Name: 視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現の変化の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶ視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現変化の解析手法。BDNFやGABRDの発現変動を定量的RT-PCRで測定し、てんかん治療の分子メカニズム解明に貢献します。

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注：倫理に関する声明：この原稿で説明するすべての手順は動物研究（実験動物の管理と使用に関する指針）のためのNIHガイドラインに従っているとハーバード大学医学部IACUC委員会によって承認されている。 1.手術前の準備<ol><li>すべての外科器具はどちらオートクレーブによりまたは必要に応じて消毒液および/またはエタノールで洗浄することによって滅菌されていることを確認してください。可能な場合には、そのようなメス、針と注射器のような滅菌使い捨て器具を使用しています。 </li><li>外科用ドレープでワークベンチをカバーし、利用可能なバイオハザード廃棄物処理があることを確認してください。 </li><li>ラットを秤量し、麻酔の投与量を計算する。ラットを麻酔ケタミン/キシラジン混合物（ケタミン75 mg / kgをおよびキシラジンは10mg / kg）を使用してください。 注：200〜250グラムの間では、定位フレームにおける動物の適正な固定のためだけでなく、ATNの正確な標的化のための最適な重量である。 IsoflurANEはまた、麻酔剤として使用することができる。 </li><li>マウントと固定している2つの無菌の電極の電極ホルダーの（オートクレーブによりまたはエチレンオキシドで滅菌）定位手術用フレームの顕微鏡（10-40X倍率）の助けを借りて（ 図2）は 、適切な用電極の先端を検査整列。二つの電極離れて3.0ミリメートルを固定します。 注記：ハードディスクの表面に触れることによって、電極先端を損傷しないように注意してください。 </li></ol> 2. DBS手術<ol><li>ケタミン/キシラジンを動物に腹腔内に混在させると、動物が（つま先ピンチ反射、呼吸数と深さ、呼吸の規則性をチェックすることによって）麻酔の外科的平面に到達したことを確認して注入する。切開される頭皮の領域から毛を除去し、各ベタジンとアルコールまたは滅菌生理食塩水のいずれかの3交互スクラブと頭皮を消毒する。セキュアと定位FRAMに動物を配置E。 </li><li>最適なレベルで、動物の体温を維持するために、循環温水パッドを使用する。過剰乾燥から守るために動物の目に目の潤滑剤を適用します。 </li><li> ATN（視床前核）を標的とするために、以下の定位座標を使用します。anterioposterior -1.6ミリメートル、内外1.5ミリメートルと5.2ミリメートル1背腹。 注：定位座標は、Paxinosとワトソン（6 番目の版）ラット脳アトラス36に基づいています。 </li><li>頭蓋骨を明らかにするために矢状頭皮に切開を行います。開創器の一対の切開頭皮を確保使用する頭蓋骨を露出させる。切開をフラッシュする滅菌生理食塩水を使用してください。切開があまりにも濡れている場合は、乾燥させるために、滅菌綿棒を使用しています。ブレグマを見つけて、黒のマーカーでマークします。コロン島の矢状縫合と1.6ミリメートルの後部からmediolaterally両側に約1.5ミリメートルで、さらに2つのマークを作る、バーホールの位置をガイドするアル縫合。 </li><li>バーホールを作るために、手持ちのドリルを使用してください。バーホールの先端がエタノールでそれを滅菌することにより滅菌されていることを確認してください。掘削時に頭蓋骨表面に対して約45°の角度でドリルを持ってください。よくあるすべてのバーホールの位置に過度の熱を避けるために、2バーホールを切り替える。 </li><li>硬膜が露出するまでの掘削を継続。 &#39;L&#39;の形状に似たその先端曲がった針を用いて、電極の挿入を妨げになる骨のいずれかの破片を取り除く。曲がった針を用いて骨片を除去しながら、基礎となる硬膜および/または脳組織を損傷しないように注意してください。 注：鈍い針または罰金鈍鉗子を使用してもオプションです。 </li><li>定位フレームの回転ハンドルにデュアル電極アセンブリを修正し、90°の角度でハンドルを固定してください。定位フレームの調整を使用して、正確にブレグマの上に残って電極を配置する。 </li><li>ステレオを使用して、正確に現在2つの電極が完全に冠状縫合に沿って整列しなくブレグマからmediolaterally 1.5mmと離隔が存在するようにブレグマの左側に1.5ミリメートル左電極を移動させる内外位置決め用戦術調整。 </li><li> anterioposterior定位の調整を使用して、冠状縫合に電極1.6ミリメートル後方に移動します。 </li><li>バーホールは電極がバーホールのラフな縁を触れることなく、簡単に挿入することができるように右の場所で行われている場合は、最初のチェックに電極を下げるために背腹調整を使用してください。その場合は、頭蓋骨の表面から5.2ミリメートルの深さに電極を挿入します。 </li><li> 130ヘルツ、2.5 V、90マイクロ秒のパルス幅1に設定された刺激にリード線を介して電極を接続します。 </li><li>時間の高頻度刺激を送達する（または実験に従って所望の期間）。刺激の過程で、ページを保証するために覚えている定期的につま先のピンチに応答して、足の撤退がないことを確認することでローパー麻酔深度。麻酔を誘導するために使用される約半分の初期用量で麻酔を補足する。麻酔深度をチェックするとき、あなたの滅菌手袋の汚染を避けるため、必要に応じて変更します。 1の実験的なニーズに基づいて、一方的または両側刺激を実行します。このような低頻度刺激などのコントロール（ 例えばため。、10ヘルツ）と（後続の刺激に電極を挿入する）刺激されていない動物が含まれる。 </li><li>刺激が行われた後、慎重に電極を取り外し、3-0縫合糸でまたは滅菌外科ステープルで切開を縫合。 </li><li>皮下鎮痛としてブプレノルフィン（0.05ミリグラム/ kg）を管理します。それが通常の活動に戻るまで動物を監視して、住宅施設にそれを返す。 </li><li> （ 例えば 、0,3,6、または12時間後DBS手術のための）実験計画に基づいて設定された時間後に、麻酔過剰摂取で動物を安楽死させる。バイタルサインの不在を確認した後、動物を斬る。 </li><li>最初のハサミを用いて皮膚を削除することで脳を解剖。解剖ハサミを使って矢状縫合に沿って骨をカット。両方の側面に骨を（インチそれぞれ約）さらに2つの切開を行います。鉗子を使用して、脳を露出させるために頭蓋骨の上から骨の部分的に切断された部分を持ち上げる。 </li><li>細かいハサミやピンセットを用いて、頭蓋骨から脳を取り除く、氷上に冷たいPBSでペトリ皿に移す。 注：骨を切開しながら脳に損傷を与えないように注意してください。 </li></ol> 3.海馬の分離注：氷の上にこのセクションのすべての後続のステップを実行します。 <ol><li>氷上で予め冷却したアクリル脳マトリックス上で脳を置きます。カミソリの刃を使用して、最前方edから7-8で約冠状mmの脳をカット脳のGE。約5ミリメートルの厚さの脳切片を除去することができるように最初のカットに第二冠状にカットし、後部を行います。 </li><li>氷冷PBSでペトリ皿に脳スライスを転送します。カミソリの刃を使用して、2つの半球状のセクションを切断し、それぞれ左右両側に対応する半球に注意するように注意してください。一方的な刺激を行いながら、これは特に重要である。 </li><li>細かい鉗子とハサミを使用すると、慎重に海馬を削除します。 </li><li> Flashは、その後のRNA抽出のステップの準備が整うまで-20℃の冷凍庫でドライアイスとストアの海馬組織を凍結する。 注：長期保存のためには、-80℃の冷凍庫内の組織を保存することをお勧めします。 </li></ol> 4. RNA抽出および定量PCR <ol><li>組織が均質化のための準備ができるまでドライアイス上で凍結されたままにしてください。 </li><li>注：フード内でこの手順を実行します。 <ol><li>ヒップにトライ試薬の1ミリリットルを追加します。1.5ミリリットル遠心管におけるocampal組織と組織を小さな断片に切断されるまで、第1ピペッティングにより複数回、それを均質化する。さらに目に見える無傷の組織がなくなるまで25 G針を注射器に通すことによって、組織をホモジナイズする。氷上で均質化の手順を実行します。 </li><li>組織をホモジナイズした後、細胞溶解を可能にするために、細胞懸濁液を5分間室温で放置する。 注：この時点の後、細胞懸濁液を急速冷凍し、さらなる処理まで-70℃に格納することができる。 </li></ol></li><li> 0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、20秒間ボルテックスで混合し、15分間室温での溶液の残りをしましょう​​。 </li><li> 4℃で15分間12000×gでサンプルを遠心。遠心分離した後、表示されます3つの別々の層を乱すことなく、慎重にチューブを取り除く。 注：ボトム（赤）相はタンパク質を含む、中央の曇り相は、DNAが含まれており、トップの明確な相はRが含まれていますNA。 </li><li>新鮮な1.5ミリリットルの遠心管にトップクリヤー相（RNA）を転送する（通常は相を含むRNAを500μlが得られる）。これに0.5ミリリットルのイソプロパノールを加え、ボルテックスで混和する。これにRNAの担体として2-3μlのグリコーゲンた（20mg / ml）を加える。サンプルは10分間室温でテーブルの上に物を置か。 </li><li> 4℃で1時間、12000×gでサンプルを遠心。 RNAペレットがチューブの底に表示されていることを確認してください。 </li><li>上清を捨て、75％エタノール1mlを添加することにより、RNAペレットを洗浄（ヌクレアーゼフリー水で作られた）。ペレットがチューブの底からdislodgesと、溶液中に浮遊するまで、サンプルを複数回反転。遠心機4℃で10分間12000×gでソリューション。 NOTE：75％エタノールでペレットをさらなるステップまで-20℃で保存することができる。 </li><li>室温で5分間開いたチューブを残すことによって空気乾燥RNAペレットを許可する。オベを避けるために予防策を取るこの後の工程で水への溶解に影響を与える可能性があるとして、ペレットを乾燥させるrを。 </li></ol> 5. RNAの準備からDNAを削除<ol><li> RNAペレットにヌクレアーゼを含まない水の9μl加え、ペレットを静かにチューブをボルテックスして先に進む前に溶解されることを確認してください。これは10倍DNアーゼIバッファー1μlのと1μL（DNアーゼIキットから）組換えDNA分解酵素を追加するには、簡単に、優しくチューブをフリックでミックスチューブをスピンし、30分間水浴中で37℃でインキュベートする。 </li><li>サンプルに（DNアーゼIキットから）2μlのDNA分解酵素の不活性化試薬を追加し、2分間室温でインキュベートし、穏やかにチューブをフリックで頻繁に混ぜる。 10分間12000×gで遠心分離し、新鮮な1.5ミリリットル遠心管に透明な上澄みの約10μLを転送する。 </li><li>光度計または分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。 </li></ol> 6. RNAからcDNAを作る<ol><li>必要なボリューム番目の追加1μgのRNAを含有し、ヌクレアーゼフリー水を添加することによって8μlの総体積をもたらすで。これに1μlの10のdNTPミックスおよびSuperscriptファーストストランド合成キットからランダムヘキサ1μlの追加。穏やかに混合し、いずれかの水浴で、または事前にプログラムされたサーモサイクラー上で5分間65℃でインキュベートする。 </li><li> 10倍RT緩衝液2μl、25 MのMgCl 2、0.1 M DTT2μlのRNアーゼOUT（40 U /μl）を1μlの4μlの：以下の試薬 ​​を含むプレミックスを作成します。 注：指定されたボリュームの反応ごとにあり、ユーザは、1つの実験的なニーズに応じてスケールアップする必要があります。 </li><li> 65℃からのサンプルを含むRNAを除去した後、分室温で管をセット。 9μlのプレミックス溶液を添加し、2分間室温でインキュベートする。スーパースクリプトII逆転写酵素の1μL（50 U /μl）を追加し、10分間室温でインキュベートする。 </li><li> 50 42℃でサンプルをインキュベートminで逆転写が起こるのに。 </li><li>反応を停止し、15分間70℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li>簡単に氷の上にサンプルを配置し、1μlのRNアーゼH（2U /μl）を加え、20分間37℃でインキュベートする。 </li><li>簡単に言うと凝縮液をスピンダウンする3000×gでチューブを遠心する。 注：これは、定量的PCRのために使用されるcDNAである。 cDNAは、PCRセットアップまで-20℃の冷凍庫に保存することができる。 cDNAはまた、PCRに進む前に、ヌクレアーゼを含まない水で希釈することができる。 </li></ol> 7.定量PCR <ol><li> 2X SYBRグリーンミックスの6.3μL、フォワードプライマーの0.6μL（10μM）、リバースプライマーの0.6μL（10μM）およびヌクレアーゼを含まない水0.5μlの：以下の試薬を（与えられたボリュームが反応あたりである）を含むマスターミックスを作る。 注：プライマーの設計は、目的の遺伝子のために、NCBIのヌクレオチド配列ページの「ピックプライマー」オプションを使用して行われた。 </li><li> 96 well- PCRプレートの各ウェルに10μlのマスターミックスを追加します。以前よくマスターミックスを含むことに作製されたcDNAの2.5を添加する。各サンプルについて3回のPCR反応をセットアップしてください。 </li><li>マスターミックスとcDNAの添加が完了した後、ウェルを密封するために、光学接着シートを用いたPCRプレートをカバーする。井戸の底にすべての液体を決済する卓上遠心機で500×gで5分間簡単にプレートスピン。 </li><li>あらかじめプログラムされたRT-PCRマシンにPCRプレートをロードします。 表1に提供PCRパラメーターを使用してください。 </li><li>データ分析：さらなる計算のためのqPCR出力からC t値を使用してください。試験遺伝子に加えて、内部対照遺伝子のためのPCR反応、18S rRNAの（等しい入力を確実にする）と、βアクチン（ネガティブコントロール）を設定。 ΔΔCT法37に基づいて、倍率変化を計算します。 </li></ol>

