Name: 人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 学ぶ多電極アレイ録音法でてんかん術後の人間皮質組織から発作間期活動と発作様事象を記録する方法。抗てんかん薬の効果と神経膠細胞の役割を解明し、薬剤耐性のメカニズム理解に貢献する。

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この作品は、ANR（プログラム·ブランニューロ）、FRC（ラ·ルシェルシュシュルルCerveauを注ぐ連盟）からの助成金によってサポートされていました、パリ（プログラム創発）市、INSERMとNeuropôleデからNRにラPitiéSalpêtrière病院（トランスレーショナル研究契約）、 GHに対する大学ピエール·マリー·キュリーUPMC（プログラムコンバージェンス）から研究所デュCerveauらエラa Moelleのepiniere（パリ）からのEDへルシェルシュFrancilien（NERF）、

注：ここに記載されているプロトコルは、フランスの「諮問委員会国立D&#39;Ethique」のガイドラインに従っており、INSERMによる収集活動として宣言されています。 人間のてんかん組織の1切除<ol><li>患者<ol><li>難治性てんかんを患っている患者からの脳組織を得る。手術前に書面によるインフォームドコンセントを得る。 </li><li>すべてのてんかん患者は神経学的検査、神経心理学的評価、表面EEG、および神経画像を含む広範囲な術前精密検査を行う操作し、切除した組織の手術後の組織学的検査に続いて（MRI、時には18 FDG-PETスキャン図1A）、（図1B） 。注：多様な探査は、同様に発作発症ゾーンをローカライズする際、その除去の利点は、手術のリスクを超えた場合に手術が示されている。 </li></ol></li><li>手術<ol><li>マイ手術前に抗てんかん薬をntain。全身麻酔下で手術を行う：静脈内フェンタニルとメンテナンスが続く吸入セボフルラン（6％納入比率とO 2 100％、吸入性画分）、静脈内フェンタニル（0.3μgの/ kg）及びantracurium（0.5 mg / kgを）による誘導を、 （0.5μgの/ kg /時間）および吸入セボフルラン（1 MAC）。 </li><li>病変皮質（ 図1C）の正確な局在を可能にするためにニューロナビゲーションシステムを使用してください。皮膚切開した後、高いスピルドリルで開頭術に続いて骨にバーホールを行う。そっと骨弁を昇格し、ハサミ（ 図1D）で硬膜を開きます。 </li><li>手術用顕微鏡下での異常な皮質の同定、および顕微楽器や超音波吸引を容易にするために、術中超音波を使用してください。 </li><li>脳溝制限に従ってPIO-くも膜面を凝固させるとカット。 rに軟膜下解剖を使用してくださいエリーズ病変領域の周りPIAから皮質。 </li><li>血管系をできる限り温存、切除 &quot;一括&quot;ワンピースを実行するために異常な皮質下の白質をカットします。皮質の外傷性の操作は避けてください。 </li><li>溝底と過渡的な皮質を含む軟膜表面に直交する方向に沿って切除組織の外に1cm厚のスライスをカット。 </li></ol></li></ol>スライスの準備、インキュベーションおよび録音2.人工脳脊髄液（ACSF） <ol><li>スライス標本用ACSF <ol><li> （単位：mm）を含む、スクロースベースのACSF 7,8 1Lのを準備します：250スクロース、3のKCl、25のNaHCO 3、10 D-グルコース、1のCaCl 2、10のMgCl 2;脱イオン水中でこれらの塩を溶解し、少なくとも10分間、カルボゲン溶液に酸素。 </li><li> （15〜20分間、または-150℃）で50〜60分間-80℃でスクロースACSFの〜700ミリリットルを入れてください。残りの部分を保つ氷で酸素下で溶液。 NOTE：スライスを調製するためのACSFを4℃で保存することができる。この場合には、これを冷却する前に、実験の日のCaCl 2およびMgCl 2を加える。 </li></ol></li><li>スライスインキュベーションおよび記録用ACSF <ol><li> （単位：mm）を含む、記録ACSF 7,8の少なくとも3リットルを準備します：124のNaCl、NaHCO 3で3のKCl、26、10 D-グルコース、1.6のCaCl 2、1.3のMgCl 2;脱イオン水中でこれらの塩を溶解し、カルボゲン溶液に酸素。のMgCl 2を追加する前に、0 Mg 2+を ACSFで録画を実行するために、いくつかのACSFを保つ。注：インキュベーション/記録ACSFは4℃で保存することができる。この場合には、CaCl 2およびMgCl 2を 、実験の日を追加。 </li></ol></li></ol>スライスインキュベーションおよび録音3.機器<ol><li>スライスインキュベーションのためのインターフェース室<ol><li>スライスex vivoで生きて維持するために、脳切片室を使用してください&lt;インタフェースモードで/ em&gt;の。注チャンバは加熱及びセンサ素子とセラミックバブラーを含み、蒸留水で満たされている下側部分、及び上部から構成され、スライス内の平坦な領域に水晶体組織のシート上に載るチャンバの中心（ 図2A - B）。 </li><li> preoxygenated ACSFがチャンバに入る介して2つの別々の細かいPTFEチューブを使用します。注意：チューブが加熱された水は渦巻きチャンバの上部に到達する。