Name: プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶ高分解能X線CTを用いた植物の脈管構造と機能の三次元可視化法。シンクロトロン光源による非破壊イメージングで、キレン網の詳細な構造解析と生理学的理解を深めます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、S Castorani、AJユースティス、ジョージアガンベッタ、CM Manuck、Z Nasafi、とZedanに感謝したいと思います。この仕事はによって資金を供給された：農業·農業研究サービス現在の研究情報システムの資金、米国エネルギー省（研究プロジェクトなし5306-21220-004-00、高度な光源は、Director、科学局、基本のOfficeでサポートされています。エネルギー科学、契約番号DE-AC02-05CH11231下、米国エネルギー省の）;。とNIFA特殊作物研究イニシアティブ助成AJMへ。

以下に記述されているプロトコルの詳細は高度な光源8.3.2ビームラインでの仕事のために特別に書かれたものです。適応は、他の放射光施設での仕事のために必要となる場合があります。適切な安全性と放射線のトレーニングは、これらの施設を使用するために必要です。 1。生きている植物のためのサンプル調製<ol><li> 〜直径10cmの鉢に植物を育てると、主茎（またはスキャンされる植物の部分）のように縦にポットの可能性と志向で中央に配置されていることを確認します。高度な光源の限界でHRCT楽器ハッチの物理的な寸法は、高さ約1mに植物を生きています。結果として、生きている植物のイメージングが最高の小さなポットで栽培苗/苗木上で実行されます。実験に応じて、さまざまな土壌タイプ（干ばつ実験などで）土壌水分量を制御するために使用することができ、柔軟なシュートを持ついくつかの植物（ 例えばブドウ）のために長いシュートは慎重tuのことができます後述のアクリルチューブにcked（ 図1および図2を参照）。 </li><li>カスタムメイドの剛性アルミポットホルダーでライブ鉢植えをマウントします。天板高さは鉢の高さの範囲に対応するように調整することができます。プレートの上部は、土壌表面の上部に合わせ、2つの部分の板の中心からの植物が突出するように設計されている。ポットホルダーの目的は、植物の茎、振動やサンプルモーションを最小限にするために所定の位置にしっかりと保持されていることを確認することです。スキャン中にサンプルモーションを最小にすることが不可欠です。 </li><li>いったんホルダーに取り付けられた、事前スキャンに対する植物の生理状態を決定するために、それぞれScholanderスタイル圧力室またはクリップオンリーフポロメーターを用いて幹の水ポテンシャルや葉の蒸散を測定します。 </li><li>植物の上やアルミニウム工場ホルダーの上に薄い壁のアクリルシリンダーを置き、安定させるために粘土パテで固定しサンプル（ 図2）。上部の葉のいずれかの振動や動きは幹を下に伝達され、スキャンされたエリア内の植物組織は、最終​​的に画像の歪みにつながる、移動させることになります。シリンダーは、植物の葉が含まれていると、スキャン時の振動をもたらすハッチ内の他の機器擦れ植物の葉を防ぐために使用されます。追加のプラスチックラップ、ペーパータオル、テープがさらに植物の部分（ 図4のサンプルの動きに関連する問題を参照してください）の振動や動きを最小限にするために使用されるべきである。その機能を実行するために十分な剛性を維持しつつ、そのX線吸収を（与えられた露光時の画質を低下させることができる）を減少させるために、含まれているシリンダーは、できるだけ薄い壁を有している必要があります。 </li><li>エアベアリングステージにカスタムポットホルダーを取り付け、X線源とイメージングセンサとカメラ機器との間で所定の位置に（ネジ）をロックします。 Positiサンプルを確保するために、磁気チャックベースで可能と中心として垂直などの幹に回転する間に視野内に留まります。 </li></ol> 2。フレッシュ切り出し、植物組織のためのサンプル調製<ol><li>新鮮な植物材料、一般的に茎や葉柄、生植物から即時に除去した後にスキャンすることができます。実験の目的は、木部ネットワーク全体を可視化することである場合には、血管内の水が空気と排気し、交換する必要があります。これを行うには、Scholanderスタイル圧力室に試料をマウントして、約5分間、低圧（&lt;0.05メガパスカル）で試料を通る圧縮空気または窒素を押してください。種は、血管網を避難させるために必要な時間が異なります。意図は、新鮮な植物組織における塞栓形成の程度を評価し、新鮮なカミソリの刃を用いて植物から次に消費税サンプルと水中で切り傷を作ることである場合。 </li><li> PRにパラフィルムの層でサンプルを包むスキャン中にイベントの乾燥。 </li><li>エアベアリングステージにねじ込まれている金属板に固定し、ドリルチャックに試料をマウントします。中央と東洋は、垂直などのサンプルを確保するために、上記のサンプルでは、​​視野の中に残っています。 </li></ol> 3。干し木質組織のためのサンプル調製<ol><li>最適な組織試料の可視化と画像コントラストのために、それは徐々に全体の木質組織試料を脱水する必要がある。長さは約6cmにサンプルをカットします。ターゲットとスキャン領域で可能な限りまっすぐにされているサンプルを選択し、≤1cmの直径を有する。 </li><li>徐々に組織の任意の亀裂や分裂を引き起こすことなく、サンプルを乾燥させるために低温で乾燥オーブンに木質組織サンプルを入れます。このプロセスは、種や組織間で異なる可能性があります。