著者は開示していません。

Benabid らによる画期的な仕事の後。パーキンソン病と本態性振戦を治療するための脳深部刺激を使用して、DBS手術法は、多くの神経疾患の6,10,43を治療するための過去10年間で多くの関心を検討されている。脳回路の様々な神経解剖学的領域を標的DBS研究は、現在、主要な神経疾患に対処するために多くのグループによって実行され、臨床試験の様々な段階にあるされている。視床下核（STN）又は淡蒼球（GPiの）の内部セグメントの刺激は、FDA承認及びパーキンソン病10に運動障害を治療するのに使用される。サンテ臨床試験は、前視床核31の高頻度刺激を受けたてんかん患者のための有望な傾向を示している。相からの結果は、私が二国間の円蓋刺激の臨床試験は、認知機能低下、再率の遅延を示しているメモリ回路8,44の活性化、ならびにアルツハイマー病に見られるグルコース代謝低下取り込みの冒頭装飾。さらに、近年では脳神経外科医は、OCD（強迫性障害）、治療抵抗性うつ病、トゥレット症候群と中毒10,45-55などの神経精神...

電気的に脳回路を刺激する可能性は2を探索したときの神経外科技術として、脳深部刺激の発展の歴史は1870年代にまでさかのぼります。 1960 3で起動ニューロンの障害の治療のような慢性の高頻度刺激を使用する。その後、慢性移植DBS電極4-6の出現により1990年代に、DBSにより処理したニューロンの障害の数が増加し続けた。深部脳刺激は、最初本態性振戦6の治療薬として米国で使用された。今日、手術は現在、薬理学的介入によって治療不可能であるニューロンの障害の治療に広く使用されている。 DBSは現在、パーキンソン病およびジストニア7-9の運動障害を治療するために使用される。アルツハイマー型認知症、ハンチントン病、てんかん、痛みや神経精神疾患、うつ病、OCD、トゥーレット7;症候群と中毒はDBS 10-12による治療の影響を受けやすい条件のいくつかである。 DBS手術はFDAは、パーキンソン病、ジストニア、および本態性振戦の治療のために承認されているが、前述の他の状態を治療するためのDBSの使用は、患者13,14に多くの約束を提供する実験室の様々な段階および臨床試験である。 臨床的に、DBS手術は2段階で行われる。第一段階は、外科的に放射線位置の組み合わせを使用して、標的の解剖学的位置にDBS電極を配置することを含む、CT、MRI、ならびに強化精度化微小電極の測定値。第二段階は、患者の胸の上部にパルス発生器を注入し、パルス発生器に頭皮から延長リードを設置することを含む。神経学的状態に基づいて、パルス発生器のためのいくつかのプログラミング方式が標準化され、所望の電圧を供給するために使用される。最終巻最小の電圧15と最良の臨床応答を受信するように、モンタージュは、段階的に達成される。しかし、我々の研究では、臨床的に使用される慢性DBSインプラントとは異なり、簡単のために、私たちは、動物モデルにおいて（1時間）1回の高頻度刺激を研究に頼ってきた。 当社グループの研究の一部は、治療抵抗性てんかんのためのDBS手術の使用を研究に焦点を当てています。高周波刺激を使用して、定位外科的アプローチは、てんかん10,16,17の全発生率の約30％を構成する、医学的に難治性てんかんを治療するための効果的なオプションとして、多くの他の人が検討されている。皮質表面を標的小脳刺激ならびに深部小脳核てんかん10,18,19を治療するための標的として過去に使用されてきた。また、海馬刺激も試みたが、結果はまちまち20,21とされています。他のいくつかを調べてんかんのためのDBSターゲットは大脳皮質、視床、視床下核と迷走神経8が含まれています。しかし、過去数年間でいくつかの研究から以下の結果は、視床前核（ATN）は、てんかん治療10,22のための最も一般的なDBSターゲットとして浮上している。神経解剖学的回路および動物モデルからの所見についての知識に基づいて、いくつかの研究は、てんかんの治療における23-26 ATNの深部脳刺激の治療効果に焦点を当てている。 ATNは、辺縁系回路の一部であり、発作頻度に影響する脳の領域に位置している。によるHamani らの研究では、ピロカルピン誘発性てんかんモデルでATN-DBSの有効性をテストし、二国間のATN刺激がピロカルピン誘発性発作とてんかん重積状態24のための待ち時間を延長していることを発見した。さらに、ATNの高周波刺激はディスコグラフィのペンチレンテトラゾール（PTZ）モデルにおける発作頻度を低減することが見出された25,27-29 ilepsy。 Lee らは 、難治性部分てんかん30を治療する際にATNの慢性脳深部刺激の際に約75％の発作頻度の平均の減少を報告している。 治療難治性てんかんに関する最近の臨床研究では、視床前核（ATN）22ターゲットとDBS手術後の有望な結果を示している。治療難治性てんかん（サンテトライアル）用のATNの二国間のDBSを受けた110人の患者との多施設ランダム化臨床試験では、約40％の31による発作頻度の低下を示した。この研究からの結果はまた、手術後2〜3ヶ月で観測された遅延最適抗てんかん作用に示唆した。戸田らによるさらなる研究。、彼らは動物モデル1において、後でポストDBS（日3-5）で起こって神経発生を実証したこれらの知見と裏付け。また、Encinasのら、海馬neurogeneを報告しているATN 32の高頻度刺激後の成体マウスの歯状回におけるSIS。これまでの研究33-35は、慢性側頭葉てんかんと学習障害、記憶障害と自発的な再発性運動発作との関連など、特定のてんかんのケースで減少海馬の神経新生を報告している。さらに、このような動物モデル33における慢性てんかん海馬におけるFGF2およびIGF-1などの神経幹細胞前駆要因の減少があった。これを考慮し、歯状回における神経新生の増加を示しているようなDBSなどのインターベンショナル戦略が研究のための刺激的な道である。これらの知見は、てんかんのための神経発生後のDBS治療の基礎となるメカニズムの中にさらに深く探求する私たちを奨励しています。我々は両方の一方的に（データは報告されていない）だけでなく、左右（代表的な結果で）ATNを目標とし、ラットの歯状回における上昇ニューロトロフィン（BDNF）の発現を見てきました。私たちのCurrent仮説はBDNF発現は、DBSの手術の抗てんかん効果に変換神経新生で最高潮に達した遺伝子発現カスケードを開始するということです。本稿では、DBSの恩恵を根底にあるメカニズムを研究するための魅力的なアプローチとして、遺伝子発現解析に続いて、ラットにおいてATNをターゲットとDBSの手術のための私達の方法を提示する。

