Name: ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶ、3D電子顕微鏡データのセグメンテーション手法。手動・半自動・自動アプローチを比較し、データ特性に応じた最適な特徴抽出方法を選択する実用的なフレームワークを提供する。

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私たちは、Chimeraに対する無限の支援に対して、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のTom Goddard氏、細菌データセットのSBF-SEMデータ収集を支援してくださったGatan, Inc.のJoel Mancuso氏とChris Booth氏、上皮細胞データセットのFIB-SEMデータ収集を支援してくださったZeiss, Inc.のDoug Wei氏に感謝したいと思います。 カリフォルニア大学バークレー校電子顕微鏡研究所のKent McDonald氏にはサンプル調製、TEMイメージング、トモグラフィーに関するアドバイスを、ローレンス・バークレー国立研究所のRoseann Csencsits氏にはクライオTEM画像の撮影に協力し、Elena Bosneaga氏には植物データセットのクライオセクショニングについて、オレゴン健康科学大学のJocelyn Krey氏には卵形嚢組織の解剖について、National Energy Research Scientific Computing Center(NERSC)のDavid Skinner氏、大学ではJitendra Malik氏にアドバイスをいただきました。カリフォルニア・バークレー校では、ソフトウェア・インフラストラクチャに関するアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のパブロ・アルベラエズでは、この記事で紹介したカスタム・テーラード・スクリプトへのコード貢献に対して、アドバイスをくれました。
Researchは、契約番号の下で米国エネルギー省科学局の支援を受けました。DE-AC02-05CH11231 [David Skinner]、および米国国立衛生研究所(NIH)助成金番号P01 GM051487 [M.A.] 内耳有毛細胞プロジェクトおよび顕微鏡器具用。

