長指伸筋の筋機能の評価エクスビボと前脛骨筋その場マウスの

この手順の全体的な目的は、マウスの四肢の筋肉の機械的特性を正確に決定することです。これは、exevo 長指伸筋の収縮特性と受動的特性を測定することによって達成されるか、前脛骨筋の収縮特性をその場で測定することにより、最終的には、さまざまな筋肉疾患の生理学的変化と実験的介入が筋肉機能を強化するかどうかをよりよく理解できる結果を得ることができます。この方法は、体の動きに必要な骨格筋の機械的機能の2つの不可分な側面である骨格筋の収縮特性と受動的特性の完全な評価を提供します。

したがって、筋肉解剖手順の視覚的なデモンストレーションは、多くのスキルと操作を必要とするため、非常に重要です。また、NC 2 の大きな筋肉の収縮特性の評価の主な利点は、in vitro SA のような既存の方法と比較して、インスティテュート アプローチが正常な血流と酸素化を妨げないことです。筋肉生理学研究における主要な関心事は、標的筋肉の酸素化です。

TA筋のような大きな筋肉に対するin vitro SAでは、酸素拡散が筋肉の中心に到達しない場合があります。骨格筋の機械的機能の正確な測定は、筋疾患の進行を評価し、新規遺伝子細胞および薬理学的介入の治療効果を決定するためにも使用できるため、この技術の意味は筋疾患の治療にまで及びます。ここに紹介するすべての動物手順は、施設の動物管理誘導委員会によって承認されています。

これは、ex vivo実験のための筋テストシステムを設定するための非生存手術です。まず、オキシチューブをウォータージャケットティッシュバスに固定して、ティッシュバスを組み立てます。組み立てたバスを筋肉取り付け装置に取り付け、ニードルバルブをバスドレナージに配置します。

ガスラインと水循環ラインをバスに接続します。30°Cの水がジャケットチャンバー内を循環し、5PSIのガスが酸素管を流れるようにします。浴にリンガーバッファーを充填し、安定したガス流で平衡化します。

器具の電源を入れ、DMCソフトウェアをロードしてEDL筋動脈を解剖し、麻酔をかけ、マウスを加熱パッドに置きます。後肢を剃り、つま先をつまむことで鎮静を確認します。マウスを解剖ボードに置き、脚の皮膚をはがします。

2つのドレスメーカーのピンを使用して、後肢を足とグラシリス筋に固定します。マウスの上に加熱ランプを置いて、深部体温を摂氏37度に保ち、露出したすべての筋肉を実体顕微鏡で温かいリンガーバッファーと連続的に超融合させ、皮膚を解剖して遠位TA腱と伸筋靭帯を露出させ、TA筋を覆っている筋膜を優しく取り除きます。伸筋靭帯を切断して、遠位TA腱を解放します。

遠位TA腱を切断し、リンガーズバッファーを染み込ませた綿の薄い部分でTA筋を取り除くために使用します。TA筋の血管系の破裂による出血を止めます。次に、パンシルク縫合糸を使用して、二重の正方形の結び目と、EDL筋の遠位筋腱接合部でループノットを結びます。

次に、上腕二頭筋を切開して近位腱を露出させ、近位筋腱接合部で同じ結び目を結びます。同じ縫合線を使用して、二重の正方形の結び目を作ります。レバーアームフックを近位または遠位の結び目に固定します。

後肢からEDL筋をやさしく解剖します。まず、縫合糸の結び目より上の近位腱を切断し、筋肉の下の血管系を切断します。次に、縫合糸の結び目より下の遠位腱を切断します。

露出した後肢を綿を浸したリンガーで覆います。最後に、フックをレバーアームに取り付け、電極間で筋肉を垂直に整列させます。遠位縫合線を固定ポストに固定します。

筋肉をリンガーバッファーに沈め、安静時の張力を1.0グラムに調整します。筋肉が少なくとも10分間平衡化するのを待ちます。EDL筋の収縮特性を測定するには、ここに示されているように、DMCソフトウェアで次の各プロトコルのパラメーターを設定します。

最初のプロトコルでは、150ヘルツで3回刺激し、刺激の間に62回休息を挟んでEDL筋を安定させます。2 番目のプロトコルでは、筋肉を 2 分間リラックスさせてから、さまざまな安静時緊張で EDL 筋を刺激することにより、最適な長さまたは LN を決定します。デジタルキャリパーを使用して、遠位結び目と近位結び目の間の筋肉の最適な長さを測定します。

筋肉を2分間リラックスさせます。プロトコル3では、安静時の張力をLゼロに調整し、1回のトゥイッチ刺激で筋力を測定します。Twitch張力またはpt、ピーク張力またはTPTまでの時間、およびptの半緩和時間を決定します。