<table><tbody><tr><td>脳深部刺激療法 Implanttic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Drill&nbsp;</td><td>ドレンメル</td><td>7700、7.2 V</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-803-6637</td><td>スケジュール III 規制物質、調達、使用、保管 機関の規則に従った</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-850-2280</td><td>スケジュールIII規制物質、調達、使用、保管機関の規則に従う</td></tr><tr><td>外科用ステープルConMed</td><td>Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr>縫<tr><td>合糸(3-0)&nbsp;</td><td>ハーバード装置</td><td>72-3333</td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジ(1 ml、29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>滅菌、麻酔投与に使用腹腔内</td></tr><tr><td>シリンジ(3 ml、25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>滅菌、鎮痛投与に使用 皮下</td></tr><tr><td>注射針</td><td>BD</td><td>305761</td><td>滅菌、バリ穴から壊れた骨片を取り除くために使用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>S25309B</td><td>一般的な滅菌への使用&nbsp;</td></tr><tr><td>目の潤滑剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>刺激装置</td><td>メドトロニック</td><td>モデル3628</td><td></td></tr><tr><td>DBS電極</td><td>ローズメディカルインスツルメンツ、CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>電極はプラチナ、同心円、バイポーラ</td></tr><tr><td>ベタジン(ポビドン-ヨウ素)&nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>使い捨てスワブスティック、切開する前に頭皮を滅菌するために使用&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;脳の解剖と海馬組織の分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクリルげっ歯類脳マトリックス</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>175-300</td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>剃刀の刃</td>VwRR55411-050<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギロチンはさみ</td><td>クラウス</td><td>18039</td><td>斬首のために、これらのはさみが清潔で作動状態に維持されていることを確認してください</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>コッドマンクラシック</td><td>34-4098</td><td>頭蓋骨から脳を除去するための使用</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72957-06</td><td>頭蓋骨から脳を除去し、解剖中の取り扱いに使用</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>ボストン・バイオプロダクツ</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;RNA抽出およびcDNAの準備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri</td>試薬<td>Σ</td><td>T9424</td><td>常にヒュームフードで使用し、取り扱い中は保護ゴーグルを着用してください。皮膚との接触を避け</td></tr>てください <tr><td>シリンジ (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>組織の均質化に使用</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP1145-1</td><td>常にヒュームフードで使用し、取り扱い中は保護ゴーグルを着用してください。皮膚</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I キット</td><td>アンビオン</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>上付き糸 ファーストストランド合成キット</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>卓上微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;定量PCR</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>Custom Oligos</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plates (96 wells)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>光学接着シート</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>RealタイムPCRマシン</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現の変化の解析