1マニュアル抽象モデル生成注：以下に記載される方法論の詳細はキメラに特異的であるが、他のソフトウェアパッケージを用いてもよい。唯一の目的ではなく、オブジェクトのボリューム形状を表示する場合に比べ、幾何学的な測定を行うために、幾何学的モデル（ 例えば 、ボールとスティックモデル）を作成するときに、この方法を使用します。 <ol><li>マニュアル抽象化モデル生成のための適切なプログラムにデータボリュームをインポートします。 <ol><li> [ファイルを開く]ダイアログをプルアップするファイル]&gt; [ 開くマップを選択します。目的のマップのファイルの場所に移動します。 </li><li>異なるレンダリングスタイルを持つデータを表示するボリュームビューア（[ツール]&gt; [ボリュームデータ &gt; ボリュームビューア ）を選択特長 &gt; 表示スタイルの引き上げます。 </li><li>ボリュームビューアでヒストグラムに垂直バーをドラッグして表示するためのしきい値を調整しますウィンドウ。 </li></ol></li><li> 3Dボリュームをナビゲート（ 例えば 、スライスによるスライス）がセグメンテーションのための関心領域を選択し、必要に応じてより小さなサブボリュームをトリミングします。 <ol><li>ボリュームビューア]ダイアログで、X、Y、またはZを選択し、Axisをクリックします。 </li><li>ボリュームビューア]ダイアログボックスで、[ 機能 ]&gt; [ 飛行機 。左のボックスの数値に対応する平面を表示するように深さを設定するために一つをクリックして、すべての面を表示するには、[すべて ] をクリックします。 </li><li>ボリュームビューア]ダイアログボックスで、[ 機能 ]&gt; [ メコン選択 。 <ol><li>関心領域の周りに長方形のボックスを作成するにはクリックしてドラッグします。 </li></ol></li></ol></li><li>関心のある特徴に沿ってマーカーを置き、モデルが完了するまで（多くの場合、プログラムによって自動的に行われる）適切なリンカーを接続します。 <ol><li>ボリュームビューアのメニューバーから、[ツール]&gt; [ボリュームトレーサダイアログがボリュームトレーサ]ダイアログを開きます。ボリュームトレーサ]ダイアログで、[ファイル ]&gt; [ 新規マーカーセット中。 </li><li> 連続して選択されたマーカーをボリュームトレーサ]ダイアログで、、、高品質のデータ·プレーンの上に置いてマーカーをマウス &gt; 置きマーカーを確認し、選択マーカーにマーカーリンク新しいマーカーを移動し、サイズ変更 、およびリンク 。 </li><li> マーカー色見本をクリックし、色を選択します。 リンクの色ごとにこの手順を繰り返します。 </li><li>マーカーおよびリンクモデル構築要素のための半径を入力します。 </li><li>ボリュームトレーサ]ウィンドウで、[右]マウスボタンを使用して置きマーカーを選択して、マーカーやリンクのための半径を挿入します。 </li><li>右のマーカーを敷設を開始するボリュームデータをクリックしてください。マーカーは自動的に接続されます。 </li><li>ボリュームトレーサ]ダイアログで、[ ファイル ]&gt; [ 現在のマーカーセットを保存し 、その後&gt; 閉じるマーカーセットファイル 。 </li></ol></李&gt; <li>興味のある第2の所望の特徴にモデルの構築を開始するために、新しいマーカーセット（ステップ1.3.1）を開きます。特徴の違いを強調するために、マーカーセット間の対照的な色を利用している。 </li></ol>関心のある特徴2。手動トレース注：以下に記載される方法論の詳細はアミラに固有であるが、他のソフトウェアパッケージを用いてもよい。人口密度が比較的小さく、特徴抽出の精度が最優先事項であるとき、マニュアルトレースのように時間のかかるアプローチであるときに、このアプローチを使用する。 <ol><li>マニュアルトレースオプションを使用してプログラムにインポートボリュームデータ。この機能を持つソフトウェアは、一般に、少なくとも基本的なブラシツールを提供します。 <ol><li>大量または断層像では（ 例えば 、16ビットの2048 X 2048以上.recまたはIMODに.mrc生成された断層像）：[開く]を選択しデータ &gt; filename.rec&gt;フォーマットを右クリックして...&gt; LargeDiskDataとして生を選択 </i&gt;&gt; OK&gt;ロード 。 OK&gt;ヘッダ情報から、適切な生データのパラメータを選択します。新規として切り替えて、 保存 <a href="http://filename.am/">filename.amの</a>は、以下の手順で使用するためのファイル。 </li><li>小さ ​​い3D画像スタックファイルの場合（ 例えば 、3次元.TIFまたは.mrcまたは.rec）： オープンデータ &gt;を選択filename.tifまたはfilename.mrc。 名前を付けて保存を切り替え、右クリック&gt; <a href="http://filename.am/">filename.am</a> 。エラーが発生したか、プログラムが応答しない場合、ファイルが大きすぎていてもよく、ステップ2.1.1に従うことによって開くことができる。 </li></ol></li><li>分割のための3Dサブボリュームを選択したスライスをナビゲートしてから、関心のあるこのエリアに切り抜く。 <ol><li> 3Dビューアウィンドウでは、画像ファイルを開くにはOrthosliceを選択します。スライスを移動するには下部にあるスライダを使用してください。 </li><li> &gt;プールウィンドウでファイル名トグル、LargeDiskDataとして開かれ、より大きなデータをトリミングする権利&gt; LatticeAccessをクリックします。エンテrは希望ボックスサイズ&gt; 適用します 。新しいファイルを保存します。 </li></ol></li><li>セグメンテーションファイルを作成します。 <ol><li>プールウィンドウでファイルを切り替え&gt;右&gt; ラベリング &gt; labelFieldプロパティ ] をクリックします。新しいファイルが作成され、自動的にセグメンテーションエディタ]タブにロードされます。 </li></ol></li><li>手や使用するソフトウェアに固有のコマンドを使用してトレースを埋めた後、目的の第一の特徴の境界をトレースします。すべてのスライスを通じて関心特徴に従って、マニュアルトレースセグメンテーションを繰り返します。アミラを使用して次のコマンドを使用します。 <ol><li>ペイントブラシツールを使用するには、必要に応じてブラシのサイズを変更し、関心のある特徴の境界をトレースするには、マウスポインタを使用しています。 </li><li>ショートカット「F」と、トレースエリアを埋める。プラス記号の付いたボタンをクリックすることで選択範囲を追加するか、ショートカットの「a」。必要に応じて、Enterキーを押し、「U」は取り消し、および「S」を減算または消去することができます。 </li></oL&gt; </li><li>可視化と基本的な定性的またはソフトウェアユーザーガイド命令あたりの定量分析のための表面レンダリングを生成します。 <ol><li>オブジェクトプール]タブで、右&gt; SurfaceGenクリック&gt;プール·ウィンドウにファイル名-labels.amを切り替えます。 </li><li>所望の表面のプロパティを選択&gt; 適用します 。新しいファイルfilename.surfはプール内に作成されます。 </li><li>セグメント化されたボリュームを視覚化するために、プール·ウィンドウにfilename.surf切り替える&gt;右&gt; SurfaceViewをクリックします。 </li><li>移動、回転、3Dボリュームにズームする3DViewerウィンドウのツールを使用してください。 </li></ol></li><li>正確な密度を抽出し、ボリュームや表面積などの測定値を決定する。より高度な表示、解析およびシミュレーションのための他のプログラムにエクスポートします。 <ol><li> 3DViewerウィンドウで、 適切なオプション （2Dの長さと2次元角度測定のための単一の2D平面上に、3Dの長さと3Dの角度を選択 &gt; 計測ツールをクリックします3Dボリュームの測定のために）。 </li><li>希望の長さ、距離、角度を測定するためにメッシュサーフェスをクリックします。値は、[プロパティ]ウィンドウに一覧表示されます。 </li></ol></li></ol> 3自動密度に基づくセグメンテーション注：以下に記載される方法論の詳細はアミラに固有であるが、他のソフトウェアパッケージを用いてもよい。 <ol><li>興味のある密度を撤回する、コントラスト、鮮明さ、または混雑のいずれかさまざまなデータセットで、この方法を使用します。 </li><li>自動セグメンテーションのためのしきい値、魔法の杖、または他の密度ベースのツールを装備したプログラムにインポートボリュームデータ。マニュアルトレース用の方向に2.1-2.1.2で説明されている手順に従ってください。 </li><li>スライスをナビゲートし、セグメンテーションのための領域を選択します。必要な場合には、セグメント化のためのより小さな3Dサブボリュームを切り取る。マニュアルトレース用の方向に2.2-2.2.2で説明されている手順に従ってください。 </li><li>の濃度を選択します通常機能のマークまたはアンカーポイントをクリックするか、配置することによって、目的の機能、。ソフトウェアで許可された場合は、その機能のピクセル強度を包含する番号の範囲を入力し、必要に応じて、この許容値を調整します。機能に属する密度は、アンカーのピクセルまたは許容値の強度に合わせてピックアップされます。アミラを使用する場合は、次のコマンドを使用します。 <ol><li>識別可能なマージンの機能に魔法の杖ツールを使用してください。 <ol><li>機能が完全にハイライト表示さ​​れるように、正しい値の範囲をキャプチャするためにディスプレイとマスキングでスライダを調整した後、関心のある領域をクリックします。ショートカットの「a」で選択範囲を追加します。 </li></ol></li><li>明確に区別余白せずに機能するためのしきい値のツールを使用してください。 </li><li>しきい値のアイコンを選択します。関心のある特徴のみがマスクされるように、所望の範囲内で濃度を調整するスライダを調整します。 [選択]ボタンをクリックし、ショートカットで選択範囲を追加する220; A」。 </li><li>セグメント全体のボリュームに、選択範囲を追加する前に、 すべてのスライスを選択します。 </li><li> 、ノイズを除去するセグメンテーションを選択&gt; 諸島および/ ​​またはセグメンテーション &gt; スムーズラベルを削除する。 </li></ol></li><li>マニュアルトレースセクション2.6-2.6.2で説明したように可視化および定性分析のための表面を生成します。必要に応じて、適切な3D表示、定量分析やシミュレーションのための他のプログラムにエクスポートする。 </li></ol> 4。カスタム仕立ての自動セグメンテーション注：コンピュータサイエンスのバックグラウンドでの経験を必要としますが、大容量の精密な密度モデルを作成する機能を可能にする自動セグメンテーションのためにカスタマイズされたスクリプトを作成するには、この方法を使用します。 <ol><li>ツール（MATLAB 27シェイプ教師付きセグメンテーションの具体例） <ol><li>画像前処理：雑音除去、背景除去及び画像強調を実行する次のパイプラインを使用することにより： <ol><li> 関数imreadコマンドを使用してイメージをロードします。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt;イム= imreadは$のIMAGE_PATHを分析しようとするイメージの場所です（$のIMAGE_PATH）。 </li></ol></li><li>画像処理ツールボックスから、推定または既知のノイズパワー対信号比（NSR）を使用して、ウィナーフィルタを呼び出します。 </li><li>以前に処理された画像上で、その後、背景レイヤーを推定するためにimopen画像opening関数を呼び出して別のマスクとして成果を割り当てる。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します。&gt;&gt;背景= imopen（イム、STREL別（$ shape_string、$サイズ））、この方法では、$ shape_stringはサイズがアナライザによって与えられている変数$ &#39;ディスク&#39;に等しく、 すなわち &gt;&gt;背景= imopen（イム、STREL（ &#39;ディスク&#39;、15））。 </li></ol></li><li>背景がフィルタリングされた画像を引きます。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt; IM2 =イム -背景</li></ol></li><li>結果の質に応じて、画像処理ツールボックスから関数関数imadjustを使って呼び出すことができ、適応大津の方法28の有無にかかわらず、画像の正規化を行う。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt; IM3 =関数imadjust（IM2） </li></ol></li><li>正規化された画像をトリミングすることにより、関心領域を制限する、セグメンテーションのために関心のある特徴を準備します。 <ol><li> &gt;&gt; im3_crop = imcrop（IM3、[X1、Y1×2 Y2]）、ベクトル[×1 Y1×2 y2は]に対応：imtoolコマンドを使用して、トリミングされ、コマンドに座標を提供することにある関心領域を探索クロップされる正方形の領域。 </li></ol></li></ol></li><li>認識/教師形状分類形状：オブジェクトのそれぞれ異なるカテゴリの具体的な例（関心のある特徴を横断2D画像における線形トレース）を提供することによって、アルゴリズムを訓練。 <ol><li> VLFEAT 29 APIが正常にインストールされていることを確認し、より詳細な資料についてはVLFEATのホームページをご利用ください。 </li><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt; [TREE、ASGN] = VL_HIKMEANS（im3_crop、$ K、$ NLEAVES）$ Kを使用するためにクラスタの数や観察者が中にデータを配置したいクラスの数であり、と$ NLEAVES すなわち &gt;&gt; [TREE、ASGN] = VL_HIKMEANS（im3_crop、4,100）リーフクラスタの所望の数である</li><li> VLFeatの入力として手動でセグメント化された機能を使用してください。 注：このオープンソースのCベースライブラリは、ピクセルのパッチ、パッチクラスタ化、およびデータセットに最適に動作するように選択した方法の種類に応じて、クラスタ中心の位置決めを行います。利用可能なオプションは、ベースをテキストンでk-平均クラスタリングの範囲に30に近づき、出力は特徴が与えられた手本に基づいて、所望記述する数値配列です。 </li></ol></li></ol></li><li>セグメンテーション：このFUを使用してくださいLLYさらなる可視化と分析のための独立したマップとして書き出されます同時にオブジェクトのセグメント複数のクラスに計算コストが高い、アプローチが、自動化された。 <ol><li>以前に生成された数字の配列（モデル）をロードします。 </li><li>モデル入力としてセグメント化される画像を用いて、VLFeatにおけるサポートベクトルマシン（SVM）関数を呼び出す。 <ol><li>コマンドラインで次のように入力します。&gt;&gt; xは、元の画像im2_cropとyをトリミングさ= vl_svmtrain（X、Y、0.1）、[B、W]対象画像、手動でセグメント化された画像である。クラスタリングによって生成されたラベルに従って結果を着色する&gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG（I、ラベル）を使用します。 注：モデルの特性に基づいて、VLFeat最初から割り当てられたクラス（関心のある特徴）の数に画像を分類する。所望の精度の程度に応じて、他のアプローチまたは推定CLUSTこの方法を組み合わせることが可能であるそのような船体とクラスタ中心として小胞体パラメータ。 SVMアルゴリズムの出力は、確率モデルと新たなデータセット中の所望のクラスの複数のバイナリマスクである。 </li></ol></li><li>コマンドを入力して、結果を保存：$フォーマットが &#39;いさかい&#39;と$ filenameは、出力ファイルのパスです&gt;&gt; imwriteは（IM、$フォーマット、$ファイル名）。 </li><li> &gt;&gt; imshowは（IM）：画像を可視化するために、コマンドを入力します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