次いで溶液を、出口ウェルに溶液を搬送する水晶体組織との毛管作用によって出る。 </li><li>インターフェース室のPTFEチューブはpreoxygenated媒体とスライスの連続灌流を可能にするために、蠕動ポンプに接続します。 </li><li>セラミックバブラーにカルボゲン（95％O 2および5％CO 2）で酸素化することにより、高酸素圧を維持する。注：これは温め、加湿ガス混合物が到達する適切な穴を介してチャンバの上部にスライス。 </li><li>チャンバの加熱素子と、一端に外部温度センサのためのコネクタを有する、特殊なダブルエンドケーブルを介して、温度制御、チャンバを接続することにより、チャンバの上部の温度を維持する。インキュベーション（ 図2C）全体の温度をチェックするために、スライスの近くにセンサーを配置します。 </li></ol></li><li>多重電極アレイ記録<ol><li> 200μmの中心間間隔を有する12×12マトリクス状に配置された窒化ケイ素及び内部参照電極と絶縁された120窒化チタン電極（直径30μm）を用いて平面マルチ電極アレイを使用する。注：異なる電極直径及び間隔を有する他の構成も可能である。具体的には、MEAチップは、人間の組織の大きなスライスをサンプリングするために広げることができる。 </li><li> （前とFiのMEA2100-120システムを使用して10kHzで電気信号を取得する専用ソフト（MC_Rack）を介して統合されたデータ収集およびアナログデジタル変換器、16ビットのデータ分解能、ソフトウェアを介して調整可能な入力電圧範囲および帯域幅）とLTERアンプ。注：MEA2100ヘッドステージを連続的に記録セッションを通してスライスを灌流する、磁気ホルダーを通して加熱可能な灌流要素の固定のための金属板から恵まれている。 </li><li>スライスと電極との間に良好な電気的結合を確実に小さな自家製プラチナアンカー、によってMEAに組織を押したままにします。 </li></ol></li></ol> 4.インターフェイス商工の調製と解剖とスライスするためのツール<ol><li>インターフェース室<ol><li>蒸留水でインターフェース室の下部を埋める。水のレベルは完全に発熱体を浸漬し、チャンバの下部と上部セクションとの間の接合部、下記2〜4ミリメートルであることを確認してください。毎日の加熱に切り替える前に、このレベルをチェックし、発熱体の損傷を回避するためである。 </li><li>ガス圧の微調整のための二次流れのレギュレータに恵まれカルボゲン源にチャンバーを接続してください。 </li><li>スライス室の平らな面積を合わせるためにレンズティッシュのシートをカットし、スライスに到達する前に、入力ラインから任意の気泡を逃がすために、入力されたソリューション管に近いそれを配置します。 </li><li>レンズ組織片である限り本鎖木綿糸を2枚カットし、室内の平らな領域の主要な側面に沿ってそれらを配置します。注：これは、わずかにチャンバー内の灌流液レベルを上げるのに役立ちます。 </li><li> 1ml /分で蠕動ポンプの流量を設定し、ポンプを作動させる。 </li><li>チャンバーの下部に水の酸素化を開始します。 </li><li> 37℃の温度コントローラの温度を設定し、それをオンに。パラフィルム片とのインターフェース室の上部を覆い、temperatために少なくとも30分待っUREが増加し、安定させる。 </li></ol></li><li>解剖とスライスするためのツール<ol><li> 2本の細いピンセット、へら、小さなスプーンとブレードからなる解剖キットを準備します。二枚のガラスペトリ皿、2つのブラシと同様にシアノアクリレート接着剤。 </li><li>ビブラトームのパラメータを設定します。厚さは、400μmである。周波数、70から90 Hzの。振幅は、0.9〜1ミリメートル、スピードさ0.1mm /秒。 </li></ol></li></ol> 5.人間の皮質スライスの準備<ol><li> -80℃の冷凍庫からショ糖ベースのACSFを削除し、スラッシュのようなものを得るためにそれを混ぜる。組織を得るために、病院の手術室に通いながら、カルボゲンでそれに酸素をガラス瓶に〜250ミリリットルを入れて、氷で満たされたデュワー瓶に保管してください。一方、-20℃で休息を保つ。 注：手術中、神経外科医は、皮質組織の小さなブロックを解剖。直ちに研究室に転送するために、氷冷スクロースACSFでサンプルを置く。 </li><li> 30分を上限とする研究室への病院からの転送に必要な時間を保つ。研究室では、スラッシュを持っているためにそれを混ぜて、-20℃の冷凍庫からショ糖ベースの酸素ACSFを取るペトリ皿とビブラトームバッファトレイを記入し、カルボゲンで両方酸素化を開始。慎重にスプーンで瓶からヒト組織の一部を取り出し、ペトリ皿（ 図2D）に入れて。 </li><li>鉗子を使用して、慎重にスライスする時の抵抗を避けるために、血液凝固、血管や髄膜を除去します。皮質表面を傷つけないよう注意を払って、組織ブロックの側面から開始し、PIA-問題で成る、髄膜を除去します。ブレードを用いて、ビブラトーム試料プレート上に接着される、平坦な表面を得るために、組織の側面を切断する。注：髄膜は、PIA-問題で成る、皮質表面を傷つけないよう注意を払って、組織ブロックの側面から始まる削除されます。 </li><li> TIのブロックの場合ssueは、MEA室よりも大きい、試料プレート（ 図2E）上に接着する前に、適切な寸法の部分をカット。 </li><li>横皮質スライスを得るために、組織を接着バッファトレイに入れ、低速（0.1ミリメートル/秒）（ 図2F）で厚さ400μmのスライスを切った。 </li><li>スライス寸法のレンズ組織片をカット。へらやブラシで、これらのレンズの組織上のスライスを転送し、録音します（ 図2G - I）を開始する前に、少なくとも1時間、37℃でインターフェース室でそれらをインキュベートする。継続的に使用するまで同じ条件でスライスを格納します。 NOTE：レンズペーパー上のスライスを配置すると、スライスの下側の灌流及び記録前インターフェース室からスライスの除去の両方を容易にするために重要なステップである。 <ol><li>レンズ組織上のスライスを転送しながら、非常に慎重にそれらを管理する、と皮質層領域に触れることを避けブラシ。 </li><li>スライスを一つずつ用意し、直ちに適切な酸素供給及び温度を確保するために、インターフェース室にそれらのそれぞれの転送。可能な限り迅速に切除した組織のブロックをスライスする。 </li></ol></li></ol>録音用のMEAのセットアップ6.準備<ol><li>コンピュータへの蠕動ポンプと、MEAシステムに灌流システムを接続します。記録ACSFに酸素を。アンプ内部の空のMEAチップを置きます。 </li><li> MEA室中で37℃に達する5-6 ml /分で灌流を開始するために加熱カニューレ要素のための温度コントローラを設定する。注：これは、室温及び流量に応じて、所望のものよりも3~4°Cより高い温度に設定することが通常必要である。 <ol><li>電極面積に触れることなく、中心に最も近い可能性、それを置くこと、細かい温度計をMEAチャンバー内の温度を確認してください。 </li></ol></li><li> softwarの記録を開始eとは、全てのMEA電極が十分に接続されていることを確認し、潅流に起因するノイズが存在しないこと。 </li><li>カメラテーブルの機能をチェックするためにMEA_Monitorを起動します。 </li></ol>記録のためのMEAチップへのインターフェース室からスライス7.譲渡<ol><li>一部はガラスシャーレにACSFを記録温め注ぐ。鉗子で、水晶体組織を介してつかむことにより、インターフェース室からスライスを取り、ペトリ皿に入れる。慎重に組織からのスライスを切り離す。インターフェースチャンバー内の溶液のレベルは注意深くインキュベーション時間中に調整された場合、スライスは、溶液中に浸すことにより、水晶体組織から離脱する。それ以外の場合は、剥離を容易にするために、小さなブラシを使用しています。 </li><li>いくつかのACSFで、MEAチップを記入し、スパチュラで、そこにスライスを移す。プラスチック製パスツールピペットを用いて、そっとスライスは電極面積に付着させると白金ANCHで適所にそれを維持する溶液を除去または。 、記録ACSFの1ミリリットルを追加し、アンプへのMEAチップを配置5-6 ml /分で灌流を開始します（ 図2J - L）。 </li><li> MEA_Monitorを使用することにより、MEA記録領域上のスライス位置を確認し、必要であれば、皮質層から記録し、写真を撮るために、それを調整します。録音を開始します。 </li></ol>

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Pharmacoresistantてんかんは、in vitroでのヒト組織で検討することができる稀な状態です。これは、部分的に、動物モデルで再現されている特定の欠陥を表示てんかんヒト皮質を研究することができる。ここで説明する方法は、彼らが自発的にてんかん活動を生み出すように、保存細胞の生存およびネットワークとex vivoで人間術後の組織を準備し、記録することができます。 生体内に記録されているものよりも同様の活動を維持することは、病理学的活動の起源のメカニズムを研究することが重要である。さらに、このような方法は、ヒト組織を探索できるようにし、疾患の非完全な動物モデルを避ける。しかし、ヒト組織を研究することは脳神経外科医と実験室間の同期を必要とします。組織輸送は外傷性ではないと具体的な注意が必要です。また、試料の量と組織の両方が限られている。最後に、適切な対照組織へのアクセスが舞ですn個の懸念。この準備で、術後の組織は自然に正常なACSF 7,8-で発作のような放電を作り出す。発作開始および発作状態から発作への移行のメカニズムを調査することができるように、発作のようなイベントはまた、修飾、proconvul​​sive ACSF中で誘発することができる。 ヒト組織は、インターフェース条件で最大10時間生存可能に維持することができる。マルチユニット活動またはフィールド電位が自然に観察されたとき、そのような活性は細胞外カリウムの増加および/またはマグネシウムの減少を介して興奮性を増加させることによって誘発されたときのスライスが実行可能と考えられた。活動の変動が発生するが、おそらく病理および皮質領域の違いを反映して、我々は唯一の自発的な発作を示す健全なスライス組織のてんかんの特徴を探求し、発作放電を誘発。組織活力及び活性を維持するために、インターフェース室をtを格納するために使用され彼は、MEAシステムで記録する前に、回復のために36-37℃でスライスする。実際、いくつかのグループが明らかにこのような自発的な鋭い波形のリップルまたはコリン作動性誘発される振動9,10のような標準的なビーカーストレージとネットワーク活動の保存のための温度の重要性と比較して、インターフェイスベースのストレージシステムの利点を実証している。スライスのインタフェース·ストレージは、以前に、ヒト海馬およびsubicularスライス1,11からのてんかん性活動を記録するために使用されてきた。