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

そのような大脳基底核、視床、及び視床下領域などの脳の様々な領域を標的脳深部刺激（DBS）手術は、薬物療法に応答しなかったいくつかの運動障害のための効果的な治療である。 DBS手術の分野における最近の進歩は、病的肥満、うつ病や強迫性障害など多様な他の条件にこの手術法の適用を拡張するために始めている。これらの拡大兆候にもかかわらず、ほとんどのDBS手術の有益な効果を促進する基盤となる生理学的メカニズムについて知られている。この問題に対する一つのアプローチは、電気刺激を受ける神経細胞における遺伝子発現解析を行うことである。以前の研究では、ラットの歯状回でその神経発生を示している視床1の前核の標的にDBSに誘発される。 ATNを標的DBS手術は、難治性てんかん治療のために広く使用されている。したがって、多くinteresのです私たちは電気的にATNを刺激することにより誘発される転写の変化を探索するためのT。本稿では、我々は、成体雄WistarラットにATNをターゲットに定位的に誘導DBSの手術のために私たちの方法論を説明します。また、遺伝子発現の変化を測定するための組織切開、RNA単離、cDNA調製および定量的RT-PCRのための後続のステップを議論する。この方法が適用され、一般的に臨床的に標的と大脳基底核および脳の他の領域を刺激するために変更することができる。ここに記載の遺伝子発現研究は、DBSのメカニズムを導くことができる分子のプレイヤーを発見するための標的候補遺伝子アプローチを想定している。

図1A及び図1Bは、対照遺伝子βアクチンのBDNFおよびGABRDの相対発現を示す。 BDNFは、ニューロトロフィンは、多くの場合、多くの神経疾患38-41で神経保護効果と関連している。それはてんかん患者に治療上の利益をもたらすATNの刺激に応答してBDNFの発現プロファイルを分析することは興味深い。 DBS刺激ポスト示された時点にわたってBDNFの遺伝子発現プロファイルを示す図1Aに、アップレギュレーションBDNF 3時間でピーク発現（非刺激より大きく3倍）と共にDBS手術後（0時間）すぐに観察されポスト刺激。この観察は、強化されたBDNF発現し、得られた神経保護はDBSの治療的利益に寄与し得ることを示唆している。別の遺伝子GABRD（ 図1B）は、定量PCR法を用いて調べた。 GABRDは、GABA受容体WHIですCHは、抗てんかん薬42を設計するための潜在的な目標の一つである。 GABRDの発現プロファイルは、3時間後にDBSに刺激されていない対照動物...

脳深部刺激療法(DBS)手術の治療効果の根底にあるメカニズムは調査が必要です。この論文で提示された方法は、DBS手術後の神経新生を促進する可能性のある候補遺伝子の遺伝子発現プロファイルを分析することにより、DBSによって引き起こされる細胞イベントを調べるための実験的アプローチについて説明しています。