木質茎については、40℃のオーブン中で12時間は、通常、かなりの茶を発生させることなく、優れたコントラストを提供するのに十分であるステムの物理的な構造でNGES（ 図3で示した急速乾燥の問題を参照してください）。 </li><li>いくつかの状況では、走査型電子顕微鏡を使って後続の解剖と視覚化はHRCT画像内の特定のポイントに配向させることができるようなサンプル内の受託者マーカーを有することが望ましい。これを行うには、接辞金属やガラスビーズまたはパラフィルムを用いて幹の外側にワイヤー。もう一つの方法は、（Brodersen ら 2010年の例を参照）は、単一の木部導管に注入することができるシリコーン樹脂（ 例えば 、RTV-141、ブルースターシリコーン、イーストブランズウィック、ニュージャージー州）を使用することです。一度硬化し、シリコーン樹脂は、試料中にはっきりと見えて簡単に他の空気で満たされた容器とは区別される。正確にサンプルの特定の領域を見つけるには、このマーカーを使用します。 </li><li>上記のようにドリルチャックとセンター内のサンプルをマウントします。 </li></ol> 4。リーフTissuのためのサンプル調製2次元（2D）X線写真のためのe <ol><li>ほぼリアルタイムで葉における容器の内容を可視化するために、葉は歯科用X線に似た2D X線像を生成するためにスキャンすることができます。薄いアクリルプラスチックの2枚の間に葉をマウントして、クリップで端を固定します。その後、光学ブレッドボードは、イメージングシステムとX線源の隣にポストホルダシステムと位置に取り付けられたサンプルを添付。 </li></ol> 5。 8.3.2ハッチで試料を走査<ol><li>あなたのアプリケーションのために最善に動作する倍率を決定します。 ALSのビームライン8.3.2 2倍、5倍、10倍との倍率のレンズを使用してスキャンする機能があります。それぞれ画像の画素の大きさ4.5、2.25、0.9μmの中でこれらの結果。視野が増加倍率で減少すると倍率に応じて、サンプルは、適切なサイズでなければなりません。カメラとレンズの選択の詳細は、 表1に得られた画像パラメータを参照してください。</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000（4008x2672） </td><td colspan="2"> PCO.Edge（2560x2160）（OPTIQUEピーター） </td></tr><tr><td> レンズ </td><td> ピクセル（μm）と </td><td> 視野（mm）の </td><td> ピクセル（μm）と </td><td> 視野（mm）の </td></tr><tr><td> 10倍</td><td> 0.9 </td><td> 3.6 </td><td> 0.65（0.69） </td><td> 1.7（1.7） </td></tr><tr><td> （4x）の5倍</td><td> 1.8 </td><td> 7.2 </td><td> 1.3（1.72） </td><td> 3.3（4.4） </td></tr><tr><td> 2倍</td><td> 4.5 </td><td> 18 </td><td> 3.25（3.44） </td><td> 8.3（8.8） </td></tr><tr><td> 1X </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6.5（ - ） </td><td> 16.6（ - ） </td></tr></tbody></table> 表1。4964908詳細ALSは8.3.2でカメラやレンズ。 <ol start="2"><li> X線エネルギーは15 keVで設定します。これは、（Brodersen ら 2010、2011、2012A、B参照）、ほとんどの植物のアプリケーションのための優れた画像のコントラストを提供することが示されている。露光時間は、一般的に100〜1,000ミリ秒の間の範囲の試料の厚さと密度（したがって倍率が使用される）に依存しています。長い露出時間（限り、検出器の画素が飽和していないとして）は、一般的に対ノイズ比が高い信号につながるが、増加したスキャン時間を犠牲にします。 </li><li>アプリケーションに適した角度の増分を選択してください。サンプルは、スキャン中に180°回転し、回転中に撮影した画像の数は、データセットのサイズ、スキャン間隔の長さと、最終的な画質に大きく影響することがありますが、一般的に品質の戻りが減少している。典型的なスキャンはスキャンごとに721の画像が得られ、0.25°単位で行われます。 incremenを下げる細かい詳細を可視化するためのより良いイメージで0.125°結果にトンが、こうして収穫1440の画像、より大きなデータセット（関心のある一般的な地域のために、この手段〜データの10〜30ギガバイト対5ギガバイト）。しかし、信号対雑音比は、しばしば改善され、増加したスキャン時間とデータサイズの両方の価値がある。スキャン中に変形/縮小しにくいドライ茎を損なうことなく、より長い間隔（小さい角度インクリメント）に供することができる。生物学的プロセス（ 例えば、塞栓修理）短いスキャン間隔を選ぶ、短い時間スケールで起こる画像の生きている植物は、この上のX線放射の潜在的な有害な影響を制限する方が好ましい場合、組織が ​​、これは潜在的な損失に来る画質。短いスキャン間隔は、画像がキャプチャされながら、試料を連続的に回転している間、連続断層撮影の設定を使用して達成することができる。 </li><li>スキャンごとに、 &quot;明視野&quot;と &quot;ダークフィールド&quot;の画像はcorrecteでなければなりませんD。明視野画像は、ビーム内のサンプルの無いイメージです。