現在のMEA技術では、インタフェースの状態にスライスからの回復期間の後、ネットワーク活動は、MEAシステムと、37℃で高流量（5〜6 ml /分）の存在下で、水没状態で記録されている。小容積室（&lt;1.5 ml）を画定するMEAチップの小径（1.8g cm）は、共に増加した流量で、自発的およびPHAのための重要な因子であることが実証されているスライスの酸素供給を向上させるrmacologically誘発のネットワーク活動9,10。さらに、循環ACSFの減少量は、薬理学的なテストを容易に。 スライス手順しかし、組織12のための外傷である。ニューロンのアーキテクチャと塩化恒常性の両方が組織表面（50ミクロン）で摂動されているようである。深く浸透することなく、大部分は表面的にサンプル組織のMEAチップによって記録された活動の原点は、心に傷を負った領域から生じ得る。しかし、我々のデータは、私たちの準備で記録された発作はなさそうであることを示唆し、局部的に検出され、細胞外電場電位が最もMEA電極とそれらが記録部位13から100から200μmの距離に渡って統合されている前作ショーに記録されていることを示している心に傷を負った領域によって生産。さらに、深い浸透を可能にタングステン電極を用いて行った研究では、ヒト組織に記録てんかん活動が似ているてんかん患者1,7,8で観察ものに。 ex vivoでの組織の記録の別の制限は、このように動的neuromodulationsを制限する、異なる脳領域間の接続の破壊である。これは、このような組織でない発作のようなイベントが自発的に記録されていない理由を説明したが、イオン性の操作や興奮性を高める薬理学的刺激によってトリガーされている必要があります。したがって、このプロトコルでは、発作のようなイベントは、組織の興奮性を増大させるために、細胞外K + 3~6 mMまで変化し、フリーACSF 2+ 1.3mMのからのMgの外部のMg 2+の還元を組み合わせることによって誘導されるおよびMg 2+依存性NMDA受容体ブロックを削除します。実際、以前フリーACSFは、インビボ 14 に記録された電子写真発作に似ているのMg 2+を用いたてんかん様活動は、人間の新皮質および海馬スライスにおいて誘導されることが実証されている。加えて、それは、このように、in vitroで pharmacoresistant発作のような事象を調査するためのモデルを提供し、Mg 2+のに長時間さらされた後頭葉切片で得 ​​られたてんかん様放電は、臨床的に使用される抗けいれん薬に対して耐性になるフリーACSF 15,16が示されている。 MEAは、電場電位とニューロンの活動電位ex vivoで構成されるマルチユニット活動の両方の記録を可能にする。このように、MEAは、生体内における神経アンサンブルの同期活動によって発生する電場電位を探るが、17ビヘイビア単一ニューロンへのアクセスを与えていない脳波に比べて強力な電気生理学的なツールです。より最近の微小電極が神経活動電位になるin vivoでのマルチユニット活動を記録することができますが、それらの使用は主に頭蓋内の録音中に、研究目的に限定されているので、彼らは、侵襲的である。具体的には、MEAの記録は、選択した技術を表すてんかんのイベントの時空間パターンを研究するために、メカニズムは、発作の発症と伝播し、古典と新しい抗てんかん薬の作用を制御する。注目すべきことに、細胞型およびてんかん放電のシグナリング基礎を解明選別技術及び薬理試験をスパイクするMEA技術と組み合わせる必要がある。 MEAは、個々のスパイクへのアクセス権を与えることができますが、それらはシナプスと生物物理学的特性に関する情報を提供しない。将来的には、他の技術は、より良いサンプル細胞の挙動、ネットワーク活動やシナプスの信号伝達するために、MEAの録音に結合されるべきである。例えば、ニューロンまたはグリア細胞の挙動と同様に、イオンのダイナミクスを解明するための蛍光イメージングは​​、MEAの記録と組み合わせることができる。てんかん活動の場所は、特定の再配列と相関させることができるように、さらなる事後組織学的分析は、細胞型、タンパク質または受容体の特異的な変化を明らかにすることができる神経質な構造。 MEAのシステムはまた、集団活動に単一細胞またはコンダクタンスを相関させるために、パッチクランプセットアップに埋め込むことができる。将来的には、光遺伝学的ツールは、特定の細胞型のトランスフェクションまたは感染を行うことができるように、器官型スライスに対して実行されるように、人間のスライスが、長期的に培養することができるという条件で、使用することができる。

てんかんは、数十ミリ秒持続同期ニューロンの放電の存在によって特徴づけ、臨床症状に関連した脳波（EEG）のレコーディングに数十秒〜数秒続く断続的なパターン化された放電であるてんかん発作は、発作状態を中断する慢性疾患であるそして発作イベント1と呼ばれる。これは、約1％の世界の人口に影響を与え、発作が大多数の患者で制御されているが、てんかんを持つ人々の約3分の1は、抗てんかん薬2への適切な応答を示さない。 pharmacoresistantてんかんとメカニズム、まだ明確に識別されなければならないと呼ばれるこの状態では、発作発症ゾーンとして識別脳の特定の部分の外科的切除は、患者への肯定的な結果を与える唯一の代替治療法のまま。このように、手術から切除標本はopporをもたらす発作放電し、発作の発生と伝播のメカニズムだけでなく、実行可能な、人間の中枢神経組織のex vivoでのpharmacoresistanceを研究するチャンス。 