マウス骨髄からの破骨細胞の導出
2014年11月6日
破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。
この手順の全体的な目標は、マウスの骨髄から破骨細胞を大量に分離することです。これは、最初に安楽死させたマウスから骨を採取することによって達成されます。次に、乳鉢と乳棒を使用して骨を粉砕することにより、細胞を骨髄から解放します。
次に、骨髄溶液を密度勾配細胞分離培地に重ね合わせ、密度勾配細胞分離を行います。最後に、目的の細胞を含む層を吸引し、細胞を骨髄マイクロファージ誘導培地に入れます。最終的に、トラップ染色は、多数の破骨細胞の存在を示すために使用されます。
この技術の意味するところは、破骨細胞の機能の変化に関連する疾患にまで及び、造血のための骨髄空間の形成に失敗したことによる致死的な新生児疾患から、マウスの骨髄から多数の破骨細胞を分離する信頼性の高い方法を生み出すため、骨粗鬆症などの病状に遭遇することが多く、その重症度はさまざまです。まず、市販の密度勾配セル分離液10ミリリットルを、中温から室温で50ミリリットルの円錐管に入れます。50ミリリットルのファックスバッファを室温で置き、密度勾配セル分離培地と一緒に使用します。
追加のメディアを準備し、テキストプロトコルに従ってC 57ブラックシックスマウスを安楽死させた後、マウスを解剖ボード上に置き、70%エタノールを使用します。それをスプレーするには、脛骨のフムの目と背骨を収穫します。次に、ボーンを氷上のファクトバッファーに置きます。
次に、清潔なティッシュペーパーを使用して、骨から筋肉と軟組織を取り除きます。骨を乳鉢と乳棒に入れ、3ミリリットルの事実を緩衝し、穏やかに粉砕します。次に、血痕に付着した液体を吸引し、70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に通します。
粉砕した骨にさらに5ミリリットルの効果緩衝液を追加し、さらに粉砕してから、液体をストレーナーを介して50ミリリットルのチューブに移します。このプロセスを、液体が赤く染まらなくなるまで続けてから、骨髄を摂氏4度で5分間200Gでペレット化します。グラジエント分離を行うには、細胞ペレットから上清を吸引し、10 ミリリットルのファックスバッファーを使用して再溶解します。
ペレットを懸濁し、室温密度勾配細胞分離培地の円錐管を約30度に傾け、ピペットの先端をチューブの内側上面に当てた電動ピペットを使用する。加速または減速せずに、室温の遠心分離機を使用して、骨髄溶液を培地にゆっくりと重ねます。グラディエントを200Gで15分間回転させます。
次に、目的の細胞を含む曇った中間層を吸引し、それらを新しい円錐形のチューブに移します。細胞を洗浄するために、20ミリリットルの氷冷ファックスバッファーを追加します。次に、1ミリリットルの骨髄マイクロファージ刺激培地を使用して、細胞計数後に最終細胞ペレットを再懸濁します。
2ミリリットルのマイクロファージ刺激培地を24ウェルプレートの各ウェルに入れました。次に、各ウェルに200, 000個の細胞を加え、適切なin vitro破骨細胞培養を確保する細胞密度にします。プレートを穏やかに攪拌し、培地を変更せずに摂氏37度で3日間インキュベートします。
3日目以降、培地を骨髄破骨細胞導入培地に変更し、5〜7日間毎日交換を開始します。その時点で、大きな多核破骨細胞が見えるはずです。ここに示すように、染色および吸収アッセイについては、テキストプロトコールを参照してください。
酒石酸耐性アッセイを使用して、多数の破骨細胞を確認できます。破骨細胞を染色するリン酸塩は、このビデオで示したプロトコルを使用して、複数の核を持つ大きな紫色の細胞として視覚化されます。破骨細胞は、細胞あたり30個もの核を持つものを単離するのが一般的です。
鉱化表面を使用することは、in vitroで破骨細胞の吸収活性を評価するためのゴールドスタンダードの方法と考えられています。この図では、10倍の拡大率での明視野顕微鏡は、黒で輪郭が描かれたように形成された鉱化表面または吸収ピットの割合を示しており、破骨細胞の吸収能力を決定することができます。このビデオを見れば、マウスの骨髄から多数の破骨細胞を確実に分離する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、マウスの骨髄から多量の破骨細胞を分離する方法を概説しています。このプロセスには、骨の採取、細胞の解放、密度勾配分離を用いて破骨細胞を更なる研究のために得ることが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 骨生物学
- 細胞分離技術
- 破骨細胞活性の定量
背景
- 破骨細胞は骨吸収に不可欠です。
- 破骨細胞の生物学を理解することは、骨疾患への洞察に重要です。
- 分離技術はこれらの細胞の研究を進歩させました。
- このプロトコルは、研究のための破骨細胞の収率を向上させることを目指しています。
研究の目的
- マウスの骨髄から破骨細胞を分離すること。
- 実験分析のために破骨細胞をin vitroで培養すること。
- 特定の染色法を用いて破骨細胞活性を定量すること。
使用した方法
- 安楽死させたマウスから骨を採取すること。
- 骨をファクトバッファーで砕いて細胞を解放すること。
- 密度勾配細胞分離を行うこと。
- 骨髄マクロファージ誘導培養液を用いて細胞培養を行うこと。
主な結果
- 多数の破骨細胞の成功的な分離。
- in vitroでの破骨細胞の効果的な培養。
- TRAP染色を通じた破骨細胞の存在の証明。
- 破骨細胞活性の定量の達成。
結論
- このプロトコルは破骨細胞分離のための信頼性の高い方法を提供します。
- 破骨細胞生物学のさらなる研究を促進します。
- 骨関連疾患の研究における潜在的な応用があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable in vitro derivation of osteoclasts from mouse bone marrow enables high-confidence interrogation of bone resorption mechanisms and disease-relevant cellular phenotypes. This capability is critical for target validation and mechanistic de-risking in early-stage bone disease drug discovery. The method supports portfolio decisions by providing scalable access to functional osteoclasts for quantitative assessment of therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of bone resorption hypotheses in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating osteoclast-specific effects.
- Facilitates functional target validation for bone disease pathways.
- Provides a platform for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Generates validated osteoclast populations for downstream resorption assays.
- Enables standardization of quantitative TRAP staining and resorption pit assays.
- Supports reproducible, scalable workflows for compound screening.
- Allows for robust evaluation of osteoclast-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro osteoclast function with disease-relevant bone remodeling endpoints.
- Provides continuity from cellular mechanism to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of bone-targeted therapeutic candidates.
- Supports translational biomarker development for bone resorption activity.
Pipeline & Workflow Integration
This osteoclast derivation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational studies in bone biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of osteoclast-mediated bone resorption mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for compound or genetic screening.
- Analytics: Enables measurement of multinucleation, TRAP positivity, and resorptive capacity for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo bone remodeling and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for osteoclast isolation across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bone resorption target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible osteoclast cultures at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality for bone disease programs by reducing biological ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of osteoclast-targeted therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and bone marrow handling.
- Needs access to density gradient separation and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of TRAP staining and resorption assays.
- May require adaptation for different mouse strains or disease models.
- Dependent on careful quantification and validation of osteoclast identity and function.