伝統的に、電子顕微鏡（EM）フィールドが1に分割されている）は、典型的に有する高分子複合体の三次元（3D）構造を調査するために平均化暗黙的または明示的なデータと組み合わされ、高、超高分解能TEMを用いた構造生物学支店定義された組成と、典型的には、比較的小さなサイズ1-4、全体の細胞風景が1,5,6を可視化されている2）細胞イメージングブランチ。構造生物学の枝が最後の40年間の壮大な発展を遂げてきたが、細胞生物学の枝は主に、多くの場合、より少なくより最適に保存されたサンプルに、2次元に限定されていた。だけ過去10年間電子線トモグラフィーの出現により、細胞生物学的な超微細構造イメージングは、一般的に平均化が細胞の風景のように行うことができないので、関心のある特徴は、一般的にユニークである三次元5,7へと拡大してきました。 可視化され、携帯のシーンは、多くの場合、目には美しいですが、正確なタンパク質組成は通常不明であるため、関心とそのような高度に複雑な細胞容積のその後の定量分析の特徴を効率的に抽出は、したがって、それが困難なこれらの細胞を解釈すること、部分的には、遅れ3Dボリューム。この今日まで、広範囲の生物学的専門知識は、多くの場合、複雑な断層像を解釈する、あるいは3Dボリュームに重要な領域とを必須成分を特定するために必要とされる。さらに合併症として、3次元ボリュームの可視化は著しく非自明です。 3Dボリュームがあると考え、したがって、2D画像のスタックとして視覚化することができる。シーケンシャル2D画像のスライスごと検査は複雑さを軽減し、それはまた、限界が2次元に抽出し、このようにして定量分析を備えています。しかし、ほとんどの3Dオブジェクトのために、3Dボリュームの描写は、単に連続した平面のスタックは不完全につながる特定のシステムの3D自然に歪んだ視点はd。目視検査の代替モードは、携帯の頻繁に密な自然に与えられたいずれかのボリュームレンダリングやサーフェスレンダリング、必要とするボリュームを、することができますので、インタラクティブな手動セグメンテーションを困難にし、簡単にネストされたオブジェクトの妨げビューにつながるか、完全にユーザーを圧倒する。 、自動化された特徴抽出（セグメンテーション）の多種多様なこれらの障壁を改善するためのアプローチは密度-又は勾配ベースの8-10のいずれか、典型的には開発されてきた。しかし、これらの方法にかかわらず、いくつかの最近の方法は、アクチンフィラメント11のような関心のある特定の機能をターゲットにすることができますが、専門家にとって関心のある地域や特徴のセグメントにボリューム全体を傾向がある。流域immersioを適用する場合に加えて、自動化されたセグメンテーションを実行するプログラムは、時にはサブボリューム（ 例えば 、多数の産生をもたらすことができ多くの場合、関心の全機能を含む、またはさらに細分化を施しても中に手動でバックマージする必要のnセグメンテーション）。これは、このように、ほとんどのレンダリングコンピュータアルゴリズムを忠実に関心のある特徴のみを抽出することができない、と専門家による大幅なキュレーションの努力は、多くの場合、必要​​なセグメント化されたボリュームを生成するために必要とされる、特に複雑で混雑したデータセットについても同様である。 また、高度に特異的な問題へのカスタムソリューションは、多くの場合、それらの数学の分野の詳細な知識を持っていない研究者がアクセスできる広範かつ包括的なツール作る上で無重点がほとんどで、科学的な会議の論文として公開されている、コンピュータサイエンス、および/またはコンピュータグラフィックス。画像解析ライブラリの範囲を含むカスタマイズ可能なプログラミングソフトウェア環境は、ユーザが効率的に正確なセグメンテーションのための独自のモジュールを記述することを可能にする強力なツールのセットであり得る。しかし、このアプローチは、内線を必要とするensive訓練とその多くの機能や画像解析のための機能を利用するために、コンピュータサイエンスの背景。一つは、それらの周囲12,13から関心のあるオブジェクトを分離するために「テンプレート」のユニークな幾何学的形状に依存して、強力な形状ベースのアプローチを利用することによって、特徴がよりスパースである特定のデータセットについて、 例えば 、そのような汎用性の高いソフトウェア環境内で動作することができ。 コンピュータグラフィックスの可視化パッケージの公正さまざまなインタラクティブな手動セグメンテーションとモデル構築のために存在する。カリフォルニア大学サンフランシスコ校キメラ14、コロラドIMOD 15校、テキサス大学オースティンVolumeRover 16：他の人が学術的起源のものであり、そのように、無料で配布しながら、いくつかのパッケージは、市販されている。しかし、これらのプログラムが持つ機能と能力の広い範囲と複雑さは、EAのための学習曲線を急勾配CH。特定の視覚化プログラムは、複雑な3Dボリュームの簡略化モデルを作成するために、密度マップに入れることができるさまざまな大きさのボールとスティックのような単純な幾何学的モデルを提供する。これらのモデルは、単純な幾何学的および体積測定を可能にし、したがって、単に &quot;きれいな絵」を越えて行く。オブジェクトのようなマニュアルトレースは、オブジェクトの数が少ないトレースして抽出する必要があるボリュームに適しています。しかしながら、集束イオンビーム走査電子顕微鏡法（FIB-SEM）17-20またはシリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBF-SEM）のいずれかを使用して大量の3D超微細構造の画像化の最近の開発21は、3Dデータのサイズというさらなる合併症を提示するセットは、数十ギガバイトと数百ギガバイト、さらにはテラバイトの範囲とすることができる。