空間的に分散微小電極の配置からなる多電極アレイ（MEAは）、組織の複数のサイトからの電気生理学的活性の同時刺激と記録を可能にする、このように自発的かつ誘発活動の時空間的パターンを研究するための優れたアプローチを提供。この技術は、まず神経細胞培養活性3の発達的変化を監視するために適用され、その後、急性および器官型脳および脊髄のスライス4のために適合6 - 、現在の貴重な電気生理学的なツールであると考えられる。 現在のプロトコルは、外科的に切除組織からのヒト皮質スライスを用意し、MEAの信頼性の高い元のviで録音する方法について説明しますこれらのスライスからのVO発作と発作のようなイベント。したがって、この技術は、てんかん活動を開始、伝播、および両方のセルラーネットワークレベルでの抗てんかん薬の効果の根底にある基本的なメカニズムに対処する方法を提供する。人間のスライスを得る準備維持し、記録するために使用するすべての手順は、ここで詳細に記載されている。

<table><tbody><tr><td>Brain Slice Chamber-2: インターフェース</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>S-BSC2</td><td>別途温度調節器が必要</td></tr><tr><td>2チャンネル温度調節</td>器 <td>マルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td>TC02</td> 2つの<td>インターフェースチャンバーを差し込んで使用することができます。&nbsp;</td></tr><tr><td>TC01を外部リファレンスPT100マルチ</td><td>チャネルシステム、ドイツ</td><td>CA3</td>を使用してS-BSC2に接続するための特殊ケーブルリファレンス<td>PT100はスライスの近くに配置されます&nbsp;</td></tr><tr><td>PT100</td><td>マルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td>TS-PT100</td><td>CA3ケーブル用外部リファレンス</td></tr><tr><td>120電極MEAからのデータを記録するためのMEAワークステーション</td><td>マルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td>MEA2100-120</td><td>MEA2100-120ヘッドステージとMEA2100インターフェースボードが含まれています。</td></tr><tr><td>www.multichannelsystems.com MEA2100-120</td><td>マルチチャンネルシステム用</td>マイクロ電極アレイ、ドイツ <td>120MEA200/30</td><td>電極間隔:200&マイクロ;m;電極径:30 & マイクロ;m;ガラスリング:高さ6mm。さまざまな構成(間隔、直径、リング)が可能です。&nbsp;</td></tr><tr><td>ビデオ顕微鏡テーブル</td><td>マルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td>MEA-VMT-1</td><td>テーブルの上に設置されたアンプでMEAの電極場を画像化し、画像をコンピュータに転送するためのビデオ顕微鏡を下に設置したテーブル。</td></tr><tr><td>灌流カニューレ</td><td>マルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td>PH01</td><td>温度センサー付き加熱灌流カニューレ; 温度はTC02コントローラでプログラム可能</td></tr><tr><td></td><td>MC_Rackマルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td></td><td>データ収集と記録のためのソフトウェア</td></tr><tr><td>磁気灌流ホルダー</td><td>マルチチャンネルシステム、ドイツ</td><td>MPH</td><td>灌流カニューレを固定し、灌流システムをアンプの地上に接続するためのPH01エレメント用の磁気灌流ホルダー</td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td></td><td>データ分析用ソフトウェア; info@neuroexplorer.com</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ(ドライブユニット)</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>0,01 to 48 rp</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ(ポンプヘッド)</td><td>Gilson</td><td>F117800</td><td>R2 2チャンネル</td></tr><tr><td>超音波吸引器</td><td>Integra Life sciences, USA</td><td>Cusa Excel +</td><td>It 皮質の鈍いサブピアル解剖が可能</td></tr><tr><td>Neuronavigation</td><td>Isis Solutions, France</td><td>Surgiscope</td><td>術前 MRI</td></tr><tr><td>ビブラトーム HM 650 V</td><td>400</td><td></td><td>&mu;M厚切り</td></tr></tbody></table>

