Name: 脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学ぶ マウス胚の軸伸長と体節形成における3D・4D可視化と解析手法。光学投影断層法や全マウント免疫蛍光顕微鏡を用いて、神経中胚葉前駆細胞の動態を詳細に観察し、先天性奇形の研究と教育に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LuVeLuレポーター株のオリビエ・プルキエとアレクサンダー・オーレフラ、RapiClearテストサンプルのSunJin研究所、BigStitcherを使用した支援のHugo Pereira、ライブイメージング装置のセットアップを支援してくれたNuno Granjeiro、IGC動物施設、およびこの作業の過程で有益なコメントとサポートを提供してくれたMalloラボの過去および現在のメンバーに感謝します。
我々は、ポルトガル2020年パートナーシップ協定に基づき、欧州地域開発基金(FEDER)及びFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT, Portugal)を通じて、リスボン地域運用プログラム(Lisboa 2020)が共同出資する、ポルトガルの資金提供 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122及びref# PTDC/BII-BTI/32375/2017の支援を受けているIGCの先進イメージングファシリティの技術支援に感謝する。この原稿に記載されている研究は、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-030254(FCT、ポルトガル)およびSCML-MC-60-2014(サンタカーサダミゼリコルディア、ポルトガル)に助成金を支給し、M.M、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-022170、およびPhDフェローシップPD/BD/128426/2017からADへの助成金によって支援されました。

著者らは利益相反がないと宣言しています。

軸方向の伸長とセグメンテーションは、脊椎動物の胚発生中に起こる最も複雑で動的なプロセスの2つです。単一細胞追跡を伴う3Dおよび4Dイメージングの使用は、しばらくの間、ゼブラフィッシュおよびニワトリ胚の両方においてこれらのプロセスを研究するために適用されており、そのためにアクセス可能性および培養条件が複雑なイメージングを容易にする19、44、45、46、47、48、49.対照的に、マウス胚の中期および後期の器官形成段階は、例えばインタバイタルイメージング50においていくつかの進歩がなされているが、そのような詳細においてはあまり研究さ...

脊椎動物の体軸形成は、胚発生中に起こる非常に複雑で動的なプロセスです。胃形成の終わりに[マウスでは、胚発生日(E)8.0頃]に、神経中胚葉前駆細胞(NMP)として知られるエピブラスト前駆細胞のグループが、頭から尾への配列における軸延長の重要な駆動因子となり、頸部、体幹および尾部形成中に神経管および近軸中胚葉系組織を生成する1、2、3、4.興味深いことに、これらのNMPが尾側エピブラストで占める位置は、中胚葉または神経外胚葉に分化する決定において重要な役割を果たしているようです5。現在、NMPの正確な分子指紋は得られていませんが、これらの細胞は一般にT(Brachyury)とSox2 5,6を共発現すると考えられています。NMPの運命決定を調節する正確なメカニズム(すなわち、それらが神経経路をとるか中胚葉経路をとるか)は、正確に定義され始めたばかりである。原始的な筋状領域におけるTbx6発現は、NMP運命決定の初期マーカーであり、この遺伝子は中胚葉6、7の誘導および仕様に関与している。興味深いことに、初期の中胚葉細胞は高レベルのEpha18を発現しているようであり、Wnt/β-カテニンシグナル伝達、ならびにMsgn1もまた、近軸中胚葉分化およびソマイト形成において重要な役割を果たすことが示された9,10。単一細胞レベルでのNMPの完全な空間時間解析は、中胚葉の仕様を制御する分子メカニズムを完全に理解するために確かに役立つでしょう。
ソマイト(椎骨前駆体)の形成は脊椎動物の重要な特徴である。軸方向の伸長の間、近軸中胚葉はソマイトとして知られる一連の両側反復単位でセグメント化される。ソマイトの数と新しいセグメントの形成に必要な時間は、種11、12によって異なります。ソミトジェネシスは、前嚢内胚葉(例えば、Lfng)におけるNotch、WntおよびFgfシグナル伝達経路のいくつかの遺伝子の周期的発現によって観察され得る周期的シグナル伝達振動(「セグメンテーションクロック」として知られている)11、12を含む。ソミトジェネシスの現在のモデルはまた、各新しいソマイトの後縁の位置を定義するFgf、Wntおよびレチノイン酸シグナル伝達を含む一連の複雑なシグナル伝達勾配である「成熟波面」の存在を仮定する。したがって、「セグメンテーションクロック」と「成熟波面」との間の協調的な相互作用は、これらの重要な形態形成過程における摂動が胚致死性または先天性奇形(例えば、脊柱側弯症)の形成をもたらす可能性があるため、これらの椎骨前駆体モジュールの生成にとって基本的である13,14,15。
画像化技術、バイオイメージ解析方法およびソフトウェアにおける最近の大幅な進歩にもかかわらず、軸方向の伸長およびソミトジェネシスのほとんどの研究は、依然として単一/単離された2次元画像データ(例えば、切片)に依存しており、完全な多次元組織可視化を可能とせず、病理学的奇形(すなわち、突然変異による)と胚発生中に起こる正常な形態学的変化との間の明確な区別を複雑にする16。.3Dでのイメージングは、以前は標準的な2D法では同定されていなかった新しい形態形成運動をすでに明らかにしており17,18,19,20、脊椎動物のソミトジェネシスおよび軸方向拡張のメカニズムを理解するためのin totoイメージングの力を強調している。
マウス胚の3Dおよび4D顕微鏡、特にライブイメージングは技術的に困難であり、正確で意味のある時空間分析を可能にするために、サンプル調製、画像取得、およびデータ前処理中に重要なステップが必要です。ここでは、マウス胚のライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色のための詳細なプロトコールについて述べ、軸延長およびセグメンテーション中にNMPおよび中胚葉系細胞の両方を研究するために使用することができる。さらに、我々はまた、トトにおける3D可視化および染色体形成中の問題(例えば、骨癒合および脊柱側弯症)に起因する病理学的異常の定量化を可能にする、高齢胚および胎児の光投影断層撮影(OPT)のためのプロトコルについても記述する13,21,22。最後に、脊椎動物のセグメンテーションと軸方向の伸びの研究と教育における3Dイメージング再構成の力を示します。