これらは多くの場合、水平方向のサンプルを変換することにより、サンプルのスキャンの前と後に収集されます。ダークフィールドが、これはシャッターカメラがないX線を示している信号の量を測定したX線閉鎖によって収集されます。 </li></ol> 6。データ処理<ol><li>収集コンピュータからファイルサーバーに、データ処理用コンピュータに輸出された &quot;生&quot;の2D。TIF画像を転送。コンピュータに十分なRAMがある場合、データは、いわゆる &quot;RAMドライブ&quot;（RAMの一部は、コンピュータ上のハードドライブとして表示されます）にコピーすることができます。このようにソフトウェアは、ソリッド·ステート·ドライブまたはフラッシュメモリに比べて比較的遅い回転のハードディスクドライブにアクセスする必要はありません。このステップでは、大幅にデータセットを処理するのに必要な時間の量を減らします。 </li><li>画像は、透過率のスケールに変換する必要があります。ビームライン8.3.2カスタムBAを持っているckground正規化プラグインは自由に利用可能なソフトウェアパッケージはImageJまたはフィジー（でダウンロードして使用することができ<a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ）。これは、画像からダークカウントを減算し、透過率を示す画像を生成するために明るいフィールドで、サンプル画像を正規化します。タコのソフトウェアパッケージ（に正規化されたイメージをロード<a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> ）と指定された処理の手順を実行します（画像を正規化、リングの取り外し使用して、2D生。TIFファイルから3Dデータセットを&quot;再構築&quot; 、サイノグラムの作成、パラレルビーム再構成）。このプロセスは、その後。TIFを横（断面） &quot;ボクセル&quot;（体積画素要素）、X線線吸収係数を表すx、y、z座標と強度値を使用して各成る一連の画像が得られます。 </li></ol> 7。可視化<ol><li> Visualiソフトウェア·パッケージの様々な1の画像のスタックをzeを。フリーウェア（ 例えば Drishti、 <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtmlは</a> ）ボリュームまたは個々の、または画像のスタック（ 例えば ImageJのか、フィジー）を可視化するために使用することができます。他のソフトウェアパッケージは、3Dビジュアライゼーションに使用することができます。我々の研究グループでは、Avizoソフトウェアパッケージ（使用<a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overviewを</a> ）が、そのようなアミラ（などの他<a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> ）とVGStudioMax（ <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">のhttp://www。 volumegraphics.com /が</a> ）も一般的に使用されます。 </li><li>システムメモリにデータセットをロードし、仮想縦横、またはラジアルスライスの向きでサンプルを表示します。なぜなら、データセットの3D属性、samplを通じて仮想スライスeは、関心領域、従来のシリアル光顕微鏡（詳細な例については、1から3作品を参照）を超える大幅な改善と整合する任意の平面で回転させることができます。 </li><li> 3Dで必要に応じてサンプルを視覚化するために、 &quot;セグメント&quot;周囲の組織から血管内腔または他の構造を分離するためにAvizoで半自動とマニュアルした様々なルーチンを使用したサンプル。セグメンテーションは、このように別々の領域にそれらを分離またはセグメント化、興味のあるオブジェクト間の境界を定義することを指します。 3Dのレンダリングのボリュームが可視化ソフトウェアによって実行されます。排出量と吸収量と色は &quot;カラーマップ&quot;を使用して定義することができ、与えられた方向における投影結果であり、これを行う一つの方法は、ボリューム内の各ポイントが発すると光吸収するものと想定されている直接ボリュームレンダリングであり、画面に表示される。あるいは、セグメント化された境界を表すワイヤーフレームまたは3Dメッシュ面はトンの3Dモデルを表示するように構成されている興味のある彼は、構造。 3Dメッシュ、ポリゴンの要素で構成され、要素の総数は、構造再現の忠実度と関連するデータ·ファイルのサイズ（複数の要素、 すなわち 、より高い忠実度が、より大きなファイルサイズにつながる）の両方に影響を与えます。画像処理モジュールは、さまざまな可視化ボリュームレンダリング出力を制御するためのソフトウェアと同様に、画像の明るさ、コントラスト、透明度、ノイズリダクションなどのコントロールで使用可能である、 </li></ol> 8。定量化<ol><li>セグメンテーションが達成されたら、それは例えば、水、空気などのボリューム、長さ、幅、存在下または非存在下で標的植物構造や機能的変化を定量化することが可能である、Brodersen ら （2010）は、定量化するAvizoソフトウェアを使用人づて詰め替え容器内の水滴の体積変化。植物はラ時間を作る四から八時間を超える30分ごとにスキャンされた詰め替え容器のPSEのシーケンス。各スキャンはそのボリュームが増加するにつれて、個々の液滴を経時的に測定したAvizoへと再構築され、ロードされました。 </li></ol>