したがって、このような大型の3Dボリュームは、手動特徴抽出と実質的にアクセス不可能であるので効率的なユーザーガイド半自動偉業URE抽出は予見可能な将来における3Dボリュームの効率的な解析のためのボトルネックの1つになるでしょう。 ここに提示日常的に生体画像タイプの広い範囲で使用される4つの異なるセグメンテーションアプローチがある。これらの方法は、次に、生物学者は、自分のデータの有効な特徴を抽出するための最良のセグメント化アプローチであるかもしれないものを判断するためのガイド内にコンパイルを可能にする、データセットの異なるタイプのそれらの有効性について比較する。詳細なユーザーマニュアルが記載されたプログラムのほとんどに利用可能であるとして、その目的は、これらの特定のパッケージのいずれかに精通している潜在的なユーザーにすることではありません。その代わりに、目標は、多様な特性を持つ6のデータセットの例にそれらを適用することにより、これらの異なるセグメント化戦略のそれぞれの強みと限界を実証することである。この比較により、基準​​のセットは、いずれかの客観的な画像特性に基づいて開発されているそのようなそのようなセグメンテーションのための所望の目的として主観的な考慮からのデータのコントラスト、鮮明さ、混雑、および複雑さ、またはステムなどの3Dデータセットは、特徴の形態での画分を意味する、関心のある特徴の人口密度、セグメント化される関心特徴、そしてどのように1収益最適にそのような時間とスタッフの可用性などの有限な資源で占める体積。これらの異なるデータセットの例は、これらの客観的および主観的基準は、データセットの特定の種類の特定の特徴抽出手法のペアを生成するためにさまざまな組み合わせで連続的に適用することができる方法を示す。指定された勧告は、うまくいけば、セグメンテーションオプションの多種多様に直面して、初心者が自分の3Dボリュームのための最も効果的なセグメンテーションアプローチを選択するのに役立ちます。 この論文の焦点は、データ収集と前処理データの特徴抽出、注意であるが効率的なのに不可欠であるegmentation。しばしば、試料の染色が不均一にすることができ、したがって、潜在的な染色アーチファクトがセグメンテーション手順で考慮されるべきである。しかし、染色は通常、より高い信号対雑音を与え、したがって、潜在的にアーチファクトが生じる可能性があり、携帯ボリュームの少ないフィルタリングや他の数学的処理を必要とします。それぞれの生画像データセットは、正確なコントラストおよびカメラピクセルの設定で取得した位置合わせ、及び3Dボリュームに再構築する必要がある。断層像については、整列された画像は、重み付け逆投影を使用して、典型的には再構築された後、データセットは、通常、非線形異方性拡散22、バイラテラルフィルタリング23、または24のフィルタリング再帰中央値として雑音除去アルゴリズムが施される。 FIB-SEMおよびSBF-SEM撮像データは、ImageJの25 XY利用プログラムで相互相関の連続切片により整列される。コントラスト強調とフィルタリングの機能を高めるために適用することができる関心ので、デノイズに画像スタック。フィルタリングアプローチは計算上高価であることができるように、フィルタリングは、選択または選択されたサブボリューム上のサブボリュームの前に、ボリューム全体のいずれかを行うことができる。時には、ノイズ低減および/またはファイルサイズ縮小のために使用される、（ビニング）データのサンプリングダウンデータが著しく予想解像度に比べてオーバーサンプリングされた場合にのみ推奨される。 ノイズ低減の後、処理された画像は、その後、さまざまな方法によってセグメント化することができ、そしてこの研究の焦点は、以下の4つである：（1）マニュアル抽象化モデル生成、（2）のマニュアルトレースを球棒モデルを作成を通じて関心のある特徴、（3）自動化されたしきい値ベースの密度、およびプロジェクト固有の分割のためのスクリプト（4）を介してカスタマイズされた自動化されたセグメント化の。境界セグメンテーション8と没入流域セグメンテーション10は、単純なしきい値へのより良い代替手段ですが、tはちょっと同じカテゴリーに属し、この議論の中で明示的に含まれていません。 密度の手動トレースはスライスごとのそれぞれの細胞内領域の元の密度の保持を可能にする、関心のある特徴を概説する必要があります。このアプローチは、セグメント化プロセスの最大制御を可能にするが、退屈で労働集約的なプロセスです。 アルゴリズムはユーザ定義パラメータのセットに基づいてピクセルを選択する場合、自動化されたしきい値ベース（および関連する）密度セグメンテーションアプローチは、半自動である。そのようなCHIMERAにより作成、IMOD、フィジー26、VolumeRoverなどのいくつかのアカデミック（無料）可視化パッケージは、パッケージ（有料のライセンスを必要とする）利用可能なだけでなく、商業であり、両方のタイプは、一般的に、これらのセグメント化の方法のいずれかまたは複数を含む。これらの異なる方法を説明するために本研究で使用されているソフトウェアパッケージは商用プログラムやアカデミックオープンの両方が含まれる手動で抽象モデルだけでなく、手動および自動密度セグメンテーションを生成するためのソースプログラム。しかし、オープンソースソフトウェアは、時には、カスタマイズの可能性を通じて、より高度なオプションを提供することができます。 データセットの異なるタイプを使用してこれらの技術の比較は、ルールや知識にまだ公開されていない多様な生物学的データの3Dボリュームのセグメントにアプローチする方法に関するガイダンスの次の提示につながった。したがって、これは最初の体系の異なるアプローチの比較は、異なる目的を持つユーザーのために特性を変化させたデータセットに対するそれらの有用性がある。