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

てんかんは、人口の約1％に影響を与え、正常な脳機能を破壊する、発作の周期的な発生を特徴とする神経障害の群を含む。神経細胞の機能を標的とする現在利用可能な抗てんかん薬での治療にもかかわらず、てんかんの患者の三分の一はpharmacoresistantです。この状態では、発作を生成する脳の領域の外科的切除が唯一の代替治療のままである。人間のてんかんの組織を研究することは、最後の10年の間に新たなてんかんのメカニズムを理解するために貢献してきました。実際、これらの組織は、自発的発作てんかん放電ならびに古典的電気生理学的技術を用いて記録することができる薬理学的に誘発される発作イベントを生成する。注目すべきことに、多電極アレイを空間的に配置された微小電極のアレイを埋め込み、微細加工されたデバイスである（MEAは）、同時に刺激するユニークな機会とレコード·フィールドPoteのを提供ntials、ならびに組織の異なる領域からの複数のニューロンの活動電位。したがって、MEAの記録は自発的な発作の時空間パターンと誘発発作のようなイベントや発作の発症と伝播のメカニズムを研究するための優れたアプローチを提供します。ここでは、外科的に切除組織からのヒト皮質スライスを用意し、ex vivoでのMEAと発作と発作のようなイベントを記録する方法について説明します。

（前述のように）通常の記録ACSF 7,8で組織を灌流しながら、人間の皮質スライスの活動の記録が開始されます。組織が十分に病院スライス調製物からの組織の転送中に、後に手術中に保持され、この状態では、一方がMEAの電極の小さなクラスターから検出された小発作のようなイベントの形で、自発的活動を観察することができる。発作のような放電は数十ミリ秒持続長い反対の波が続く数十マイクロボルトに到達、初期鋭い負のたわみを含んで、電場電位、通常は二相性で構成されていた。高速のマルチユニット活動は、通常、主に最初の部分に電場電位に埋め込まれている。発作様活性の代表例は、MEAの電極によって記録されたトレースが示され、図3Aii、に示されている。 内からのてんかん発作を記録するにはヒト皮質スライスを、インビトロ、それは、Mg 2+存在せず、K +、組織の興奮1（3~6 mMまでK +の増加を高めるために、6 mMまで上昇させる「癲癇」ACSFでそれらを潅流することが必要である単独で発作を誘発するのに十分ではない;データは示さず）。 0 Mg 2+を 6 mMのK + ACSF灌流が開始されると、5人の患者から、皮質スライスの活性が徐々に増加し、最初の発作は20分（15.4±1.7分まで15内に表示され、N = 10; 図3愛 ）。試験された患者の75％において、全ての記録されたスライスの66.7％に、 図3に示すように、我々は、発作様活性を誘発。 てんかん活動は、MEAチップの隣接する電極から記録されており、フィールドの潜在的なイベントの発症動態の比較は起源と伝播の自分のサイトを研究することを可能にする。ハムのスライスから記録された代表発作MEAシステムと大脳皮質（ 図3 AIIIに高い時間分解能で表示され、単一のMEA電極によって記録された発作の代表的なトレース） 図3Bに示されている。発作は、このようにして、それが大皮質領域に伝播することが可能であることを示す、MEAチップのほぼすべての電極から記録されていることに留意されたい。また、各電極から記録された単一のトレースを見て、それが組織を横切る発作の進行性増殖を観察することが可能である：実際には、電極アレイの右半分を覆う皮質領域に最初に起動され、それが徐々に広がる左半分を覆う領域（。I E、電極L6およびB6からのトレースを比較する; 図3B）。 <img alt="図1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300"> 図1：皮質形成異常のAN。左前頭葉の溝に埋め込 ​​まれたDその外科的除去のAテイラー·タイプ焦点皮質形成異常は、（白矢印）術前のMRI（A）上で可視化、およびそれ以降の組織学的検査（B）は MAPキナーゼ標識により確認されている。スケールバー：200μm）を皮質dyslamination、異常なニューロンと下位白質における不完全な移動とニューロン上のトラックを示す。手術中に、形成異常は、ニューロナビゲーションシステム（C）を用いてMRIデータに基づいてローカライズされている。手術（D）中に異形成を含む回の可視化。 <img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400"> 図2：ヒト皮質スライス標本のための機器および手順インターフェース室は、ヒト皮質スライスを維持するために使用されるex vivoで （A）。;温度センサ（左Cは 、）、二を通じて温度コントローラ（最大C、右）に接続されたチャンバ（B）、上部の平坦な領域におけるレンズの組織のシート上のスライスの残りエンドケーブル（C、右、下）、スライスのインキュベーション時間の全体にわたって、37℃を維持するように配置されている。一度、氷冷スクロースベースのACSF（D）で満たされたペトリ皿の中の組織の切除ブロックを配置して、スライスを容易にするために、血液凝固、血管と髄膜を除去し、得られた。組織ブロックは、MEA室よりも大きい場合、ブレード（E）との適切な寸法の部分を分離し、ビブラトーム試料プレート（F）上に接着剤。