<table><tbody><tr><td>アガロース低ゲル化温度</td><td>シグマ</td><td>A9414</td><td>胚の取り付けに使用(例:OPT用)</td></tr><tr><td>Amiraソフトウェア</td><td>サーモフィッシャー</td><td>-</td><td>商業用ソフトウェアツール</td></tr><tr><td>Anti-Brachyury(ヤギポリクローナル)</td><td>RおよびDシステム</td><td>AF2085 RRID:AB_2200235</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>Anti-Sox2(ウサギモノクローナル)</td><td>Abcam</td><td>ab92494 RRID:AB_10585428</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>抗Tbx6 (ヤギポリクローナル)</td><td>R & D システム</td><td>AF4744 RRID:AB_2200834</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>抗ラミニン111 (ウサギポリクローナル)</td><td>シグマ</td><td>L9393 RRID:AB_477163</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>抗ヤギ 488 (ロバポリクローナル)</td><td>分子プローブ</td><td>A11055 RRID:AB_2534102</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>抗ウサギ 568 (ロバポリクローナル)</td><td>サーモフィッシャー &nbsp;Scientific</td><td>A10042 RRID:AB_2534017</td><td>免疫蛍光ベン</td></tr><tr><td>ジルアルコール (99+%)</td> <td>(任意)</td> <td>-</td> <td>胚 (BABB の成分) の除去に使用 (BABB の成分)</td></tr>安<tr><td>息香酸ベンジル (99+%)</td> <td>(任意の)</td> <td>-</td> <td>胚の除去に使用 (BABB の成分)</td></tr> <tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>カバーガラス 20x20 mm #0</td> <td>(任意)</td> <td>-</td><td>100um厚</td></tr><tr><td>カバーグラス20x20mm#1</td><td>(any)</td><td>-</td><td>170um厚</td></tr><tr><td>カバーグラス20x60mm#1.5</td><td>(any)</td><td></td><td>-「スライド」</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩)</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>免疫蛍光法用</td></tr><tr><td>Drishtiソフトウェア</td><td>(オープンソース)</td><td>-</td><td>フリーソフトウェア</td></tr><tr><td>ツール EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>脱塩用</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJソフトウェア</td><td>(オープンソース)</td><td>-</td><td>フリーソフトウェアツール</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>NZYtech</td><td>MB01401</td><td>免疫蛍光法</td></tr><tr><td>ホイヘンス</td><td>ソフトウェア サイエンティフィック ボリューム イメージング</td> <td>-</td> <td>商用ソフトウェア</td></tr><tr><td>ツール HyClone 定義 胎児ウシ血清</td><td>GE Healthcare</td> <td>#HYCLSH30070.03</td><td>ライブ イメージング用</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液 30 %</td> <td>ミリポア</td><td>1085971000</td><td>クリア</td></tr><tr><td>イマリス ソフトウェア</td><td>ビットプレーン / オックスフォード インスツルメンツ</td><td>-</td><td>商用ソフトウェアツール</td></tr><tr><td>iSpacers</td><td>SunJin Lab</td><td>(さまざま)</td><td>調製物のスペーサーとして使用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>#25030&ndash;024</td><td>ライブイメージング媒体用</td></tr><tr><td>低グルコースDMEM</td><td>Gibco</td><td>11054020</td><td>ライブイメージング媒体用</td></tr><tr><td>M2 培地</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td>胚の解剖用</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>VWRC20847.307</td><td>脱水および再水和ステップ用</td></tr><tr><td>サリチル酸メチル</td><td>Sigma</td><td>M6752</td><td>胚の透明化に使用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>胚を固定するための溶液に使用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td> <td>#P0781</td><td>ライブイメージング培地</td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td>用<td>Biowest</td><td>L0615-500-RapiClear</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>SunJin Laboratory</td><td>RapiClear 1.52</td><td>胚をクリアするために使用</td></tr><tr><td>Secure-Seaハイブリダイゼーションチャンバー</td><td>Sigma</td><td>C5474</td><td>スペーサーとして使用準備</td></tr><tr><td>simLabソフトウェア</td><td>SimLabソフト</td><td>-</td><td>商業ソフトウェアツール</td></tr><tr><td>スライド、くぼみ凹面ガラス - 75x25 mm</td><td>(任意)</td><td>-</td><td>厚い胚をマウントします。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>免疫蛍光法</td></tr></tbody></table>

