人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

この手順の全体的な目標は、ヒトてんかん皮質組織からのex vivo、発作間欠性、および発作様イベントのマルチ電極アレイ記録を実行することであり、したがって、てんかん活動、開始、伝播、および抗てんかん薬の効果の根底にある基本的なメカニズムを細胞レベルとネットワークレベルの両方で対処する方法を提供することです。これは、まず、手術中に薬剤耐性てんかん患者からヒト皮質組織を慎重に切除することによって達成されます。2番目のステップは、スライスする前に血栓、血管、髄膜、および余分な白質を取り除くことです。

次に、組織のブロックを400ミクロンのスライスに切ります。最後のステップは、スライスを高酸素化と制御された温度の界面条件に保ち、ゆっくりとした灌流を行うことです。最終的に、マルチ電極アレイ技術を使用して、自発的な発作間欠様活動と誘発発作様イベントを記録します。

当研究室では、脳生理病理学における神経膠細胞相互作用の役割について、神経細胞がヒトの病理学的ネットワーク活動をどのように生み出すのかを研究しています。私たちは最近、ネックケアおよびラップペトリ病院と協力して、ヒトてんかんの術後皮質組織のマルチ電極アレイ記録を確立しました。今日は、Neck Care Hospitalの脳神経外科医であるThomas Blo氏と、Lapis HospitalのFeldてんかん専門医兼研究者、そして私の研究室のElena DOIポスドクが、このような技術をどのように実行し、うまく活用するかを実演します。

ヒトてんかん組織の収集から生体内のMEA記録まで、 てんかん患者を治療するためのヒト皮質組織ECTの使用により、機能的に維持されたヒトてんかんニューロンとグリア細胞を直接探索できます。in vitro 研究では、ヒト組織は、in vivo では完全に対処できない単一細胞およびネットワーク活性、イオンベースのメカニズムへのアクセスを提供します。ヒト皮質組織のMEA記録は、外因性や発作伝播の根底にある細胞メカニズムなど、てんかん分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の意味は、薬効のメカニズムと抗てんかん薬の効果を理解することを可能にするため、病変性てんかんとその治療にまで及びます ヒトの皮質スライスに記録された発作様イベントに対する抗てんかん薬の効果。インビトロ。e、e、g、またはin vivoマイクロ電極などの既存の方法に対するマルチエレクトロアレイの主な利点は、組織のいくつかの側面からの電界電位とマルチユニット活性の非侵襲的な同時刺激と記録を可能にすることです。

手順を開始するには、まず下部セクションを蒸留水で満たして、インターフェースチャンバーを準備します。次に、チャンバーをカルボゲン源に接続します。次に、スライスチャンバーの平らな領域に合うようにレンズティッシュをカットします。

スライスに到達する前に気泡が入力ラインから逃げるように、入力チューブの隣に置きます。その後、撚り糸の綿糸をレンズティッシュと同じ長さで2本カットします。それらをチャンバーの平らな領域の側面に置き、蠕動ポンプの流量を1分あたり1ミリリットルに設定します。

その後、チャンバーの底部で水の酸素化をオンにします。次に、温度コントローラーを摂氏37度に設定します。インターフェースチャンバーの上部をパラフォームで覆い、温度が上昇して安定するまで少なくとも30分待ちます。

次に、2つの細かい鉗子、へら、小さなスプーン、ブレード、2つのガラスシャーレ、2つのブラシ、およびシアノアクリレート接着剤を含む解剖ツールを準備します。次に、スライス用のパラメータを設定してビブラートを準備します。この手順では、準備したショ糖ベースのA CSFをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、スラッシュに粉砕します。

カルボゲンで酸素化します。次に、250ミリリットルのA CSFスラッシュをガラス瓶に移し、手術室で組織を採取するために氷で満たされたdoerボトルに保管します。標準的な全身麻酔下で、ニューロナビゲーションシステムを使用して、皮質の正確な位置特定を可能にします。

その後、皮膚を切開し、骨にバーホールを作り、続いて開頭術を行います。次に、骨フラップをそっと持ち上げ、ハサミで硬膜を開きます。その後、てんかん皮質のブロック切除を行い、広範な凝固を避けます。