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

この手順の全体的な目的は、視床前核に深部脳刺激を行い、ラット海馬における遺伝子発現の変化を調べることです。まず動物を麻酔し、次に手術の準備を行います。頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させます。次に、bgmaに対する適切な位置に穿孔を行います。DBS電極を挿入し、刺激を実施します。最後に、動物を安楽死させ、脳を摘出します。海馬を回収し、組織をRNA抽出およびcDNA調製のために処理し、qPCRを行います。最終的に、これらの結果から、深部脳刺激がラット海馬の遺伝子発現に影響を与えることが示されます。この手法は、脳深部刺激療法の治療効果の根底にある分子メカニズムは何か、といった脳深部刺激手術における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の意義は、てんかんだけでなく、パーキンソン病、アルツハイマー病、ジストニアなどの他の神経疾患の治療にも及びます。DPSは多くの神経疾患を治療するための外科的アプローチとして台頭しているため、手術の準備として、手術用パッドでワークベンチを覆い、バイオハザード廃棄物処理容器が利用可能であることを確認してください。ラットの体重を測定し、テキストプロトコルに従って麻酔量を算出します。定位固定手術台の電極ホルダーに2本の電極を装着して固定し、顕微鏡を用いて電極の先端が適切に整列しているかを確認します。電極の先端が硬い表面に触れないよう注意しながら、電極を3 mmの間隔で固定します。ケタミン・キシラジンを注入します。動物の腹腔内に投与し、足趾つまみ反射、呼吸数、および呼吸の深さと規則性を確認して、動物が外科的麻酔平面に達したことを確認します。動物をステレオタキシック装置に固定し、配置します。眼球の過剰な乾燥を防ぐために眼潤滑剤を塗布し、ベタジンと、アルコールまたは滅菌生理食塩水のいずれかで、交互に3回洗浄して頭皮を消毒します。動物を温水循環パッドの上に置くか、加温ランプを使用して、動物の体温を最適レベルに維持します。Paxos and Watsonラット脳アトラスに基づき、前視床核を標的とするための以下の立体定位座標を使用します。前後の方向は-1.6 mm、内外方向は1.5 mm、背腹方向は5.2 mmです。次に、頭蓋骨を露出させるため、頭皮を正中線に沿って切開します。リトラクターを用いて切開した頭皮を固定し、頭蓋骨を露出させます。その後、エタノールに浸した滅菌綿棒で切開部位を清浄し、縫合線を明確に露出させます。bgmaを特定し、穿孔位置のガイドとして黒色のマーカーで印を付けます。さらに2箇所、約1.5 mmの間隔で印を付けます。正中縫合線から両側へ外側に、そして冠状縫合線から後方に1.6 mmの位置です。次に、2つの穿孔を行うため、エタノールを用いてドリルの先端を消毒します。ドリルを45度の角度に保持し、どちらの穿孔部位の中心部でも過剰な熱が発生しないよう、2つの穴を頻繁に切り替えながら穿孔します。硬膜が露出するまで穿孔を続けます。先端をL字型に曲げた針を使用し、電極の挿入を妨げる骨の破片を除去します。骨片を除去する際は、その下の硬膜や脳組織を損傷しないよう注意してください。二極電極アセンブリを定位固定装置の回転ハンドルに固定し、ハンドルを90度の角度に固定します。定位固定装置の調整機能を用いて、左側の電極をbgmaの真上に正確に配置します。培地用の定位調整を用います。側方位置を正確に調整し、左電極をbgmaから左側に1.5 mm移動させます。これにより、2本の電極が冠状縫合に沿って完全に整列しつつ、bgmaから側方に1.5 mmの間隔を空けた状態になります。次に、前後方向の定位調整を行い、電極を冠状縫合から後方に1.6 mm移動させます。続いて、背腹方向の調整を用いて電極を下げ、まず穿孔部位が正しい位置にあるかを確認し、電極が穿孔部の粗い縁に触れることなくスムーズに挿入できるようにします。問題がなければ、電極を頭蓋骨表面から5.2 mmの深さまで挿入します。電極をリード線で刺激装置に接続し、130 hertz、2.5 volts、パルス幅 90 microsecondに設定します。任意の時間、高周波刺激を行います。刺激は片側または両側で実施します。刺激終了後、電極を慎重に除去し、3-0縫合糸または滅菌外科用ステープラーを用いて切開部を縫合します。ブプレノルフィンを皮下投与し、動物が通常の活動に戻るまで観察した後、飼育施設に戻します。カミソリを用いて、あらかじめ冷却した氷上のアクリル製脳マトリックスに脳を設置します。脳の最前方端から約7〜8 mmの位置で、脳を冠状に切断します。1回目の切開に対して、冠状かつ後方に2回目の切開を加え、厚さ約5 mmの脳スライスを切り出します。カミソリを用いて、脳スライスを氷冷したPBSが入ったペトリ皿に移し、2つの半球セクションに切り分けます。この際、どちらのセクションがそれぞれ左側および右側に相当するかを正確に記録してください。精密ピンセットと鋏を用いて海馬を慎重に摘出し、組織をドライアイスで急速凍結させ、後続のRNA抽出ステップの準備が整うまで-20 °Cで保存します。ここに示すテキストプロトコルに従って実施した結果、対照遺伝子であるbeta actinと比較したBDNFの相対的な発現レベルが、指定された各タイムポイントにおいて示されています。DBS刺激後。DBS手術直後にBDNFの上昇が観察され、刺激後3時間で発現のピークに達します。この観察結果は、BDNF発現の亢進とそれに伴う神経保護作用が、てんかん患者に対するDBSの治療効果に寄与している可能性を示唆しています。このパネルは、GABA受容体であるG-A-B-R-Dの発現を示しており、DBS後3時間において、刺激を与えなかった対照群と比較して刺激を与えた動物で発現が増強していることが分かります。GABAアゴニストが効果的な発作抑制剤として使用されていることを考慮すると、DBS後にG-A-B-R-Dの発現が増強していることは、GABAの関与およびDBSの抗てんかん効果の可能性を示唆しており、非常に興味深い観察結果です。本手順に続き、ウェスタンブロッキングやクロマチン免疫沈降など、その他多くの標準的な分子生物学的手法を実施することが可能です。これにより、タンパク質発現の変化、翻訳後修飾、特定の遺伝子プロモーター領域における転写因子の占有率などの疑問を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、ラットにおける深部脳刺激手術の実施方法について十分な理解が得られるはずです。海馬組織を単離し、遺伝子発現の変化を解析します。

