マウス骨髄からの破骨細胞の導出

この手順の全体的な目標は、マウスの骨髄から破骨細胞を大量に分離することです。これは、最初に安楽死させたマウスから骨を採取することによって達成されます。次に、乳鉢と乳棒を使用して骨を粉砕することにより、細胞を骨髄から解放します。

次に、骨髄溶液を密度勾配細胞分離培地に重ね合わせ、密度勾配細胞分離を行います。最後に、目的の細胞を含む層を吸引し、細胞を骨髄マイクロファージ誘導培地に入れます。最終的に、トラップ染色は、多数の破骨細胞の存在を示すために使用されます。

この技術の意味するところは、破骨細胞の機能の変化に関連する疾患にまで及び、造血のための骨髄空間の形成に失敗したことによる致死的な新生児疾患から、マウスの骨髄から多数の破骨細胞を分離する信頼性の高い方法を生み出すため、骨粗鬆症などの病状に遭遇することが多く、その重症度はさまざまです。まず、市販の密度勾配セル分離液10ミリリットルを、中温から室温で50ミリリットルの円錐管に入れます。50ミリリットルのファックスバッファを室温で置き、密度勾配セル分離培地と一緒に使用します。

追加のメディアを準備し、テキストプロトコルに従ってC 57ブラックシックスマウスを安楽死させた後、マウスを解剖ボード上に置き、70%エタノールを使用します。それをスプレーするには、脛骨のフムの目と背骨を収穫します。次に、ボーンを氷上のファクトバッファーに置きます。

次に、清潔なティッシュペーパーを使用して、骨から筋肉と軟組織を取り除きます。骨を乳鉢と乳棒に入れ、3ミリリットルの事実を緩衝し、穏やかに粉砕します。次に、血痕に付着した液体を吸引し、70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に通します。

粉砕した骨にさらに5ミリリットルの効果緩衝液を追加し、さらに粉砕してから、液体をストレーナーを介して50ミリリットルのチューブに移します。このプロセスを、液体が赤く染まらなくなるまで続けてから、骨髄を摂氏4度で5分間200Gでペレット化します。グラジエント分離を行うには、細胞ペレットから上清を吸引し、10 ミリリットルのファックスバッファーを使用して再溶解します。

ペレットを懸濁し、室温密度勾配細胞分離培地の円錐管を約30度に傾け、ピペットの先端をチューブの内側上面に当てた電動ピペットを使用する。加速または減速せずに、室温の遠心分離機を使用して、骨髄溶液を培地にゆっくりと重ねます。グラディエントを200Gで15分間回転させます。

次に、目的の細胞を含む曇った中間層を吸引し、それらを新しい円錐形のチューブに移します。細胞を洗浄するために、20ミリリットルの氷冷ファックスバッファーを追加します。次に、1ミリリットルの骨髄マイクロファージ刺激培地を使用して、細胞計数後に最終細胞ペレットを再懸濁します。

2ミリリットルのマイクロファージ刺激培地を24ウェルプレートの各ウェルに入れました。次に、各ウェルに200, 000個の細胞を加え、適切なin vitro破骨細胞培養を確保する細胞密度にします。プレートを穏やかに攪拌し、培地を変更せずに摂氏37度で3日間インキュベートします。

3日目以降、培地を骨髄破骨細胞導入培地に変更し、5〜7日間毎日交換を開始します。その時点で、大きな多核破骨細胞が見えるはずです。ここに示すように、染色および吸収アッセイについては、テキストプロトコールを参照してください。

酒石酸耐性アッセイを使用して、多数の破骨細胞を確認できます。破骨細胞を染色するリン酸塩は、このビデオで示したプロトコルを使用して、複数の核を持つ大きな紫色の細胞として視覚化されます。破骨細胞は、細胞あたり30個もの核を持つものを単離するのが一般的です。

鉱化表面を使用することは、in vitroで破骨細胞の吸収活性を評価するためのゴールドスタンダードの方法と考えられています。この図では、10倍の拡大率での明視野顕微鏡は、黒で輪郭が描かれたように形成された鉱化表面または吸収ピットの割合を示しており、破骨細胞の吸収能力を決定することができます。このビデオを見れば、マウスの骨髄から多数の破骨細胞を確実に分離する方法を十分に理解できるはずです。