<ol><li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem%3A+in+vivo+visualizations+using+high+resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).</li>
<li>Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+3D+xylem+networks+using+high+resolution+computed+tomography+%28HRCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT).</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li>
<li>Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+implications+of+primary+xylem+organization+in+two+ferns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">The physiological implications of primary xylem organization in two ferns.</a> Plant, Cell & Environment. , (2012).</li>
<li>Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrodersen%2C+C+%22American+Journal+of+Botany%22">American Journal of Botany</a>. , In Press (2012).</li>
<li>McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+disruption+and+passive+migration+by+a+bacterial+pathogen+in+oak+tree+xylem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem.</a> Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).</li>
<li>McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylene-induced+tyloses+in+canopy+hydraulic+failure+of+mature+walnut+trees+afflicted+with+apoplexy+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder.</a> Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).</li>
<li>Tyree, M., Sperry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulnerability+of+xylem+to+cavitation+and+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Vulnerability of xylem to cavitation and embolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).</li>
<li>Tyree, M., Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTyree%2C+M+%22Xylem+structure+and+the+ascent+of+sap%22">Xylem structure and the ascent of sap</a>. , Springer Verlag. Berlin. (2002).</li>
<li>Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolbrook%2C+NM+%22Vascular+Transport+in+Plants%22">Vascular Transport in Plants</a>. , Elsevier. Amsterdam. (2005).</li>
<li>Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+3D+imaging+of+wood+and+plant+microstructure+using+high-resolution+x-ray+phase-contrast+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography.</a> Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).</li>
<li>Mannes, D., Marone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+areas+of+synchrotron+radiation+tomographic+microscopy+for+wood+research%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research.</a> Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).</li>
<li>Maeda, E., Miyake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-destructive+tracing+with+an+x-ray+micro+ct+scanner+of+vascular+bundles+in+the+ear+axes+at+the+base+of+the+lower+level+rachis-branches+in+japonica+type+rice+%28oryza+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Crop+Science%22%5BJournal%5D)">A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa.</a> Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).</li>
<li>Steppe, K., Cnudde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+x-ray+computed+microtomography+for+non-invasive+determination+of+wood+anatomical+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics.</a> Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).</li>
<li>Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZimmermann%2C+M+%22Encyclopaedia+Cinematographica%22">Encyclopaedia Cinematographica</a>. , Institut für den Wissenschaftlichen Film. Gottingen, Germany. (1971).</li>
<li>Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+HRCT-derived+xylem+network+reveals+reverse+flow+in+some+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels.</a> , In review (2013).</li>
<li>McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+plant+survival+and+mortality+during+drought%3A+why+do+some+plants+survive+while+others+succumb%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb.</a> New Phytologist. 178, 719-739 (2008).</li>
<li>McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifuge+technique+consistently+overestimates+vulnerability+to+water-stress+induced+cavitation+in+grapevines+as+confirmed+with+high+resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography.</a> New Phytologist. , (2012).</li>
<li>Lee, K., Avondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene+expression+in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li>
<li>Truernit, E., Bauby, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).</li>
<li>Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).</li>
<li>Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+platform+for+automatic+phenotyping+and+trait+ranking+of+plant+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems.</a> , (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

