マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

この手順の全体的な目標は、マウスの寒さに対する反応性を測定することです。これは、最初にガラスを目的の温度まで冷却または加熱することによって達成されます。2番目のステップは、マウスが休むまでマウスを順応させることです。

3番目のステップは、ドライアイスパウダーを注射器でペレットに圧縮することです。最後のステップは、ドライアイスペレットとストップウォッチを使用してマウスをテストし、引き出しの待ち時間を測定することです。最終的に、コールドプランターアッセイは、自由に行動するマウスの寒さに対する応答性と適応を測定するために使用されます。

アセトン試験やコールドプレート試験などの既存のアッセイに対する当社のアッセイの主な利点は、さまざまな環境条件下でベースラインで過敏症と鎮痛の両方を試験できることです。ただし、この方法では、マウスの冷えに対する反応性についての洞察を得ることができます。また、サルやラット、人間などの他のシステムでも使用することができます 手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるダニエル・ブレナーです。

ガラス表面を清掃した後、T型フィラメント熱電対プローブをガラスプレートの中央の表面にラボ用テープで固定します。動物の囲いをガラス板の中央に沿って一列に並べて置きます。次に、熱電対プローブを中央の動物用エンクロージャーに通し、データロガーに差し込みます。

データロガーをオンにし、自動シャットダウン機能を無効にします。付属のケーブルでデータロガーをコンピューターに接続します。マウスとガラスの下の位置ミラーとの間の視覚的な相互作用を防ぐために、動物の囲いを黒いインサートで分離し、囲いの下側が見えるようにします。

テストを開始するには、動物の両側のガラスプレートにアルミ製の箱を置き、一定の距離で囲みます。摂氏30度でテストする場合は、動物の囲いから0.25インチ離れた場所に配置されたアルミニウムボックスに温水サーキュレーターを接続します。排水穴を塞いでいる間に、箱に半分の水を入れます。

アルミボックスからのお湯が両側のサーキュレーターのリザーバーに直接排出されるようにサーキュレーターを配置します。各サーキュレーターに水を追加する必要があります。金属製の箱がいっぱいになったら、サーキュレーターを摂氏45〜60度に設定し、アルミ製の箱に安定したお湯を入れます。

メガネが目的の温度範囲に達したら、マウスをプレートの上のエンクロージャーに入れます。マウスが装置と温度に順応するのを待ちます。これらのマウスは2.5時間順応します。

順応期間の終わりに近づいたら、氷のバケツにドライアイスを半分ほど入れ、ハンマーまたは木槌を使用してドライアイスを粉末に粉砕します。これは、マウスの邪魔にならないように、行動室の外で行ってください。次に、かみそりの刃またははさみを使用して、3ミリリットルの注射器の上部を切り取ります。

次に、21ゲージの針を使用して、シリンジの反対側に3つの穴を2セット突き刺し、昇華によって発生する圧力を下げながら、ドライアイスを行動室に圧縮し、シリンジチャンバーをドライアイスパウダーで半分満たします。シリンジの切り口を平らなものに押し付け、プランジャーで粉末をしっかりと圧縮します。圧縮されたドライアイスパレットの先端をシリンジの端を超えて伸ばします。

次に、ガラスに4本の足がすべてあり、動いていないが完全に眠っていないマウスをテストします。ミラーを使用して優しく、しかししっかりと照準を合わせ、平らなペレットをマウスの後足の下のガラス面と同じ高さに押し付けます。同時に、タイマーのスタートを押します。

マウスが冷却されたガラスから垂直または水平に移動したら、タイマーを停止してドライアイスペレットを取り外します。ただし、マウスが足を非常に短く動かしてから冷却面に戻す場合は、マウスが永久に移動するまでタイミングと刺激を続けます。マウスが冷却されたガラスから離れない場合は、20秒後に刺激を停止します。

動物の各足に少なくとも3つの値が収集されるまで、このテスト手順を繰り返して、摂氏17度でマウスをテストします。示したように実験を繰り返しますが、アルミ製の箱に温水を入れる代わりに、湿った氷を使用し、箱をエンクロージャーから約0.25インチ離してマウスをテストします。摂氏12度では、ドライアイスが使用されますが、ボックスはエンクロージャーから1.25インチ離れて配置されます。

この代替プロトコルは、プレートの温度が安定した後ではなく、プレートの温度が下がっているときにマウスをテストします。これにより、装置のセットアップ後にマウスの適応を発生時にテストすることができます。前回と同様に、前述したように実験を行い、室温で測定を行います。

ベースラインのレイテンシが室温で測定されたら。前述の手順を使用して、空のアルミニウムボックスをドライアイスで満たし、両側のエンクロージャーから1.25インチ離して配置します。最後に、実験を繰り返して、ガラス板が冷えるときにレイテンシを測定します。

できるだけ頻繁に測定を行います。このグラフは、12°C、17°C、23°C、または30°Cから始まるマウスの平均引き出し遅延を示しています。引き出しの待ち時間は、すべての温度で一貫しています。

鎮痛効果は、ここに示すようにコールドプランターアッセイを使用して測定できます。モルヒネ1キログラムあたり1.5ミリグラムの皮下注射は、注射の30分後にボンフェローニのポストホックテストによる二元療法によって測定されたマウスの離脱潜伏を増加させます。モルヒネの注射と生理食塩水の注射との間に有意差はありません。

マウスの過敏症もここで測定できます。10マイクロリットルの完全なfrosアジュバントのプランター内注射は、ボンフェローニポストホックテストによる双方向イノーバによって測定されるように、注射後2時間および3時間のマウスの離脱潜伏を大幅に減少させます。.同じマウスに4時間でモルヒネの皮下注射を投与し、4.5時間でのすべての離脱遅延は、事後試験で一元介入で測定した3時間と比較して有意に高かった。

モルヒネが注射後5.5時間で代謝された後、CFAを注射されたマウスは、Bonferroniの二元療法による二元療法で測定した生理食塩水を注射したマウスよりも離脱遅延が低かった。冷却環境の変化への適応は、このアッセイでリアルタイムに測定できます。野生型マウスは、ガラス板が冷えるときの離脱潜伏時間が同じであり、CPAで測定できるよりも早く冷却温度に適応することが示唆されており、CPAではどのグループ間でも有意差はありませんでした。

しかし、マウスにU7 3 1 2 2を注入してPIP 2の加水分解を阻止すると、温度のプレートが下がるにつれてそれらの潜伏時間が減少し、適応障害が示唆されることを示唆する、この手法は、順応時間を含めて5時間で行うことができる。このビデオを見た後、覚醒して自由に行動するマウスの冷感と適応を測定する方法をよく理解しているはずです。ドライアイスでの作業は非常に危険であり、この方法では適切な換気と空気のクリアランスを確保する必要があることを忘れないでください。