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Casquero-Veiga, M. et al.ラットの脳深部刺激によって誘発される活動パターンを明らかにするためのin vivo陽電子放出断層撮影法J. Vis. 経験。 (2022)。このビデオは、ラットモデルにおけるFDG-PETイメージングを用いた脳深部刺激療法(DBS)の代謝効果を実証する。FDG 投与、DBS アプリケーション、および代謝活動が増加または抑制された脳領域をマッピングするための PET/CT...

In vivo FDG-PETを使用したラットの急性脳深部刺激によって誘発される代謝神経調節の評価

出典: Selvakumar, T., et al., Analysis of gene expression changes in the rat Hippocampus after Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus.J. Vis. Exp.(2015年)このビデオでは、ラットの脳に電極を埋め込んで脳深部刺激 (DBS)...

ラットモデルにおける海馬ニューロン活動に対する脳深部刺激の影響

このビデオでは、セロトニン症候群に罹患したラットの脳組織において、オリゴヌクレオチドプローブを用いたセロトニン受容体RNA合成の検出を実演しています。このプロトコールには、組織の前処理、プローブハイブリダイゼーション、および顕微鏡下でセロトニン受容体RNA発現を可視化および定量するための酵素検出が含まれます。...

オリゴヌクレオチドプローブを用いたラット脳切片におけるRNA発現の研究のためのin situハイブリダイゼーション

我々は、海馬ニューロンまたは定量的リアルタイムPCRおよび/または全ゲノムマイクロアレイを用いてその後の遺伝子発現解析のために負傷したラット脳の凍結切片からの単一ニューロンの濃縮された集団を得るためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用する方法について説明します。...

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

このプロトコルは、齧歯類における同時機能的磁気共鳴画像法及び深部脳刺激のための標準的な方法を記載している。これらの実験のツールを併用することは事実上すべての脳のターゲットに電気的刺激に反応して世界的な下流の活動の探査が可能になります。...

げっ歯類での同時のfMRIと脳深部刺激

ラットの視床下核(STN)に電極を埋め込む方法が説明されています。STNのより良い位置特定は、マイクロレコーディングシステムを使用することで達成されました。さらに、動物の頭部と刺激装置との間の長期的な接続を特徴とする刺激セットアップが提示されます。...

微小電極は、長期的な脳深部刺激のためのラットの視床下核に電極の移植ガイド付き

脳深部刺激療法(DBS)はパーキンソン病の効果的な治療選択肢です。私たちは、ラットの新規刺激パラダイムをスクリーニングするための研究デザインを確立しました。このプロトコルでは、DBS...

Hemiparkinsonianラットにおける脳深部刺激効果のモーターの成果を評価するための新しいアプローチ：階段室とシリンダーテスト

私たちは、ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)を適用し、25mmの字型コイルを両側の頂点から1cm外側に配置し、コイルを45°角度付けました。rTMSには、社内の水冷システムを20分以上使用しました。...

ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激

このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング...

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

経頭蓋直流電流刺激 (tDCS) は、精神疾患を治療するために提案された治療法です。動物モデルは、tDCS による特定の生物学的変化を理解するために不可欠です。このプロトコルでは、慢性埋込電極を使用する Tdc マウス...

マウスにおける経頭蓋直流電流刺激 (tDCS)

in vivo FDG-PETによる急性脳深部刺激療法により誘導される代謝性神経調節を評価するための前臨床実験法について述べる。この原稿には、定位固定装置手術から刺激治療の適用、PET画像の取得、処理、分析まで、すべての実験ステップが含まれています。...

生体内 ラットの脳深部刺激による活動パターンを明らかにする陽電子放出断層撮影法

学ぶ視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現変化の解析手法。BDNFやGABRDの発現変動を定量的RT-PCRで測定し、てんかん治療の分子メカニズム解明に貢献します。

視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現の変化の解析

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