Name: 肝転移の前臨床マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶヘミスプレン注射法を用いた膵がん肝転移の前臨床マウスモデル構築法。生存モニタリングと画像診断で転移進行を評価し、新規治療薬の開発に活用可能な信頼性の高いモデルを確立します。

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KFとKOはKSと一緒に共同最初の著者である この作品は、ジョンズホプキンス医学部臨床科学者賞（LZ）、Viragh財団とジョンズ·ホプキンス大学をスキップViragh膵臓がんセンターは（EMJ、NIH K23 CA148964-01（LZ）、AHPBAフェローシップ（KS）によって部分的にサポートされていましたし、 LZ）、国立膵臓財団（LZ）、Lefkofskyファミリー財団（LZ）、胃腸癌のP50のCA062924（EMJ、LZ）、ラストガーテン財団（LZ）、およびソルゴールドマン膵臓がんセンター助成金のNCI SPORE（KS 、BHE、LZ）。

全ての動物実験は、ジョンズ·ホプキンス大学の動物実験委員会のガイドラインに適合し、動物を研究室のケアの評価と認定協会（AAALAC）のガイドラインに従って維持した。外科的処置は、毎時15空気交換の最小値を受け、手術室で、無菌条件下で行われる。すべての商品は、手順の間に、各マウスの間に70％エタノールで前の手順で、もう一度オートクレーブで滅菌されています。外科手術を生き残るために期待されていない全てのマウスは、麻酔下で、依然としてながら頸椎脱臼に続いて3分間、CO 2の下で安楽死させる。 1。細胞調製<ol><li> 2×10 7細胞/ mlで、リン酸緩衝生理食塩水で培養されたPanc02細胞を再懸濁し、そして氷上に保つ。 </li></ol> 2マウスの準備<ol><li>ケタミンの管理腹腔内分割用量で8〜12週齢のC57BL / 6雌マウスへの電子（100mg / kgの）キシラジン（10mg / kg）を混合した。 </li><li>つま先ピンチ引っ込め反射がマウスが完全に麻酔をかけていることを確実にするために廃止されていることを確認してください。 </li><li>完全にマウスを麻酔するために、必要に応じて（100mg / kgの）キシラジン（10mg / kgの）と混合ケタミンの追加の用量を投与する。 </li><li>マウスは麻酔下にある間、乾燥を防ぐために、マウスの眼にPuralube獣医軟膏を適用します。 </li><li>創傷の汚染を回避するために、マウスの手術領域を剃る。 </li><li>準備は、ヨウ素を70％エタノールで切開の肋骨下の領域を離れ、。 </li><li>無菌性を維持するために腹部に外科用ドレープを配置します。 </li></ol> 3開腹<ol><li>経皮、メスを用いて腹膜を介して左耳に沿って、左肋骨下の切開を加えます。 </li><li>同時デジタルPを適用することにより、切開部を通して脾臓エクスプレス切開の頭蓋および尾側の側面に沿って案内圧力スイッチ。 </li><li>脾臓の下端で脾臓の血管の位置を確認します。 </li><li>脾臓の極での脾臓の血管を損傷しないように注意しながら、脾臓の中心部に2ホライゾン中型結紮クリップを配置することによって、脾臓を割ります。 </li><li>汚染を避けるために戻って腹膜に脾臓の上極を配置します。 </li></ol> 4。腫瘍注射<ol><li> 26 Gのx 5/8 &quot;注射器の中にリン酸緩衝生理食塩水を150μlを描画します。 </li><li>注入時に常に直立位置に注射器を維持し、同じ注射器にPanc02100μlの（2×10 6）細胞を描画します。 </li><li> 70％エタノール溶液中に針を浸し。針は、無菌性を確保するために70％エタノールに浸漬する。 </li><li>注射器が常に直立させていることを確認されて露出した半脾臓にゆっくりと細胞を注入する。 syrinのベベルGEは脾臓で細胞を注入することを避けるために、脾臓カプセルを通じて常に観察されるべきである。脾臓や血管のホワイトニングは、注入時に観察されるべきである。 </li><li>脾臓を昇格し、脾臓の血管を閉塞するために、脾臓で1メディアホライゾンクリップを適用します。 </li><li>膵臓と脾臓血管の最も遠位の側面に小さなホライゾンクリップを適用します。 </li><li>ホライゾン·クリップの上にカットして半脾臓から膵臓と脾臓血管を連結する。 </li><li>その &#39;側にマウスを置き、蒸留水で切開を灌漑。 </li></ol>麻酔から5。腹部閉鎖およびリカバリ<ol><li> 4-0ランニングステッチで腹膜を閉じます。 </li><li>皮膚切開を閉じるために二から三の皮膚クリップを適用します。 </li><li>手術後の痛みを緩和するためには0.1mg / kgのブプレノルフィンまたは5〜10ミリグラム/ kgのカルプロフェンを皮下投与する。 </li><li> RECのための加熱パッド上でマウスを置きますオーヴェリーモバイルまで、とマウスは、通常の呼吸パターンを示しています。動物は、唯一の完全外科的手順から回復した後、他の動物の会社に戻ります。 </li></ol> 6。剖検審査及び肝臓の収穫<ol><li>手術後30〜60日の間、マウスは転移の臨床症状を示すように開始され、安楽死が必要になります。人道的な安楽死を必要とする転移性疾患の徴候は拡大された腹部および腹水の開発が含まれています。 CO 2の吸入によりマウスを安楽死させる。 </li><li>吸入後、頸椎脱臼を行います。 </li><li>動物は非反応性であることが決定された後、ハサミを使用して腹部を露出させるために腹膜を通って切開する。 </li><li>鉗子やハサミを使用して、静かに腹部から肝臓を切った。 </li><li> OCT化合物中の肝臓および液体窒素を用いたフラッシュ凍結を配置します。 -80℃で肝臓に保管してください。代わりに、ライブrは、埋め込まれた24時間およびパラフィンをRTで16％中性緩衝ホルマリンで固定することができる。 </li></ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Facts+%26+Figures%22">Cancer Facts & Figures</a>. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).</li>
<li>Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+pancreatic+adenocarcinoma%3A+insights+from+genetically+engineered+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer.</a> Cancer letters. 279, 1-7 (2009).</li>