厚さ400μmのスライスをカットし、へら（G）の助けを借りて、レンズティッシュ（H）の作品にそれらを転送し、インターフェースチャンバー（I）でそれらをインキュベートする。記録前、レモACSFで満たされたペトリ皿にスライスを沈めることによって水晶体組織をVEのスパチュラ（J）とのACSF満たされたMEAチップに転送します。スライスは、MEA（K）に付着した白金アンカーを使用して位置を保存しておいてみましょうするためのソリューションを削除します。アンプ（L）で、MEAを置き、灌流および録画を開始。 <img alt="図3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300"> 図3：MEA電極によって記録された人間の皮質スライス活性を有するヒト皮質スライスにおけるてんかん発作のMEA録音（A）の代表的トレースは私がパネルに表示されます。正常ACSFの存在下では、それが（パネル二ズームイン小さな灰色の四角形）、発作に似た自発的活動を観察することが可能である。その後、0 Mg 2+を 6 mMのK + ACSFでの灌流が開始された、最初のseizuREは〜15分の遅延の後に表示され、2〜3分間隔で他のイベントが続いている。パネルIIIはズームスケールパネルIに大きな灰色の四角形で発作を示しています。青い線及び矢印で示すように、青のトレースは、活動の拡大を示している。パネルIV）は、ズーム時にマルチユニット活動を明らかにする250ヘルツ、（青トレース）で濾過ハイパス）パネルIIIに示されているデータを示しています。0 Mg 2+を 6 mMのK +の存在下で、発作の（B）代表記録すべてのMEA電極からACSF。各正方形は12×12 MEAアレイの電極を表し、80秒の時間窓を示す図である。点線は、比較的MEAアレイに皮質表面の位置を示している。

ここでは、人間のてんかん皮質組織のマルチ電極アレイの録音を実行する方法について説明します。発作と発作事象の癲癇組織切除、スライス標本と多電極アレイ記録は詳細に実証される。

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

この手順の全体的な目標は、ヒトてんかん皮質組織からのex vivo、発作間欠性、および発作様イベントのマルチ電極アレイ記録を実行することであり、したがって、てんかん活動、開始、伝播、および抗てんかん薬の効果の根底にある基本的なメカニズムを細胞レベルとネットワークレベルの両方で対処する方法を提供することです。これは、まず、手術中に薬剤耐性てんかん患者からヒト皮質組織を慎重に切除することによって達成されます。2番目のステップは、スライスする前に血栓、血管、髄膜、および余分な白質を取り除くことです。次に、組織のブロックを400ミクロンのスライスに切ります。最後のステップは、スライスを高酸素化と制御された温度の界面条件に保ち、ゆっくりとした灌流を行うことです。最終的に、マルチ電極アレイ技術を使用して、自発的な発作間欠様活動と誘発発作様イベントを記録します。当研究室では、脳生理病理学における神経膠細胞相互作用の役割について、神経細胞がヒトの病理学的ネットワーク活動をどのように生み出すのかを研究しています。私たちは最近、ネックケアおよびラップペトリ病院と協力して、ヒトてんかんの術後皮質組織のマルチ電極アレイ記録を確立しました。今日は、Neck Care Hospitalの脳神経外科医であるThomas Blo氏と、Lapis HospitalのFeldてんかん専門医兼研究者、そして私の研究室のElena DOIポスドクが、このような技術をどのように実行し、うまく活用するかを実演します。ヒトてんかん組織の収集から生体内のMEA記録まで、 てんかん患者を治療するためのヒト皮質組織ECTの使用により、機能的に維持されたヒトてんかんニューロンとグリア細胞を直接探索できます。in vitro 研究では、ヒト組織は、in vivo では完全に対処できない単一細胞およびネットワーク活性、イオンベースのメカニズムへのアクセスを提供します。ヒト皮質組織のMEA記録は、外因性や発作伝播の根底にある細胞メカニズムなど、てんかん分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、薬効のメカニズムと抗てんかん薬の効果を理解することを可能にするため、病変性てんかんとその治療にまで及びます ヒトの皮質スライスに記録された発作様イベントに対する抗てんかん薬の効果。インビトロ。e、e、g、またはin vivoマイクロ電極などの既存の方法に対するマルチエレクトロアレイの主な利点は、組織のいくつかの側面からの電界電位とマルチユニット活性の非侵襲的な同時刺激と記録を可能にすることです。手順を開始するには、まず下部セクションを蒸留水で満たして、インターフェースチャンバーを準備します。次に、チャンバーをカルボゲン源に接続します。次に、スライスチャンバーの平らな領域に合うようにレンズティッシュをカットします。スライスに到達する前に気泡が入力ラインから逃げるように、入力チューブの隣に置きます。その後、撚り糸の綿糸をレンズティッシュと同じ長さで2本カットします。それらをチャンバーの平らな領域の側面に置き、蠕動ポンプの流量を1分あたり1ミリリットルに設定します。その後、チャンバーの底部で水の酸素化をオンにします。次に、温度コントローラーを摂氏37度に設定します。インターフェースチャンバーの上部をパラフォームで覆い、温度が上昇して安定するまで少なくとも30分待ちます。次に、2つの細かい鉗子、へら、小さなスプーン、ブレード、2つのガラスシャーレ、2つのブラシ、およびシアノアクリレート接着剤を含む解剖ツールを準備します。