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>FEI Visualization Sciences Group</td><td></td><td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td></tr><tr><td>Chimera</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ Fiji/ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td><td></td> <td>(英語)http://bio3d.colorado.edu/imod/</td></tr> <tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>VLFeat</td>、<td>VLFeat</td><td></td>、<td>http://www.vlfeat.org/</td></tr></tbody></table>

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3d-データのセグメンテーションの実用ガイド

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

近代的な3D電子顕微鏡のアプローチは、それらの細胞骨格および細胞小器官などの高次構造は、同様に、そのような接着複合体のような大きな高分子マシンの視覚化を可能にする、細胞および組織の3次元超微細組織への前例のない洞察を最近許可されているそれぞれの細胞および組織のコンテキスト。細胞のボリュームの固有の複雑さを考えると、まず視覚化、定量化、従って、それらの三次元組織の理解を可能にするために、関心のある特徴を抽出することが不可欠である。各データセットは個別の特性によって定義され、 例えば信号対雑音比、サクサク簡単に識別できるように特徴的な形状のデータ、その機能の不均一性、特徴の混雑、有無（シャープネス）、およびパーセント関心のある特定の領域が占めるボリューム全体の。すべてのこれらの特性を考慮する必要があるセグメンテーションのために取るためにどのアプローチを決定する際に。 提示六つの異なる3次元超微細構造のデータセットは、3つの異なる撮像により得られた近づく：染色された電子線トモグラフィーを埋め込み樹脂は、イオンbeam-と穏やかに染色し、激しく染色されたサンプルの連続ブロックface-走査電子顕微鏡法（FIB-SEM、SBF-SEM）、集束であった。これらのデータセットの場合、四つの異なるセグメンテーションアプローチが適用されている：（1）完全に手動モデル構築は、単にモデルの視覚化に続いて、表面レンダリングに続く（2）データのマニュアルトレースセグメント化、（3）半自動化されたアプローチは、その後表面レンダリング、または表面レンダリングおよび定量分析を行った（4）自動化されたカスタム設計のセグメント化アルゴリズムによる。データセットの特性の組み合わせによっては、これらの4つのカテゴリの手法の典型的には、1つが他よりも優れていることが判明したが、基準の正確な配列に依存して、カ再複数のアプローチが成功する場合があります。これらのデータをもとに、客観的なデータセットの特性と異なるデータセットを分析するための主観的個人の基準の両方を分類トリアージ方式を提案する。