Synchotron HRCTは信じられないほど詳細に植物脈管構造の内部の仕組みを探求するための強力な、非破壊ツールで植物学者が用意されています。この接続性が大幅に広がる血管の病原体や塞栓の能力を変えることができる-この技術は差動で、様々なブドウの種（。マスコミでBrodersen ら 2012b）に木部のネットワーク接続を変更するブドウの木部に以前に記述されていない解剖学的構造を識別するために、最近使用された非破壊木部ネットワーク全体に。生きている植物の最初の成功のスキャンも塞栓症の広がりや修復（Brodersen ら 2010; McElrone ら 2012新作Phytologist 196（3）:661-665）のような動的プロセスの微細スケールの詳細を明らかにしている、との役割を巻き込むのを助けALS 8.3.2でHRCTにより提供塞栓空間分解能を修復する特定の生きている細胞の種類は、これが可能になりました。これらのプロセスと他のASPEに関する仕様木部ネットワークのCTSは依然としてとらえどころ-HRCTは、おそらく他の高解像度技術（ 例えば<...

相互接続された導管は、繊維、生活、代謝活性を有する細胞のネットワーク - 水は植物の根から木部と呼ばれる血管組織内の葉に輸送される。植物の木部の輸​​送機能は、光合成、成長し、最終的には生存のために葉に栄養分と水を供給するために維持されなければならない。木部ネットワークが病原性微生物によって感染されるとき木部導管内の水輸送が停止することがあります。このような感染症の植物への応答であることが多い（; 2010 例えば McElroneら2008）病原体の広がりを単離するための手段として、ゲル剤、ガム、およびチロースを生成します。干ばつストレスも木部の水輸送を制限することができます。植物が長引く​​干ばつ時の水を失うように、緊張が木部樹液で構築されています。緊張下に水が（ すなわち 、特定のしきい値にテンションが木部導管体に含まれる水分の列をキャビテーションのに十分大きくなる）準安定である。キャビテーションが発生した後、気泡（塞栓症）は、condを形成し、埋めることができますUIT、効果的にブロックして水の動き（タイリーとスペリー1989）、深海ダイバーにおける減圧症（ すなわち、 &quot;曲がる&quot;）に類似現象。 このトピックに関する歴史と現代文学（タイリー·ツィンマーマン、2002;ホルブルックら 、2005）の広大なボディにより実証されるように最適な植物関数の木部水輸送の重要性にもかかわらず、とらえどころのないまま木部ネットワークの局面がまだあります。いくつかの研究グループは、最近、細かい木材解剖学の詳細や血管組織（ 例えばメイヨーらを評価するために高分解能X線CTマイクロトモグラフィー（HRCT）を利用し始めて、2010年、2008;マネスら2010;。Brodersenら2010。 、2011、2012A、B;前田、三宅、2009;草原ら、2004）。 HRCTはソリッドオブジェクトの内部の特徴を可視化し、その3次元構造特性に関するデジタル情報を取得するために使用される非破壊法である。 HRCTでも高密度オブジェクトに対して、サイ​​ズがミクロンのような小さな細部を解決する能力に従来の医療のCATスキャンとは異なります。シンクロトロンHRCT技術における最近の進歩は、充分に植物の血管網とintervessel接続が可視化できること対雑音比が改善された画像の解像度と信号があり、割り当てられた3次元座標、油圧モデルシミュレーションのためにエクスポート。 Brodersen ら （2011）は最近、自動的に従来の解剖学的方法（シリアルすなわちミクロトームで切片とこれまで可能であったよりもはるかに高い解像度で木部ネットワークからデータを抽出し、FortranのモデルとシンクロHRCTによって生成された3D再構成を組み合わせることで、このテクニックを進め光学顕微鏡で、画像キャプチャ、 例えばツィンマーマン1971）。この作品はまた、いくつかのVeの木部システムの油圧モデルと輸送の特定された固有の特性（ すなわち、逆の流れを最適化するために使用されているピーク蒸散の期間中ssels）（Lee ら 、レビューで）。 シンクロトロンHRCTは現在木部機能、キャビテーションに対する感受性、および塞栓導管を修復する植物の能力を視覚化するために使用することができます。塞栓導管内の再確立の流れに障害が発生すると、油圧能力、限界の光合成、極端な場合には植物の死の結果（マクダウェルら 2008）が軽減されます。植物は、隣接する機能導管を介して接続するピットの閉塞の周りの水を流用して、失われた油圧能力に代わる新しい木部を成長させることにより塞栓に対処することができます。いくつかの植物は水の列の切れ目を修復する能力を持っているが、緊張下の木部のこのプロセスの詳細は、何十年も不明であった。 Brodersen ら （2010）は最近、可視化とHRCTを使用してライブブドウの補充プロセスを定量化した。詰め替え成功した容器は、キシルを取り巻く生細胞からの水の流入に依存していたemの個々の水滴が時間の経過とともに拡大導管、いっぱい血管、閉じ込められた気体の溶解を余儀なくされた。さまざまな植物の能力が損なわ木部血管を修復すると、これらの修理を制御するメカニズムは、現在検討されている。 ALSのビームライン8.3.2施設の説明これまでの我々の仕事は、ローレンス·バークレー国立研究所（バークレー米国カリフォルニア州）での高度な光源で硬X線マイクロトモグラフィービームライン8.3.2で行われている。植物試料は11.5 keVの重要なエネルギーで高度な光源電子蓄積リングの運転中に双極子6テスラ超電導曲げ磁石によって生成され、X線源から20メートルの場所に位置し、鉛ライニングハッチ内に配置されます。エンドステーションの概略を図1に示します。 X線は40倍のビームサイズ〜4.6ミリメートルとハッチを入力し、電動回転ステージ上に載置された試料を通過します。ザ透過したX線画像収集用のCCDにレンズを介して中継される可視光にX線を変換結晶シンチレータ（一般的に使用される2つの材料がLuAGまたはCdWO 4アール ）に衝突。カメラ、シンチレータと光学系は、サンプル·ツー·シンチレータ距離が位相コントラストイメージングのために最適化することができますレールの上で光タイトボックスに含まれています。 すべてのサンプルは、順番に、試料の位置決めのための水平方向および垂直方向の変換ステージに搭載されている直径10cm回転ステージ上に搭載されている。カスタム構築された植物のポットホルダー、アクリル管に含まれる葉に搭載された根系を持つ生きた植物試料は、 図2で見ることができます。典型的な露光時間は、秒10から18 keVの使って0.1から1の範囲で指定でき、スキャンの持続時間は、特定のサンプルのために最適化した設定に応じて5から40分の範囲であろう。背の高いサンプル（植物の木部·ネットワークの典型的な例）、データスキャンができるため〜10cmの最大試料高さに沿ってシームレスな連続切片を可能にする、自動制御され、異なる高さでのサンプルで測定を繰り返すことで、タイル張り。 4.5μmの分解能でイメージングは​​、縦向きでほぼ完璧なサンプルについて〜1cmで最大サンプル幅。データの生成と処理は、以下に記載されているプロトコルを使用して完了します。なぜなら空気と水の間のX線減衰の違いのため、優れた画像コントラストは医療用CTシステムの典型的なコントラストのソリューションを使用せずに植物を得ることができる。空気で満たされた血管内腔は、水和した植物の周囲の水で満たされた組織から容易に区別される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Advanced Light Source beamline 8.3.2の設備については、上記の詳細を参照してください</td></tr></tbody></table>。