<li>Rhim, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+dissemination+precede+pancreatic+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation.</a> Cell. 148, 349-361 (2012).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Corbett, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+chemotherapeutic+response+of+two+transplantable+ductal+adenocarcinomas+of+the+pancreas+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice.</a> Cancer research. 44, 717-726 (1984).</li>
<li>Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+depletion+of+regulatory+T+cells+allows+the+recruitment+of+mesothelin-specific+CD8+T+cells+to+the+antitumor+immune+response+against+a+mesothelin-expressing+mouse+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma.</a> Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+a+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-transduced+tumor+vaccine+and+systemic+interleukin-2+in+the+treatment+of+murine+colorectal+cancer+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases.</a> Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+antitumor+immune+responses+with+engineered+live-attenuated+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes.</a> Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+Listeria+monocytogenes+effectively+treats+hepatic+colorectal+cancer+metastases+and+is+strongly+enhanced+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells.</a> Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).</li>
<li>Olino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+antigen+expressing+Listeria+monocytogenes+induces+effective+primary+and+memory+T-cell+responses+against+hepatic+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases.</a> Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer cell. 7, 469-483 (2005).</li>
<li>Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+evaluation+in+high-frequency%2C+40+MHz+imaging%3A+a+comparative+study+of+four+vector+velocity+estimation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics%22%5BJournal%5D)">Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods.</a> Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+23+phosphorylation-dependent+cell-surface+localization+of+annexin+A2+is+required+for+invasion+and+metastases+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer.</a> PloS one. 6, e19390(2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは利害の関係する競合はありません。

半脾臓注入技術を経由して肝臓への膵臓癌転移のこの前臨床マウスモデルでは、肝臓への転移性疾患を有する患者の臨床的および免疫学的条件の多くを反映して説明した最初のモデルである。このモデルは、他のマウスモデルに比べていくつかの利点を提供しています。まず、膵臓癌のトランスジェニックモデルとは異なり、マウスのわずか30％が肝臓に転移を発症したおよび転移形成のタイミングは非常に可変であり、このモデルはαで100％のマウスにおいて一貫して肝臓に転移し得るという利点を提供均一な時間は、この設定に転移性疾患を研究するために研究者を可能にする。さらに、このモデルでは、再現可能なモデルでは、末梢血免疫分析を可能にする素朴な半脾臓を保持します。さらに、抗新生物療法の非存在下で、マウスは、最初の腫瘍負荷に応じて一貫性のある時点で腫瘍の進行により死亡し、生存率が一貫している一つの実験から次へ。最後に、このモデルは、肝転移13、腫瘍免疫学10、及び実験的治療試験9の研究などのさまざまなアプリケーションを有している。 この技術の重要なステップは、細...