携帯3D電子顕微鏡のためのボトルネックは非常に複雑な3D密度マップにおける特徴抽出（セグメンテーション）です。私たちは、このように効果的なセグメンテーションのための出発点を提供し、セグメント化アプローチ（手動、半自動、また​​は自動で）異なるデータ型に最も適しているに関するガイダンスを提供する基準のセットを開発した。

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

本実験の全体的な目的は、細胞および組織の複雑な3D電子顕微鏡データセットから解析対象となる特徴をセグメンテーションし、それらの3D構造を解析することです。これは、個々の電子顕微鏡画像からなるデータセットを収集することで達成されます。次に、生の2Dデータを3Dボリュームに再構成し、フィルタリングを行うことでノイズを低減し、関心のある特徴を強調します。第2ステップとして、データの客観的および主観的な特性を評価し、セグメンテーションに最適な手法を選択するための判断材料とします。次に、手動による抽象化、モデル生成、または関心領域の特徴の手動トレースを行います。また、関心領域の特徴を抽出するために、自動的な密度ベースのセグメンテーションまたはカスタム設計の自動セグメンテーションを実行します。結果として、画像の特性の選別と個々の目的に基づいて最適なセグメンテーション手法を選択し、関心領域の最終的な3Dセグメンテーションモデルが得られます。異なるデータセットに対して異なるアプローチを比較することで、適切なセグメンテーション戦略の選択に役立ちます。ここでは、関心のある特徴を抽出するためのさまざまな手法を実演します。細胞内電子顕微鏡ボリュームの複雑さを考慮すると、各アプローチにはそれぞれ利点と限界があります。一般的に、セグメンテーションに不慣れな方は、データセットごとに最適なアプローチを特定することが必ずしも容易ではないため、苦労することがあります。また、大学院生の悩みも併せて紹介します。本手順のデモンストレーションは、ポストドクターのTaiが行います。私の研究室では、リサーチアソシエイトのAmit HassanとコンピュータシステムエンジニアのJoaquin Koreaが、幾何学的な測定を行うための幾何学的モデルを作成することのみを目的とする場合に、手動による抽象化モデル生成を用いています。まず、データボリュームを適切なプログラムにインポートします。このデモンストレーションでは、手動による抽象化モデル生成にkymeraソフトウェアを使用しています。まず、「File」から「Open」を選択してファイルオープンダイアログを表示し、目的のマップファイルがある場所まで移動します。次に、ボリュームビューアを起動し、「Features display style」を選択して、異なるレンダリングスタイルでデータを表示します。ボリュームビューアウィンドウ内のヒストグラムにある垂直バーをドラッグして、表示のしきい値を調整します。3Dボリューム内を移動して、セグメンテーションを行う関心領域を選択し、必要に応じてより小さなサブボリュームを切り出します。ボリュームビューアのダイアログで「features」および「subregion selection」を選択し、クリックしてドラッグすることで、関心領域を囲む長方形のボックスを作成します。次に、関心のある特徴に沿ってマーカーを配置し、モデルが完成するまで、適宜それらをリンカーで接続します。ボリュームビューアのメニューバーからこれを実行するには、[tools]から[volume tracer dialogue]を選択します。そこでボリュームトレーサーダイアログを開くには、[file]から[new marker.Set]を選択してください。ボリュームトレーサーダイアログ内で、[mouse]、[place markers on high density]、[place markers on data]、[planes move and ize markers]、[link new marker to selected marker]、および[link consecutively selected markers]にチェックを入れます。次に、ボリュームトレーサーウィンドウで「右マウスボタンによるマーカー配置」を選択し、マーカーとリンクの半径を入力します。続いて、ボリュームデータを右クリックしてマーカーの配置を開始します。マーカーはボリュームトレーサーダイアログ内で自動的に接続されます。ファイルを選択し、現在のマーカーを保存します。次に、ファイルの終了マーカーを設定します。設定後、新しいマーカーセットを開き、関心のある2つ目の特徴量に対してモデルの構築を開始します。特徴の違いを強調するために、マーカーセット間で対照的な色を使用してください。関心のある特徴をマニュアルでトレースする方法は、個体群密度が比較的低く、特徴抽出の精度が極めて重要である場合に用いられる時間のかかる手法です。まず、マニュアルトレース機能を備えたソフトウェアにボリュームデータをインポートします。この機能では、一般的に基本的なペイントブラシツールが提供されます。本デモンストレーションでは、巨大なトモグラフィーデータにAmiraソフトウェアを使用します。[open data]を選択し、ファイル名のrecを右クリックしてください。次に、「format」をクリックし、「large disc data」として「raw」を選択して「OK」を押し、「load」をクリックします。ヘッダー情報から適切なrawデータパラメータを選択し、「OK」をクリックしてください。切り替えて、新しいファイル名で保存します。amファイルです。3D画像シーケンスの場合は、「open data」を選択し、tiff形式のファイル名またはdot mrmc形式のファイル名を選択してください。次にトグルを切り替え、右クリックして「名前を付けて保存」を選択し、ファイル名をamとして保存します。3Dビューアウィンドウで「ortho slice」を選択し、画像ファイルを開きます。