視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現の変化の解析

この手順の全体的な目標は、視床前核の脳深部刺激療法を行い、ラット海馬の遺伝子発現変化を研究することです。これは、最初に動物に麻酔をかけることによって達成されます。次に、動物は手術の準備をします。

頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させます。次に、bgmaに対して正しい位置に、バーの穴が開けられます。DBS電極を挿入し、刺激を行います。

最後に、動物は安楽死させられ、脳は解剖されます。海馬を除去するために、組織をRNA抽出のために処理し、CDNA調製とQPCRを行います。最終的に、この結果は、脳深部刺激療法がラット海馬の遺伝子発現に影響を与えることを示しています。

この方法は、脳深部刺激療法手術の治療効果の根底にある分子メカニズムは何かなど、脳深部刺激療法手術における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味するところは、てんかんだけでなく、パーキンソン病、アルツハイマー病、ジストニアなどの他の神経疾患の治療にも及びます。DPSは、多くのニューロン障害を治療するための外科的アプローチとして浮上しているため 手術の準備をするには、手術パッドを使用して作業台を覆い、バイオハザード廃棄物処理が利用可能であることを確認してください。

ラットの体重を量り、テキストプロトコルマウントに従って麻酔線量を計算し、定位手術フレームの電極ホルダーに2つの電極を固定し、顕微鏡で電極の先端が適切に位置合わせされているかどうかを検査します。電極は、硬い表面の電極先端に触れないように注意して、3mm離して固定します。ケタミンキシラジンを注入します。

動物に腹腔内麻酔を混合し、つま先のつま先挟み反射、呼吸数、呼吸の深さと規則性を確認して、動物が麻酔の手術面に達したことを確認します。動物を定位フレームに固定して配置します。動物の目にアイ潤滑剤を塗布して過度の乾燥から保護し、ベタジンとアルコールまたは滅菌生理食塩水のいずれかの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。.

動物を循環式温水パッドに置くか、暖房ランプを使用して動物の体温を最適なレベルに保ちます。Paxos ラットと Watson ラットの脳アトラスに基づいて、視床前核または NT 前後陰性 1.6 mm を標的とするために、次の定位座標を使用します。メディアは横方向に1.5ミリメートル、背側は5.2ミリメートルです。

次に、頭皮矢状を切開して頭蓋骨を露出させます 一対のリトラクターを使用して、切開した頭皮を固定して頭蓋骨を露出させます。次に、滅菌綿棒をエタノールに浸し、切開した領域を清掃して縫合糸をはっきりと露出させます。bgmaの位置を特定し、黒いマーカーを使用して市場に出して、バーの穴の位置をガイドします。

約 1.5 mm のところにさらに 2 つのマークを付けます。メディアは矢状縫合糸から両側に横方向にあり、冠状縫合糸の後方に1.6ミリメートルです。次に、2つのバー穴を作るために、エタノールを使用してドリルの先端を消毒します。

45度の角度で保持されたドリルを使用して、バー穴を頻繁に切り替えてドリルを開け、どちらかのバー穴の中心に過度の熱が入らないようにします。硬膜が露出するまで穴あけを続けます。針の先端をL字型に曲げた針で、電極の挿入を邪魔する骨片を取り除きます。

骨片を取り除く際には、下にある硬膜や脳組織に損傷を与えないように注意してください。2電極アセンブリを定位フレームの回転ハンドルに固定し、ハンドルを90度の角度で固定します。定位フレームの調整を使用して、左電極をbgmaの真上に配置します。

メディアの定位調整を使用します。横方向の位置決めにより、左電極がbgmaの左側に1.5ミリメートル正確に移動し、冠状縫合糸に沿って完全に整列した2つの電極が間隔を空けて配置されるようになりました。BGMAから横方向の1.5ミリメートルメディア。

次に、前方後方定位調整を行いながら、電極を冠状縫合糸の1.6mm後方に移動します。次に、背側腹側調整で電極を下げて、まずバー穴が正しい位置に作られているかどうかを確認します。その場合は、頭蓋骨の表面から5.2ミリメートルの深さまで電極を挿入します。

リード線を介して電極を130ヘルツ、2.5ボルト、90マイクロ秒のパルス幅に設定された刺激装置に接続します。高周波刺激を所望の時間送達します。片側または両側の刺激を行う。

刺激が行われた後、電極を慎重に取り外し、3つのゼロ縫合糸または滅菌外科用ステープルを使用して、切開部を縫合し、ブプレノルフィンを皮下投与し、動物が正常な活動に戻るまで監視し、その後、飼育施設に戻します。カミソリの刃を使用して、氷の上の予冷アクリル脳マトリックスに脳を置きます。脳の最前端から約7〜8ミリメートルのところで脳のコーリーを切断します。

2番目のカットをコーリーと最初のカットの後方に作成して、約5ミリメートルの厚さの脳スライスを取り除くことができるようにします。カミソリの刃を使用して、脳のスライスを氷冷PBSの入ったシャーレに移し、2つの半球状セクションを切断し、どちらのセクションがそれぞれ左側と右側に対応するかに注意します。細い鉗子およびはさみを使用して、慎重に海馬の閃光を取除き、ドライアイスの上で組織を凍結し、示された時間ポイントにわたる制御遺伝子ベータアクチンと比較したBDNFの相対的な発現レベルであるここに示されたテキストプロトコルに従って実行される後続のRNAステップの準備ができるまで摂氏マイナス20度で保存する。

DBS刺激後。BDNFのアップレギュレーションは、DBS手術の直後に観察され、刺激の3時間後にピーク発現が観察されます。この観察結果は、BDNF発現の増強とそれに伴う神経保護が、てんかん患者に対するDBSの治療上の利益に寄与する可能性があることを示唆しています。

このパネルは、GABA受容体であるG-A-B-R-Dの発現を示しており、DBSの3時間後では、刺激を受けていない対照と比較して、刺激を受けた動物での発現が増強されていることが示されています。GABAアゴニストが効果的な発作抑制剤として使用されることを考えると、DBS後のG-A-B-R-D発現の亢進が観察され、GABAの可能性のある役割とDBSの抗てんかん効果が示唆されることは興味深い。この手順に従います。

ウェスタンブロック、クロマチン免疫沈降法、その他多くの標準的な分子生物学的アッセイなどの他の方法も実施できます。これは、タンパク質発現の変化、翻訳後修飾、特定の遺伝子プロモーター領域における転写因子の占有率などに関する疑問に答えるのに役立ちます。このビデオを見れば、ラットの脳深部刺激療法の方法についてよく理解できるはずです。

海馬組織を単離し、遺伝子発現の変化について分析します。