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能ctを用いた

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

高分解能X線CT（HRCT）が（ 例えば Brodersen ら三次元（3D）で植物の木部ネットワークの構造と機能を評価するために使用されているサブミクロンの分解能を持つ非破壊画像診断法である、2010年、2011年、2012A、B）。 HRCTイメージングは​​医療用CTシステムと同じ原理に基づいていますが、より高い空間分解能で高輝度シンクロトロンX線源の結果と画像取得時間を減少させる。ここでは、Avizoソフトウェアとの組み合わせでHRCT（アドバンスト光源 - LBNLバークレー、カリフォルニア州、米国で実施）（VSG社、バーリントン、マサチューセッツ州、米国）が中の植物の木部を探索するためにどのくらい使われているシンクロトロンベースで詳細に実証切除した組織と生きた植物。この新しいイメージングツールは、ユーザーが従来の静的、2D光または任意の平面で仮想シリアルセクションを使用して電子顕微鏡写真および研究サンプルを越えて移動することができます。任意の方向cのスライスの数が無限同じサンプル、伝統的な顕微鏡法を用いて物理的に不可能である機能で行うこと。 結果はHRCTは草本と木本植物種、植物器官の範囲（ すなわち 、葉、葉柄、茎、幹、根）の両方に適用することができることを実証している。数値は代表プラント血管解剖や海岸レッドウッド（ セコイア ）、くるみ（ クルミ属属）、オーク（ コナラ属のもの）、メープルのためにスキャンを含むHRCTデータセットから抽出された細部の型の範囲の両方を実証する手助けここに提示され（ エイサー属）ヒマワリ（ ヒマワリ ）、ブドウ（ ヴィティス属）、シダ（ ワラビとコモチシダ属fimbriata）への苗木。木本種から摘出し、乾燥させたサンプルは、スキャンして、一般的に最良の画像を得ることが最も簡単である。しかし、最近の改善は（ つまり、より迅速なスキャンとサンプルの安定）それはPOSS作った緑色組織（ 例えば葉柄）にと生きた植物では、この可視化技術を使用してible。機会に水和した緑の植物組織のいくつかの収縮は画像がぼやけてしまいますと、これらの問題を回避するための方法が記載されている。 HRCTでこれらの最近の進歩は、プラント血管機能に有望な新しい洞察を提​​供します。

Synchotron HRCTスキャンが正常にビームライン8.3.2（ 図5）を用いて植物組織や種の多種多様な上に実装されており、3Dで前例のない解像度で植物の木部の構造と機能に新たな洞察を提供してきました。 3D再構成（、 図6-8に示す、そして作品1-3）が提供する可視化と探査能力は両方摘出試料上と生きた植物における木部ネットワークとの構造の位置と方向の正確な測定を可能にします。 いくつかの状況では、サンプルの動きや意図しない振動が使えなくスキャン（ 例えば 図4）レンダリング、最終的な画像の歪みを引き起こしているが、スキャン時間を短縮するための改良が（連続断層撮影で）ので、このようなデータの損失の有害な影響を最小化している多くの以上のスキャンは、現在限られたビームタイムで完了することができます各ユーザーに割り当てられた。これらのより短いスキャン時間も塞栓症の広がりや修理などのプロセスのダイナミクスをキャプチャするための時間...

高分解能X線CT（HRCT）が3Dで植物の血管系の構造と機能を研究するために使用することができる非破壊画像診断法である。我々は、HRCTは植物組織や種の広い範囲にわたって木部ネットワークの探索を容易にする方法を示しています。