その後、下部のスライダーを使用してスライスを移動し、大きなディスクデータとして開かれた大容量データをクロップします。プールウィンドウでファイル名を選択し、右クリックして「lattice access」を選択します。希望するボックスサイズを入力し、ボックスを目的の領域に移動させて「apply」をクリックします。新しいファイルを保存してください。次に、プールウィンドウでファイルを切り替えてセグメンテーションファイルを作成します。その後、右クリックして「labeling label field」を選択します。これにより新しいファイルが作成され、セグメンテーションエディタータブとオブジェクトプールの両方に自動的に読み込まれます。ペイントブラシツールを使用して、関心のある最初の領域の境界線をトレースします。必要に応じてブラシサイズを変更し、マウスポインターを用いて関心領域の境界線をトレースしてください。ショートカットキーFを使用して、トレースした領域を塗りつぶします。プラス記号のボタンをクリックして、選択範囲を追加します。すべてのスライスを通じて目的の特徴を追跡し、手動トレースによるセグメンテーションを繰り返します。ソフトウェアユーザーガイドの指示に従い、オブジェクトプールタブで可視化および基本的な定性的または定量的解析のためのサーフェスレンダリングを生成します。プールウィンドウでファイル名のラベルを切り替え、右クリックして「surface gen」を選択してください。任意の表面特性を選択し、「apply」をクリックします。プールに「surf」という名前の新しいファイルが作成されます。セグメンテーションされたボリュームを可視化するには、プールウィンドウで「surf」ファイル名を切り替えてください。次に右クリックし、surface viewを選択します。テキストプロトコルに記載されている通り、可視化および定性的分析のためのサーフェスを生成します。コントラスト、鮮明度、または密集度が異なるあらゆるデータセットに対し、自動密度ベースセグメンテーションを使用して関心のある密度を抽出します。その後、閾値設定マジックワンドやその他の密度ベースツールを備えたプログラムにボリュームデータをインポートし、自動セグメンテーションを開始します。関心領域の手動トレース手法と同様に、このデモンストレーションでは、境界が明確に区別できない特徴量に対してAmiraソフトウェアを使用します。閾値アイコンを選択して、閾値ツールを使用してください。スライダーを調整して密度を適切な範囲に設定し、関心領域のみがマスクされるようにします。選択ボタンをクリックし、プラス記号のボタンまたはショートカットを使用して選択範囲を追加します。テキストプロトコルに記載されている通り、可視化および定性的分析のためのサーフェスを生成します。すべて4番目のアプローチとなります。カスタム調整された自動セグメンテーションを使用すると、大規模なデータセットを効率的にセグメント化できますが、Matlabなどのプログラムに関する知識が必要です。この方法の詳細な手順については、カスタム調整セグメンテーションに関する補足ビデオを参照してください。6つの例示データセットを4つのアプローチでセグメント化しました。手動アブストラクトモデル生成、関心領域の手動トレース、自動密度ベースセグメンテーション、およびカスタム調整自動セグメンテーションです。樹脂に対しては、手動アブストラクトモデル生成が有効でした。目的を持った不動化染色トモグラフィーによる立体繊毛の解析は、植物細胞壁の樹脂包埋染色トモグラフィーから正確な密度を抽出することではなく、定量的な目的のためのモデルを作成することでした。自動密度ベースセグメンテーションは、多くのスライスからセルロースを迅速に抽出するのに最も効果的でした。手動による手法では、わずか数スライスのデータに対してより多くの労力を要しました。手動による抽象モデル生成では、キノシリウムのステージ・トモグラフィーにおいて微小管三連構造が再現されました。一方、2つの自動アプローチはより迅速に密度を抽出できたため、集束イオンビームを用いたミトコンドリアの形状や、乳腺上皮細胞の走査電子顕微鏡観察においては、自動アプローチの方が好ましい結果となりました。手動トレースは最もクリーンな結果をもたらし、個体群密度が低かったため迅速なセグメンテーションが可能でした。セグメンテーションが必要な領域が広大であったため、連続ブロック面走査電子顕微鏡による細菌データのセグメンテーションには、カスタム調整された自動セグメンテーションが最も効率的であることが証明されました。乳腺上皮細胞膜の集束イオンビーム走査電子顕微鏡像を抽出する唯一の方法は手動でのトレースでしたが、これには多大な時間を要しました。セグメンテーション手法の開発により、構造細胞生物学というこの新興分野の研究者が、多様な細胞培養、オルガノイド培養、あるいはモデル生物において、高分子複合体、オルガネラ、および細胞レベルでの細胞内3D構造を探索し、決定することが可能になります。このビデオを視聴することで、ご自身のデータセットに対して最適なセグメンテーション手法を選択し、適用する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Cell-ACDCを用いた多次元顕微鏡データの解析

我々は、最も反射光顕微鏡に合うように設計された低コストの低温ステージの製造を実証する。このラボに構築された極低温ステージには、低温光と低温電子顕微鏡との間の効率的かつ信頼性の相関イメージングを可能にします。...

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

学ぶ、3D電子顕微鏡データのセグメンテーション手法。手動・半自動・自動アプローチを比較し、データ特性に応じた最適な特徴抽出方法を選択する実用的なフレームワークを提供する。

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

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