります。一般的なスキャンは0.25度刻みで実行され、スキャンごとに513枚の画像が得られます。スキャン間隔を短くするには、スキャンごとに画像がキャプチャされている間、サンプルが連続的に回転する連続断層撮影設定を使用して、明視野および暗視野画像も収集する必要があります。

明視野画像は、ビーム内にサンプルがない画像です。これらは、多くの場合、サンプルのスキャンの前後にサンプルを水平に並進することによって収集されます。暗視野は、X線シャッターを閉じることで収集されます。

これは、X線なしでカメラが表示する信号の量を測定します。スキャンが完了したら、生の2D TIFF画像を集録コンピュータからファイルサーバーに転送し、データ処理に使用するコンピュータにエクスポートします。次に、画像をパーセント伝送スケールに変換する必要があります。

Beamline 8.3 0.2には、無料でダウンロードできるソフトウェアパッケージと一緒にダウンロードして使用できるカスタム背景正規化プラグインがあります。画像Jまたはフィジーは、正規化された画像をoctopusソフトウェアパッケージにロードし、指定された処理手順を使用して2D生TIFF画像ファイルから3Dデータセットを再構築します。次に、画像のスタックをさまざまなソフトウェアパッケージの1つで視覚化できます。

ここでは、avisoソフトウェアパッケージが使用され、システムメモリにデータセットをロードし、仮想横方向、縦方向、または放射状のスライス向きでサンプルを表示します データセットの3D属性により、サンプルを通る仮想スライスは、関心のある領域に合わせて任意の平面で回転させることができます。セグメンテーションが完了すると、ターゲットプラントの構造や、水、空気などの体積、長さ、幅、有無の機能変化を定量化することができます。シンクロトロンHRCTスキャンは、Beamline 8.3 0.2を使用してさまざまな植物組織や種に実装され、これまでにない解像度で植物木部の構造と機能に関する新たな洞察を3Dで提供しました。

ここで見られるように、3D再構成によって提供される視覚化および探索機能により、物品出サンプルと生きている植物の両方で、Xylemネットワークを使用して構造物の位置と向きを正確に決定できます。ここでは、干ばつストレスにさらされ、空気と水で満たされた気管の両方を示すセコイアの茎の3D再構築を見ていきます 一度習得すると、この手順に従って適切に行えば、この手法は数分で実行できます。走査型電子顕微鏡などの他の方法を使用して、プラント内部で見られる構造を検証し、サイズのしきい値を導き出し、それをデータ分析に使用する処理プログラムに供給することができます。