筋肉を2分間リラックスさせます。4番目のプロトコルを実行するには、安静時張力をLNに調整し、さまざまな刺激周波数で生成される精巣筋の力を測定します。Muscle Forceが最大タイタニックフォースに達するP NAUGHを測定します。

p naughのピーク張力までの時間と半分の緩和時間を測定します。プロトコル5は、筋肉を5分間リラックスさせ、安静時の張力をL Naughに調整し、サイクル間に2分間の休息を挟んで10サイクルの偏心収縮を適用することから始めます。偏心収縮の各サイクル後のPNの相対的な力損失を計算します。

最後に、EDL筋を装置から切り離し、縫合部位の腱を切断します。筋肉の湿った重量を決定し、筋肉の断面積を計算します。EDL筋の受動的特性を測定するには、前に示したように、反対側のEDL筋を解剖し、それを装置に取り付けます。

このビデオでは、筋肉を10%刻みで160%Lまで緊張させる6ステップのストレッチプロトコルに筋肉をさらします。応力ひずみプロファイルを解析して、EDL筋ストレッチの粘性特性を評価し、筋肉を10%Lゼロに保持し、次の時間枠で応力緩和率を測定します。まず、サーモコントロールされた動物ステージを循環水で摂氏37度に加熱します。

の電源を入れて、DMCソフトウェアをロードします。麻酔をかけたマウスの後肢のTA筋を露出させた後、パンシルク縫合糸を使用して膝蓋骨靭帯の周りに二重の四角い結び目を結びます。次に、二重の正方形の結び目を結び、続いて遠位腱の筋腱接合部またはMTJでループ結び目を結びます。

同じ縫合糸を使用して、約10ミリメートルのループを作ります。動物をうつ伏せに配置し、上腕二頭筋のフェムス筋を露出させます。坐骨神経を露出させ、その近位端に二重の四角い結び目を結びます。

結び目より上の神経を切断し、膝に向かってその長さの約5ミリメートルを慎重に解剖します。神経を伸ばしたり損傷したりしないでください。このビデオで前述したように、対側のta筋を準備し、後肢の1つをリンガーバッファーに浸した綿で覆います。

次に、動物を動物のプラットフォームにうつ伏せに置き、膝ピンの周りの膝蓋骨靭帯縫合線を使用して二重の四角い結び目を結び、膝を固定します。次に、SILガードブロックに足を固定した後、動物用プラットフォームを温度制御ステージに固定し、ヒートランプを動物の中心体温が摂氏37度に維持するように配置します。電極をプラットフォームに取り付けた後、坐骨神経を電極に取り付け、遠位結び目から遠位にある覆われていない後肢のTA腱を切断し、縫合ループをレバーアームフックに取り付けます。

露出した後肢の筋肉を温かいリンガーバッファーに浸した綿で覆い、TA筋の収縮性測定値を記録します。このビデオで前述したDMCソフトウェアのパラメータとプロトコルをEDL筋に使用し、ソフトウェアを使用してデータを分析します。TA筋の測定を行った後、遠位TA腱縫合ループをレバーアームフックから取り外し、示されているように反対側のTA筋の収縮特性を測定します動物を安楽死させた後、TA筋肉を取り外し、それらの湿った重量を決定します。

断面積を計算するために、この表は、生後4〜6か月の正常な黒10マウスとジストロフィン欠損マウスまたはMDXマウスのEDL筋の形態測定特性を示しています。ここに示されているのは、黒色10およびMDXマウスのEDL筋の代表的な収縮特性と受動的特性、これには、Twitch力比の最大タイタニックフォースのピーク張力までの時間、および絶対最大タイタニックフォースの半緩和時間が含まれます。ピーク張力までの時間と半緩和時間も、絶対的なけいれん力から計算できます。

応力ひずみプロファイルと応力緩和率は、EDL筋の受動的特性を説明するために使用されます。ジストロフィンの不在は、EDL筋の収縮特性と受動的特性に大きな影響を与えます。特定のトゥイッチ力とタイタニック号の力は、M-D-X-E-D-L筋肉で大幅に減少します。

例えば、M-D-X-E-D-L筋では、テンションがピークに達するまでの時間が大幅に速くなりますが、半弛緩時間は大幅に遅くなります。さらに、応力ひずみプロファイルは、M-D-X-E-D-L筋肉の剛性が大幅に増加していることを示唆しています。また、M-D-X-E-D-L筋は、ピークストレスに達する前に大幅に高い抵抗力を発揮しますが、ポストピークストレスははるかに速く減少します。

さらに、応力緩和率は、黒の10EDL筋と比較して、M-D-X-E-D-L筋で有意に高かった。解剖手順を習得すると、EDL筋の収縮性および受動的特性のex vivo分析を40分で行うことができます。また、両方のTA筋肉の収縮特性のin situ評価は、その開発後60分で行うことができます。

この技術は、研究者が筋肉疾患の分野における骨格筋の収縮性および受動的特性を評価する道を開き、この手順に続く治療の効率を決定するのに役立てました。骨格筋の組織病理学分析のような他の方法は、追加の質問に答えるために実行できます。例えば、骨格筋の組織病理学に対する実験的治療の効果