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

ソミトジェネシスは脊椎動物の胚発生の特徴である。長年にわたり、研究者は、エクスビボおよびインビトロアプローチを包含する幅広い技術を使用して、さまざまな生物におけるこのプロセスを研究してきました。しかし、ほとんどの研究は依然として2次元(2D)イメージングデータの解析に依存しているため、複雑な3D空間での非常に動的な相互作用を伴う軸の延長やソミトジェネシスなどの発生プロセスの適切な評価が制限されています。ここでは、マウスのライブイメージング取得、データセット処理、視覚化、および3Dおよび4Dでの解析を可能にし、これらの発生プロセスに関与する細胞(例えば、神経中胚葉前駆細胞)を研究することを可能にする技術について説明する。また、マウス胚における光投影断層撮影法およびホールマウント免疫蛍光顕微鏡(サンプル調製から画像取得まで)のためのステップバイステップのプロトコルを提供し、3D画像データを処理および視覚化するために開発したパイプラインを示します。これらの技術のいくつかの使用を拡張し、軸方向の拡張とソマイト形成(3D再構成など)の現在の理解を向上させるために使用できる、利用可能なさまざまなソフトウェア(フィジー/ ImageJ、Drishti、Amira、Imarisなど)の特定の機能を強調します。全体として、ここで説明する技術は、発生生物学における3Dデータの視覚化と分析の重要性を強調しており、他の研究者が脊椎動物の軸延長とセグメンテーションの文脈で3Dおよび4D画像データにうまく対処するのに役立ちます。最後に、この研究は脊椎動物の胚発生を教えることを容易にするための新しいツールも採用しています。

ライブおよび免疫蛍光イメージングの両方についてこの論文に示された代表的な結果は、20×1.0NAの水対物レンズ、960nmに同調された励起レーザー、およびGaAsP光検出器(Dias et al. (2020)43に記載されているように)を備えた2光子システムを使用して得られた。光学投影断層撮影は、カスタムビルドのOPenTスキャナ(Gualda et al. (2013)28に記載されているように)を使用して行われた。
ライブイメージング(4D解析) 軸伸長中のマウス胚におけるLuVeLuレポーター活性の代表的な分析を、「ライブイメージングのためのサンプル調製」のための記載されたプロトコールに従って得た(ステップ1.1;「3Dイメージングのためのサンプル調製」セクション、「ライブイメージングデータセットの前処理」(ステップ3;「画像データセットの前処理」セクション)および「Imarisを使用した3D可視化と解析」(ステップ4.4;「3Dレンダリン...