膵管腺癌（PDA）は、米国1における癌関連死の第四の主要な原因である。転移性PDAと患者のための5年生存率2-12％1です。膵臓癌のアジュバントおよびネオアジュバント化学療法はこれまで以上に、今日より効果的であるが、まだ新しい治療法のための絶望的な必要性が残っている。 新規治療薬の開発は、信頼性の前臨床動物モデルを必要とする。皮下腫瘍モデルを使用して簡単ですが、その欠点は、ヒトの癌で見られる腫瘍の進行および微小環境を転移し、模倣するこれらの腫瘍のできないことがあります。そのようなKrasのとp53ノックイン発癌性変異（KPCモデル）2とYFP系統トレーサー（PKCYモデル）とKPCモデルを含む遺伝子操作されたマウスなどの遺伝子操作されたモデルは、3 immunocompeteにおける自然発生腫瘍の研究を可能にntのマウス。加えて、腫瘍微小環境は変更され、より厳密にヒト腫瘍進行に見られるものに似ている。残念ながら、腫瘍発生のタイミングが困難実験的治療を研究することができ、これらのモデル内の変数である。さらに、これらのマウスの戻し交配は、常に実行可能ではない時間と財務コミットメントのかなりの量を必要とする。最後に、注入された異種移植のPDAマウスモデルは変更した免疫不全マウス、または存在しない腫瘍微小環境を必要とする。その結果、これらの前臨床モデルにおいて実証実験的治療の有効性は、多くの場合、ヒト臨床試験4において再現性がない。 このhemisplenectomyマウスモデルは、C57BL / 6マウス5、6から誘導される高度に腫瘍形成、メチルコラントレン誘発性膵臓腫瘍細胞株であるPanc02腫瘍細胞を利用する。さらに、他のネズミPDA細胞株は、KPCマイクから誘導eは、このモデルで使用することができる。 Schulick らは以前にhemisplenectomy技術を開発し、大腸癌転移7の同系マウスモデルを作成しました。このhemisplenectomyモデル（ 図1）は、新規の治療薬7-10の研究に自分自身を貸す免疫応答性マウスにおいて、一貫して同じ腫瘍接種を提供しています。

<table><tbody><tr><td>細胞培養培地と成分</td><td></td><td></td><td>は細胞株によって異なります</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ライフテクノロジーズ社 ギブコ</td>社 <td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>15ml遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>湾曲手術用ハサミ</td><td>ロボズサージカルストア</td><td>RS-6835</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>解剖 グレーフ鉗子</td><td>ロボズサージカルストア</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー (レギュラー)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 または 4-0 縫合</td><td></td><td></td>糸 <td>提供:外科部門、ジョンズ・ホプキンス</td></tr><tr><td>ウェック ホライゾン オープン ライゲーティング クリップ アプライヤー、小型、角度付き</td><td>テレフレックス</td><td>137085</td><td></td></tr><tr><td>ウェック ホライゾン オープン ライゲーティング クリップ アプライヤー、ミディアム、アングル</td><td>テレフレックス</td><td>237115</td><td></td></tr><tr><td>Weck Horizon 中型結紮クリップ</td><td>Teleflex</td><td>002200</td><td></td></tr><tr><td>Weck Horizon 小型結紮クリップ</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1 cc、TB シリンジ、3/8" スリップチップ</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1 cc、TB シリンジ、5/8" スリップチップ</td><td>Becton Dickinson</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>9 mm オートクリップ アプライヤー</td><td>Mikron</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>9 mm オートクリップ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>サンビーム</td><td>CAT93</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td>多数のベンダーが販売</td></tr> ケ<tr><td>タミン塩酸塩&nbsp;</td><td>ホスピーラ</td><td>22395DD</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>X1251</td><td></td></tr></tbody></table>

