脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

マウス胚における器官形成段階は、胚複合体構造の可視化が困難なため、部分的には研究が不十分である。このプロトコルは、軸延長およびセグメンテーション中のマウス胚の3Dおよび4D視覚化および分析を可能にする技術を記述する。この技術の主な利点は、研究者がマウス胚の複雑な構造を3D動的物体として研究し、示すことを可能にすることである。

このプロトコルには、脊柱側弯症などの哺乳動物の椎骨および脊髄に影響を及ぼす先天性奇形の研究に使用できる技術が含まれています。これらの技術は、インビトロモデルシステムでも使用することができ、したがって、ヒト胚発生の研究を可能にする。ライブイメージングのために胚発生日8.25日目から胚発生日10.5日目の間にマウス胚を調製するために、摂氏37度で予め加温されたM2培地で胚を解剖する。

清潔な鉗子を使用して卵黄嚢を静かに取り除き、新鮮なM2培地で胚を1回洗い流して、解剖中に生じた血液や破片を取り除きます。ライブイメージング手順の間、10%HyCloneで定義されたFBS、2ミリモルのL-グルタミン、および1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEM培地で、37°Cの加熱チャンバー内で胚をインキュベートし、5%の二酸化炭素環境で65%の酸素をインキュベートします。免疫蛍光顕微鏡用に同様の段階のマウス胚を調製するために、加熱されたM2を使用する代わりに、胚を低温PBSで解剖し、4%パラホルムアルデヒド中で固定する。

テキスト原稿に記載されているように全マウント免疫蛍光染色プロトコールを実施した後、RapiClearを使用して組織クリアランスを達成することができる。まず、75×25ミリメートルの窪み凹面スライドガラスの中央に胚を置き、顕微鏡窪みスライド内のすべてのPBSTを除去し、200マイクロリットルの透明化溶液を加え、次いでスライド調製物を箱で覆う。光から10分間保護した後、胚が透明になり始めたら、透明化溶液を交換し、さらに20分間待つ。

一方の側から始まり、他方に向かって静かに移動するカバースリップで胚を上回ってください。これで、サンプルをイメージングする準備ができました。サリチル酸メチルまたはBABBを使用して透明化する場合は、胚が100%メタノールで完全に脱水されていることを確認し、次に一連のBABBおよびメタノールを20%連続して濃度を増加させ、各ステップで20分間のインキュベーションを開始します。

BABB ソリューションが 100% に達したら、新しいソリューション用に 2 つの追加変更を行います。サンプルの圧縮を避けるために、20 x 60ミリメートルの1.5枚のカバーガラススライドを準備して胚を取り付けます。薄い金属ワッシャーで作られたスペーサーを追加します。

クリアした胚を、つまようじ、細かい綿の先端、またはパスツールピペットを使用して顕微鏡スライドに移します。その後、マウント媒体を1滴加え、別の同様のカバーガラスで覆い、溶融パラフィンでシールして、気泡を避けるために調製物をよりよく安定させる。カバースリップを片側に置き、徐々に静かに横にスライドさせ、必要に応じて培地を加えます。

これで、サンプルを顕微鏡で画像化する準備が整いました。Fiji/ImageJを使用して、イメージング後に胚を標準化された前後軸および背腹軸位置に再配置します。フィジーの画像内のデータセット サイズを縮小し、データセットを 200 MB 未満に縮小するために必要な X、Y、Z スケール値をスケーリングして挿入します。

[新しいウィンドウの作成]オプションがチェックされていることを確認します。次に、プラグインに移動し、3Dビューアを開きます。3D ビューアウィンドウ内で胚をクリックして選択すると、赤い 3D ボックスが表示されます。

このモードを使用する場合は、データセットの回転をマウスで制御します。胚の完璧な位置を確認したら、[編集]を選択し、画像を変換し、3D Viewerウィンドウで変換した画像をエクスポートします。さまざまな直交平面を調べ、画像に移動し、直交ビューを積み重ねて選択します。

胚が正しく配置されたら、3D ビューアウィンドウメニューを選択し、変換行列を編集、変換、およびマット拡張子を持つテキストファイルに保存します。Fiji/ImageJを使用してテキストファイルを開き、最初の2行を削除して再保存します。これにより、TransformJ プラグインと互換性のある変換マトリックスファイルが作成されます。

フル解像度データセットに切り替えて、操作プラグイン TransformJ および TransformJ アフィンを実行します。新しいウィンドウで、以前に保存した行列ファイルを参照して検索し、3 次 B スプライン補間を選択して等方的に再標本し、「OK」をクリックします。胚を適切に再配置した後、作成された空のスペースのほとんどをトリミングします。完全な Z 投影画像を実行するには、スタック、Z プロジェクトをクリックし、最大強度を選択します。