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

この手順の全体的な目標は、シンクロトロンベースのX線マイクロトモグラフィー技術を利用して、植物の血管輸送の構造と機能を調査することです。これは、最初にチャックホルダーまたは生きた植物ホルダーに取り付けるサンプルを準備し、スキャンする部分ができるだけ垂直であることを確認し、必要な予備的な生理学的測定を行うことによって達成されます。第2ステップは、調製した試料または生きた植物をA LSビームライン8.3 0.2ハッチにセットし、スキャンのためにハッチを固定することです。次に。サンプルが適切に配置された後、スキャンが開始されます。最後のステップは、ワークステーションコンピュータを使用してスキャンの品質を正規化、再構築、および評価してから、データをVISOに渡して3D視覚化プロセスを行うことです。最終的に、X線マイクロトモグラフィーを使用して、植物の水伝導性血管系の相互接続と機能状態の詳細を明らかにします。この手法は、連続切片作製や光学顕微鏡などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、植物組織を前例のない解像度で任意の方向で探索できることです。この方法は、植物の水輸送の基本的な側面から干ばつ、凍結耐性、病原体が宿主植物内でどのように移動するかまで、植物生物学の分野における重要な問題を理解するのに役立ちます。このプロトコルは、前述のように、高度な光源での作業用に設計されています。8.3 0.2.他のシンクロトロン施設での作業には、ビームラインの適応が必要となる場合があります。これらの施設の使用に必要な安全および放射線トレーニングに従って、生きた植物のサンプル調製を開始してください。まず、直径約10センチメートルの鉢で植物を育て、スキャンする植物の主茎またはその他の部分ができるだけ中央に配置され、鉢に垂直に向けられるようにします。HRCT装置ハッチの物理的寸法は、生きている植物の高さを約1メートルに制限しています。そのため、生きた植物のイメージングは、苗木や苗木で行うのが最適です。小さな鉢で育てられたものは、カスタムメイドの硬質アルミ製ポットホルダーを使用して、生きた鉢植えの植物を取り付けます。トッププレートの高さは、さまざまなポットの高さに対応するように調整する必要があります。ここでは、プレートの上部が土壌表面の上部と揃うように設計されており、植物は2つの部分からなるプレートの中心から突き出ています。ホルダーに取り付けたら、SHOランダースタイルの圧力チャンバーまたはクリップオンリーフパラメータを使用して茎の水電位を測定し、スキャンする前に植物の生理学的状態を判断します。茎の周りに銅線の小片をねじって受託者として機能し、繰り返しスキャンされる植物のスキャン位置が一貫していることを確認します。次に、アルミニウムプラントホルダーの上の植物の上に薄い壁のアクリルシリンダーを置き、ネジで所定の位置に固定してサンプルを安定させます。画像の歪みの原因となる植物部分の振動や動きをさらに最小限に抑えるために、追加のラップペーパータオルとテープを使用する必要があります。カスタムポットホルダーをエアベアリングステージに取り付け、X線源とイメージングセンサーおよびカメラ機器の間にある位置にロックします。ステムをできるだけ垂直に配置し、サンプルを磁気チャックベースの中央に配置して、視野内に留まるようにしてください 回転中、新鮮な植物材料、通常は茎やペットは、生きた植物からすぐに取り除いた後にスキャンできます。実験の目的が木部ネットワーク全体を視覚化することである場合、まず血管内の水を排気し、空気に置き換える必要があります。これを行うには、サンプルを中傷スタイルの圧力チャンバーに取り付け、圧縮空気または窒素を低圧で約5分間サンプルに押し込みます。船舶ネットワークからの避難に必要な時間は種によって異なります。意図が新鮮な植物組織における塞栓症形成の程度を評価することである場合、新鮮なかみそりの刃を使用して植物からサンプルを採取し、水中で切り込みを入れます。次に、スキャン中の乾燥を防ぐためにサンプルをパラフォームの層で包み、エアベアリングステージの中央にねじ込まれた金属プレートに固定されたドリルチャックにサンプルを取り付け、サンプルが視野内に留まるように、前述のようにサンプルを垂直に向けます。乾燥した木質組織からサンプルを調製するには、まずサンプルを約6cmの長さにカットします。ターゲットスキャン領域内でできるだけまっすぐで、直径が約1cmのサンプルを選択します。次のステップは、サンプル全体をゆっくりと脱水して、最適な組織サンプルの視覚化と画像のコントラストを確保することです。木質組織サンプルを低温の乾燥オーブンに入れて、組織の亀裂や裂け目を引き起こさずにサンプルをゆっくりと乾燥させます。状況によっては、サンプルに受託マーカーを添付することが望ましい場合があります。これにより、走査型電子顕微鏡を用いたその後の解剖と可視化をHRCT画像の特定の点に向けることができます。これを行うには、パルファムを使用して金属またはガラスのビーズまたはワイヤーをステムの外側に貼り付けます。最後に、スキャンする前に、サンプルをドリルチェックに取り付け、上記のように中央に配置します。アプリケーションに最適な倍率を決定します。ここで使用するA LSビームライン8.3 0.2は、倍率2倍×5倍および倍率10倍で走査できる機能を備えています。X線のエネルギーを15キロ電子ボルトに設定します。露光時間は、通常、サンプルの厚さと密度に依存し、100〜1000ミリ秒の範囲です。アプリケーションに適した角度増分を選択します。スキャン中にサンプルは180度回転し、回転中に撮影される画像の数は、データセットのサイズ、スキャン間隔の長さ、および最終的な画像品質に大きな影響を与える可能性があります。一般的なスキャンは0.25度刻みで実行され、スキャンごとに513枚の画像が得られます。スキャン間隔を短くするには、スキャンごとに画像がキャプチャされている間、サンプルが連続的に回転する連続断層撮影設定を使用して、明視野および暗視野画像も収集する必要があります。明視野画像は、ビーム内にサンプルがない画像です。これらは、多くの場合、サンプルのスキャンの前後にサンプルを水平に並進することによって収集されます。暗視野は、X線シャッターを閉じることで収集されます。これは、X線なしでカメラが表示する信号の量を測定します。スキャンが完了したら、生の2D TIFF画像を集録コンピュータからファイルサーバーに転送し、データ処理に使用するコンピュータにエクスポートします。次に、画像をパーセント伝送スケールに変換する必要があります。Beamline 8.3 0.2には、無料でダウンロードできるソフトウェアパッケージと一緒にダウンロードして使用できるカスタム背景正規化プラグインがあります。画像Jまたはフィジーは、正規化された画像をoctopusソフトウェアパッケージにロードし、指定された処理手順を使用して2D生TIFF画像ファイルから3Dデータセットを再構築します。次に、画像のスタックをさまざまなソフトウェアパッケージの1つで視覚化できます。ここでは、avisoソフトウェアパッケージが使用され、システムメモリにデータセットをロードし、仮想横方向、縦方向、または放射状のスライス向きでサンプルを表示します データセットの3D属性により、サンプルを通る仮想スライスは、関心のある領域に合わせて任意の平面で回転させることができます。セグメンテーションが完了すると、ターゲットプラントの構造や、水、空気などの体積、長さ、幅、有無の機能変化を定量化することができます。シンクロトロンHRCTスキャンは、Beamline 8.3 0.2を使用してさまざまな植物組織や種に実装され、これまでにない解像度で植物木部の構造と機能に関する新たな洞察を3Dで提供しました。ここで見られるように、3D再構成によって提供される視覚化および探索機能により、物品出サンプルと生きている植物の両方で、Xylemネットワークを使用して構造物の位置と向きを正確に決定できます。ここでは、干ばつストレスにさらされ、空気と水で満たされた気管の両方を示すセコイアの茎の3D再構築を見ていきます 一度習得すると、この手順に従って適切に行えば、この手法は数分で実行できます。走査型電子顕微鏡などの他の方法を使用して、プラント内部で見られる構造を検証し、サイズのしきい値を導き出し、それをデータ分析に使用する処理プログラムに供給することができます。