肝転移の前臨床マウスモデル

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

多数のマウスモデルは、ヒト癌を研究し、癌治療及び開発の理解を進めるために開発されてきた。ここで、同系マウスの膵臓腫瘍細胞の半脾臓注射を介して、肝転移の前臨床マウス膵臓腫瘍モデルについて説明する。このモデルは、肝臓への転移性疾患を有する患者における臨床症状の多くを模倣。マウスは、一貫して転移過程、実験的治療試験、および腫瘍免疫学研究の調査を可能に肝臓への転移を開発しています。

半脾臓に注入Panc02腫瘍細胞技術が正しく行われた場合、肺および腹膜転移が観察されない一方（ 図1）マウスの100％においてフォームの肝臓転移、。この技術は、複数の独立した実験においてPanc02細胞を使用して100以上のマウスに対して行われており、再現性、すべての未処置のマウスはhemisplenectomy手順（ 図2）以下の30と60日の間の肝転移で死亡する。未処理および処理群の間の統計的有意性を得るためには、グループ当たり10匹のマウスが必要とされている。しかし、この数は、使用される細胞株および治療方式に関して変化するであろう。 Panc02細胞は、このモデルで使用される場合、複数の肝転移は剖検（ 図3）上に観察することができる。 組織特異的Krasのおよびp53有するトランスジェニックマウス由来の同系膵臓腫瘍細胞株であるKPC腫瘍細胞、ノックイン変異は図11に示すように、このモデルで使用することができる。類似した肝転移におけるこれらの細胞の結果を使...

肝転移の前臨床マウスモデルは、半脾臓注入技術を介して行う。

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

本手順の全体的な目的は、半脾臓法を用いて、肝転移を伴う膵癌の前臨床ミラーリングモデルを作製することである。まず、培養したpan O2腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を作製する。次に、十分に麻酔をかけたマウスの脾臓を露出させ、分割する。次の手順は、腫瘍細胞を片側の脾臓に注入し、注入した脾臓を摘出することです。最後のステップは、腹部を閉鎖し、マウスを麻酔から回復させることです。最終的に、生存率のモニタリング、それに続く肝臓の剖検、および追加の非侵襲的イメージングによって、転移性疾患の進行における差を示す結果を得ることができます。これらの手法は、転移プロセスの主要因の特定、新規治療薬の試験、腫瘍免疫学研究の実施など、がん研究分野における重要な課題の解決に寄与します。免疫能を有するマウスに同一の腫瘍細胞を接種すると、一貫して腫瘍が形成され、一定の時点に達するため、本手法の意義は膵がんの治療へと広がります。手術の準備を行う前に、PBSで20 million cells/mLに調整したpanco two細胞を氷上に準備しておきます。次に、8〜12週齢のC 57 black 6系統の雌マウスを麻酔します。薬剤を分割して投与し、反射を確認してマウスが十分に麻酔されていることを確認してください。必要に応じて追加投与を行い、眼軟膏で目の保護をした後、腹部の除毛を行います。除毛後、70% ethanolとヨードで交互に擦るようにして皮膚を洗浄します。次に、マウスをドレーピングします。メスを用い、左耳のラインに合わせて皮膚および腹膜を切開し、左肋下切開を開始します。次に、切開線の頭側と尾側から同時に指で圧迫し、脾臓を切開口から露出させます。脾臓が見えたら、その下端にある脾血管を確認してください。続いて、脾臓を切り離します。中心部に中サイズの結紮クリップを2個、水平に配置します。脾極にある脾血管に注意してください。これらの血管は損傷しやすいです。次に、コンタミネーションを防ぐため、脾臓の上極を腹腔内に戻します。腫瘍細胞の注入準備として、まず26ゲージ 5/8インチのシリンジに150 µLのPBSを吸い取ります。その後、氷上で準備した100 µLのPanko 2細胞を同じシリンジに吸い取ります。注入前に層が混ざりすぎないよう、シリンジを垂直に保持したまま、針を70%エタノール溶液に浸します。その後、シリンジを垂直に立てた状態で、露出した脾臓の半分にゆっくりと細胞を注入します。脾臓の下にある細胞が損傷しないよう、脾被膜越しにシリンジの針先の面取り（ベベル）を確認してください。注射により脾臓が白くなるはずです。次に、脾臓を挙上し、脾血管を遮断するために脾臓の下に中型のホライゾンクリップを1つ装着します。その後、膵臓および脾血管の最も遠位側に小型のホライゾンクリップを装着します。クリップを装着した後

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