次に、XとYに胚全体を含む最小ROIを描画します。編集、選択、選択の復元、および画像を選択してトリミングをクリックして、元のデータセット画像ウィンドウに切り替えます。画像を選択してスタックを開き、ツールをクリックし、スライスリムーバーを選択して、削除する最初と最後のスライスを指定して、胚組織と交差しない最初と最後のスライスをトリミングし、増分を1に変更してください。必要に応じて、テキスト原稿の指示を使用して、さらなる解析と3D再構成を実行します。

より発達した胚の3D分析を行うには、胚発生日18.5の胎児を冷たいPBSで解剖し、余分な胚膜をすべて除去し、新鮮なPBSで胎児を数回洗浄して、解剖手順中に生成された血液および破片を除去する。PBSで作った4%PFAの胎児を摂氏4度で5~7日間固定する。胚をPBSで数回洗浄した後、10%メタノールに達するまで10%10連続して増加したメタノール溶液中でインキュベートすることによって胎児を脱水する。

各インキュベーションを室温のシェーカー上で25分間行う。次に、胎児を最初にメタノール中の5%過酸化水素中で1日間、次いでメタノール中の10%過酸化水素中で、胚がすべての天然色素沈着を失うまで最大3日間、振とう機上で別々に孵化させる。室温のシェーカー上で20分間インキュベーションするたびに、脱塩水中で逆メタノール系列で胚を徐々に再水和させ、次いで脱塩水で1回の洗浄につき30分間胚を3回洗浄する。

胎児を1%アガロースブロックに埋め込むには、50ミリリットルのプラスチックチューブまたはシリンジに溶融したアガロースを充填し、アガロースの垂直位置に胎児を置き、アガロースの凝固中に鉗子でこの位置を維持する。アガロースが完全にゼリゼライ化するために、ブロック付きの型を摂氏4度に30分間置き、胎児の入ったアガロースブロックを型から取り出し、士気をくじいた水を入れた容器に入れます。脱塩水またはPBSで希釈したメタノール濃度を10%上昇させて胎児を徐々に脱水を行い、メタノール濃度が100%に達するまでシェーカー上で室温で少なくとも45分間サンプルをメタノール濃度に保つ。

胎児をシリーズBABB溶液とメタノールで2.5時間、各濃度で2.5時間移動させ、100%BABBに達するまでBABB濃度を25%増加させることによって胎児をきれいにする。胎児が完全に透明になるまで、BABB溶液を毎日新鮮なものと交換してください。このプロセスには 3 ~ 5 日かかる場合があります。

接着剤を使用してクリアしたアガロースブロックをOPTスキャナのモーター軸に取り付け、光学系を調整して胎児全体の画像を取得し、完全な投影データセットの取得に進みます。4Dライブイメージング技術により、LuVeLuレポーター発現と胚発生日8.5 Snai1条件ノックアウト胚の動的解析が可能になります。前弯性中胚葉の正常なLuVeLuシグナルとともに、Snai1条件ノックアウト胚は、原始的な縞から生じる異所性膨らみにおいてLuVeLu発現を示す。

ホールマウント免疫蛍光アッセイは、潜在的なNMPおよび中胚葉分化の主要な調節因子の検出を可能にする。白と黄色の矢印は、変異型と野生型の胚の違いを強調しています。マウント全体の免疫染色の3Dレンダリングにより、研究における組織または構造の理解を深めることができます。

この場合、尾芽中の潜在的なNMPの位置を調査した。3D組織再構成は、マウス胚の形態学的欠陥を理解し、特徴付けるためにも重要である。3D再構成のインタラクティブな視覚化は、ユーザーフレンドリーな形式で構築することもできます。

たとえば、PDF ファイル内などです。これらの3D胚尾構造は、より一般的な聴衆に3Dモデルの力を説明し、脊椎動物の軸方向の伸長とセグメンテーションを教える研究に役立つように使用できます。最後に、OTP顕微鏡技術を使用して、より発達したマウス胚のtoto可視化における3Dが可能である。

アニメーション化されたレンダリングがここに示され、胎児の18.5日目の胎児の主要なスライスが強調表示されています。覚えておくべき最も重要なことは、結果は胚で観察されるものの忠実な表現のままでなければならないということです。研究者はこれらの方法を使用して、画像に静的な表示だけでなく、ビデオ、3次元再構成、さらにはデータのインタラクティブな3Dモデルを含めることもできます。