using-high-resolution-computed-tomography-to-visualize-three

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

microCTによる造影小動物の血管イメージングは​​、シリアルのための迅速かつコスト効率と高スループットのテクニックです...

MicroCTを使用して造影血管イメージング

冠状血管の可視化は、心血管疾患の我々の理解を進めることが重要です。ここでは、マイクロコンピューター断層撮影​​（μCT）イメージングの準備のために、放射線不透過性シリコーンゴム（Microfil）とマウス冠状動脈血管を灌流する方法を説明します。...

マイクロCTイメージングのための準備として、逆行性灌流およびマウスの冠動脈血管系の充填

このプロトコルは、市販のフラットベッドスキャナを使用して、重力刺激に応答するシロイヌナズナ実生の画像を迅速に収集するためのプロセスを説明します。この方法は、下流の分析アルゴリズムのために適した高解像度画像の安価な大容量の捕捉を可能にする。...

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

普通マイクロ断層レントゲン写真撮影スキャンに適したトウモロコシ組織の x 線吸収コントラストを改善する新たな方法を提供します。CT 画像を用いた異材トウモロコシ...

X 線マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいてトウモロコシの維管束のミクロン スケール表現型解析技術

キシレム内の水分布を観察することは、木質植物の水流ダイナミクスに関する重要な情報を提供します。本研究では、サンプル調製時の水位のアーティフィスの変化を排除するクライオスタットとクライオSEMを用いて、キシレム水分布をその中で観察する実践的なアプローチを実証する。...

クライオ走査型電子顕微鏡で可視化された木質植物のキシレム水分布

この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex...

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

ここでは、マイクロX線コンピュータ断層撮影を用いたマウス後肢血管の可視化と定量方法について述べている。...

コンピューター断層撮影ベースの3次元可視化のサンプル調製

マイクロCTは、植物の構造を3次元で解析できる非破壊ツールです。本プロトコルは、寄生植物の構造と機能を分析するためにマイクロCTを活用するためのサンプル調製について説明しています。特定の調製物と組み合わせた場合のこの方法の利点を強調するために、異なる種が使用される。...

マイクロCTスキャンを活用して寄生植物と宿主の相互作用を解析

このプロトコルは、人間の心臓から得られたサンプルを微視的スケールと巨視的スケールで分析するための包括的なパイプラインを提供します。...

ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

ここでは、マウス大動脈を3次元(3D)で画像化するために最適化された組織透明化プロトコルを紹介します。私たちは、アテローム性動脈硬化症プラークを持つ末梢神経系の解剖学的近接性とアテローム性動脈硬化症の到来を定義することを目的として、免疫染色、光学クリアリング、およびイメージングのための最先端の手順を描写します。...

アテローム性動脈硬化症における大動脈組織の三次元イメージング

このプロトコルは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用した定量的なホールマウント3次元血管イメージングの迅速な方法を導入します。この方法の有効性は、ニワトリ胚モデルの咽頭アーチ動脈系を使用して実証され、血行動態の力は計算流体力学 によって...

定量的研究のための小動物血管系の迅速なホールマウント高分解能イメージング

学ぶ高分解能X線CTを用いた植物の脈管構造と機能の三次元可視化法。シンクロトロン光源による非破壊イメージングで、キレン網の詳細な構造解析と生理学的理解を深めます。

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

さらに動画を探す