厚さ1cmの皮質ブロックをカットし、凍結酸素化ショ糖ベースのA CSFに入れます。その後、凍結ショ糖ベースのA CSF中の組織をできるだけ早くラボに移しますが、機械的衝撃を避けます。次に、ペトリ皿とビブラートバッファートレイにショ糖ベースの酸素化A CSFスラッシュを入れ、引き続きA CSFスラッシュをカルボゲンで酸素化します。

次に、スプーンでティッシュをボトルから慎重に取り出し、ペトリ皿に入れます。鉗子を使用して、スライス中の抵抗を避けるために、血栓、血管、髄膜を慎重に取り除きます。組織の側面をブレードで切断して、組織の反対側とできるだけ平行な平らな表面を取得します。

次に、組織をビブラート標本プレートに接着して、横方向の皮質スライスを準備します。その後、バッファートレイにセットし、400ミクロンの厚さのスライスを低速でカットします。次に、ヘラとブラシでレンズティッシュを数枚切ります。

これらのレンズ組織のスライスを界面チャンバーに移します。記録する前に、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。この手順では、灌流システムを蠕動ポンプに接続し、MEAシステムをコンピューターに接続します。

次に、空のMEAチップを内部に配置します amplifier。次に、MEAチャンバー内のカニューレエレメントを加熱するための温度コントローラーを摂氏37度に設定します。酸素化されたA CSFの灌流を毎分5〜6ミリリットルで開始します。

その後、録音ソフトウェアを開きます。すべてのMEA電極がしっかりと接続されていること、および灌流によるノイズがないことを確認してください。次に、温めた録音A CSFをガラスのペトリ皿に注ぎます。

レンズ組織をつかんで、界面チャンバーからシャーレにスライスを移します。次に、スライスを溶液に浸して組織から慎重に剥がすか、小さなブラシを使用して剥がしを促進します。次に、MEAチップにA CSFを充填します。

プラスチック製のパストピペットを備えたスパチュラでスライスをMEAチップに移します。溶液を静かに取り除き、スライスを電極領域に付着させ、プラチナアンカーで所定の位置に保ちます。その後、1ミリリットルのCSFの記録をMEAチップに追加し、アンプに入れます。

次に、毎分5〜6ミリリットルで灌流を開始します。次に、MEA記録エリアのスライス位置を確認します。MEAモニターソフトウェアを使用して、必要に応じて調整します。

皮質層から記録して写真を撮るためには、記録を開始します。これは、MEA電極によって記録されたヒト皮質スライス活動の代表的な痕跡です。正常な A CSF では、マグネシウムを含まない 6 ミリモルのカリウム A CSF による灌流の 15 分後に発作間欠性のような自発的な活動を観察することができます。

最初の発作が現れ、その後に2〜3分間隔で他のイベントが続きます。青色のトレースは、拡大されたアクティビティを示しています。このパネルは、250ヘルツでフィルタリングされたデータのハイパスを示しており、ここにズームインすると、マグネシウムフリーのすべてのMEA電極からの発作の代表的な記録が複数ユニットの活動を明らかにします。

6ミリモルカリウムA CSF。各正方形は 12 x 12 MEA アレイの電極を表し、82 番目のタイム ウィンドウを示しています。点線は、MEAアレイに対する皮質表面の位置を示しています。

このビデオを見た後、人間の皮質組織を安全に輸送する方法、生存可能な皮質乾癬を準備して保存する方法、および自発的および誘発されたてんかん活動のMEA記録を実行する方法についてよく理解しているはずですこの手順を試みる際には、病院の臨床チームと研究室の研究者との間に緊密な協力関係を持つことが重要です。人間の組織を扱う作業は危険である可能性があることを決して忘れず、この手順に続いて起こりうる感染症を避けるために手袋を着用するなど、常に保護を行う必要があることを忘れないでください。蛍光イメージング、パッチランプ、記録、スパイクソーティング、組織学的分析などの他の手法をEM EA記録と組み合わせて、シナプス特性、単一細胞の挙動、イオンダイナミクス、細胞および分子の異常を集団活動に関連付けることができます。

ヒトてんかん組織のMEA記録を行うことで、研究者が病変性てんかんを探求する道を開くことができ、外因性や薬理耐性の根底にあるメカニズム、およびこの現象における神経膠細胞相互作用の役割を明らかにすることができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。