次に、スライス用のパラメータを設定してビブラートを準備します。この手順では、準備したショ糖ベースのA CSFをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、スラッシュに粉砕します。カルボゲンで酸素化します。次に、250ミリリットルのA CSFスラッシュをガラス瓶に移し、手術室で組織を採取するために氷で満たされたdoerボトルに保管します。標準的な全身麻酔下で、ニューロナビゲーションシステムを使用して、皮質の正確な位置特定を可能にします。その後、皮膚を切開し、骨にバーホールを作り、続いて開頭術を行います。次に、骨フラップをそっと持ち上げ、ハサミで硬膜を開きます。その後、てんかん皮質のブロック切除を行い、広範な凝固を避けます。厚さ1cmの皮質ブロックをカットし、凍結酸素化ショ糖ベースのA CSFに入れます。その後、凍結ショ糖ベースのA CSF中の組織をできるだけ早くラボに移しますが、機械的衝撃を避けます。次に、ペトリ皿とビブラートバッファートレイにショ糖ベースの酸素化A CSFスラッシュを入れ、引き続きA CSFスラッシュをカルボゲンで酸素化します。次に、スプーンでティッシュをボトルから慎重に取り出し、ペトリ皿に入れます。鉗子を使用して、スライス中の抵抗を避けるために、血栓、血管、髄膜を慎重に取り除きます。組織の側面をブレードで切断して、組織の反対側とできるだけ平行な平らな表面を取得します。次に、組織をビブラート標本プレートに接着して、横方向の皮質スライスを準備します。その後、バッファートレイにセットし、400ミクロンの厚さのスライスを低速でカットします。次に、ヘラとブラシでレンズティッシュを数枚切ります。これらのレンズ組織のスライスを界面チャンバーに移します。記録する前に、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。この手順では、灌流システムを蠕動ポンプに接続し、MEAシステムをコンピューターに接続します。次に、空のMEAチップを内部に配置します amplifier。次に、MEAチャンバー内のカニューレエレメントを加熱するための温度コントローラーを摂氏37度に設定します。酸素化されたA CSFの灌流を毎分5〜6ミリリットルで開始します。その後、録音ソフトウェアを開きます。すべてのMEA電極がしっかりと接続されていること、および灌流によるノイズがないことを確認してください。次に、温めた録音A CSFをガラスのペトリ皿に注ぎます。レンズ組織をつかんで、界面チャンバーからシャーレにスライスを移します。次に、スライスを溶液に浸して組織から慎重に剥がすか、小さなブラシを使用して剥がしを促進します。次に、MEAチップにA CSFを充填します。プラスチック製のパストピペットを備えたスパチュラでスライスをMEAチップに移します。溶液を静かに取り除き、スライスを電極領域に付着させ、プラチナアンカーで所定の位置に保ちます。その後、1ミリリットルのCSFの記録をMEAチップに追加し、アンプに入れます。次に、毎分5〜6ミリリットルで灌流を開始します。次に、MEA記録エリアのスライス位置を確認します。MEAモニターソフトウェアを使用して、必要に応じて調整します。皮質層から記録して写真を撮るためには、記録を開始します。これは、MEA電極によって記録されたヒト皮質スライス活動の代表的な痕跡です。正常な A CSF では、マグネシウムを含まない 6 ミリモルのカリウム A CSF による灌流の 15 分後に発作間欠性のような自発的な活動を観察することができます。最初の発作が現れ、その後に2〜3分間隔で他のイベントが続きます。青色のトレースは、拡大されたアクティビティを示しています。このパネルは、250ヘルツでフィルタリングされたデータのハイパスを示しており、ここにズームインすると、マグネシウムフリーのすべてのMEA電極からの発作の代表的な記録が複数ユニットの活動を明らかにします。6ミリモルカリウムA CSF。各正方形は 12 x 12 MEA アレイの電極を表し、82 番目のタイム ウィンドウを示しています。点線は、MEAアレイに対する皮質表面の位置を示しています。このビデオを見た後、人間の皮質組織を安全に輸送する方法、生存可能な皮質乾癬を準備して保存する方法、および自発的および誘発されたてんかん活動のMEA記録を実行する方法についてよく理解しているはずですこの手順を試みる際には、病院の臨床チームと研究室の研究者との間に緊密な協力関係を持つことが重要です。人間の組織を扱う作業は危険である可能性があることを決して忘れず、この手順に続いて起こりうる感染症を避けるために手袋を着用するなど、常に保護を行う必要があることを忘れないでください。蛍光イメージング、パッチランプ、記録、スパイクソーティング、組織学的分析などの他の手法をEM EA記録と組み合わせて、シナプス特性、単一細胞の挙動、イオンダイナミクス、細胞および分子の異常を集団活動に関連付けることができます。ヒトてんかん組織のMEA記録を行うことで、研究者が病変性てんかんを探求する道を開くことができ、外因性や薬理耐性の根底にあるメカニズム、およびこの現象における神経膠細胞相互作用の役割を明らかにすることができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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Medicine

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