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

マウス胚における器官形成段階は、胚複合体構造の可視化が困難なため、部分的には研究が不十分である。このプロトコルは、軸延長およびセグメンテーション中のマウス胚の3Dおよび4D視覚化および分析を可能にする技術を記述する。この技術の主な利点は、研究者がマウス胚の複雑な構造を3D動的物体として研究し、示すことを可能にすることである。このプロトコルには、脊柱側弯症などの哺乳動物の椎骨および脊髄に影響を及ぼす先天性奇形の研究に使用できる技術が含まれています。これらの技術は、インビトロモデルシステムでも使用することができ、したがって、ヒト胚発生の研究を可能にする。ライブイメージングのために胚発生日8.25日目から胚発生日10.5日目の間にマウス胚を調製するために、摂氏37度で予め加温されたM2培地で胚を解剖する。清潔な鉗子を使用して卵黄嚢を静かに取り除き、新鮮なM2培地で胚を1回洗い流して、解剖中に生じた血液や破片を取り除きます。ライブイメージング手順の間、10%HyCloneで定義されたFBS、2ミリモルのL-グルタミン、および1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEM培地で、37°Cの加熱チャンバー内で胚をインキュベートし、5%の二酸化炭素環境で65%の酸素をインキュベートします。免疫蛍光顕微鏡用に同様の段階のマウス胚を調製するために、加熱されたM2を使用する代わりに、胚を低温PBSで解剖し、4%パラホルムアルデヒド中で固定する。テキスト原稿に記載されているように全マウント免疫蛍光染色プロトコールを実施した後、RapiClearを使用して組織クリアランスを達成することができる。まず、75×25ミリメートルの窪み凹面スライドガラスの中央に胚を置き、顕微鏡窪みスライド内のすべてのPBSTを除去し、200マイクロリットルの透明化溶液を加え、次いでスライド調製物を箱で覆う。光から10分間保護した後、胚が透明になり始めたら、透明化溶液を交換し、さらに20分間待つ。一方の側から始まり、他方に向かって静かに移動するカバースリップで胚を上回ってください。これで、サンプルをイメージングする準備ができました。サリチル酸メチルまたはBABBを使用して透明化する場合は、胚が100%メタノールで完全に脱水されていることを確認し、次に一連のBABBおよびメタノールを20%連続して濃度を増加させ、各ステップで20分間のインキュベーションを開始します。BABB ソリューションが 100% に達したら、新しいソリューション用に 2 つの追加変更を行います。サンプルの圧縮を避けるために、20 x 60ミリメートルの1.5枚のカバーガラススライドを準備して胚を取り付けます。薄い金属ワッシャーで作られたスペーサーを追加します。クリアした胚を、つまようじ、細かい綿の先端、またはパスツールピ

three-four-dimensional-visualization-analysis-approaches-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

タイムラプス共焦点イメージングは​​、胚発生を特徴づけるための有用な強力な技術である。ここでは、方法論を記述し、野生型では頭蓋顔面形態形成を特徴づけるとともに、PDGFRA、Smad5を、そしてSMO変異胚。...

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで  イメージングは​​、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。...

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。...

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

ここでは、標準化された一連の優れた眼溝を観察するプロトコルを提案する脊椎動物の目で最近識別される、進化的に保存されている構造。ゼブラフィッシュ幼虫を用いて形成と眼肺尖の閉鎖に寄与する要因を識別するために必要な技術を示します。...

優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化

ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。...

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。...

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

このプロトコルは、標準化された縫合糸拡張マウスモデルと3D視覚化方法を示し、引張力負荷下での縫合糸の機械生物学的変化と骨のリモデリングを研究します。...

縫合糸拡張マウスモデルにおける骨リモデリングのための3次元可視化技術

学ぶ マウス胚の軸伸長と体節形成における3D・4D可視化と解析手法。光学投影断層法や全マウント免疫蛍光顕微鏡を用いて、神経中胚葉前駆細胞の動態を詳細に観察し、先天性奇形の研究と教育に活用できます。

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

さらに動画を探す