Name: 上向流嫌気性スラッジブランケット炉内の海洋堆積物やトリクロロエチレンの削減からSulfidogenic汚泥の開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: 学ぶ海洋堆積物からの硫黄還元性スラッジ開発とUASB反応器を用いたトリクロロエチレン還元評価法。この手法は有機汚染物質のバイオ修復に応用可能です。

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著者は、Instituto Politécnico Nacionalの助成金20120110、20130399、20140239 SIPおよびInstituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal Mexico(PICS 08-79, ICYT-DF, 2009-2012)からの財政的支援に感謝しています。また、Selene Montserrat García-Solaresに授与された大学院奨学金(225806)と、助成金82627による財政支援を提供してくれたCONACYT – Mexicoにも感謝します。

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</ol>

著者のSelene Montserrat García-Solares、Claudio Garibay-Orijel、およびClaudia Guerrero Barajasは、2012年に「硫酸塩および塩素化化合物を多く含む産業廃水の嫌気性処理プロセス」と題された特許を取得するための申請を(発明者として)提出しました。この提出物は、フォーマットの段階で承認されています。この提出物には、Instituto Politécnico Nacionalが権利所有者としています。

環境バイオテクノロジーにおけるsulfidogenesisのいくつかのアプリケーション、細菌を発酵する廃水処理であるとのコンソーシアム中の硫酸還元菌の代謝の最も使用されるアプリケーションの一つがあります。 UASB反応器は、高硫酸濃度の産業廃水処理の主な設計アプローチの一つです。本研究では、UASB反応器内での海洋堆積物からsulfidogenic汚泥を取得するためのプロトコルを提示します。海洋堆積物からsulfidogenic汚泥を取得するためのプロトコル内の重要なステップである：（1）反応器内に配置される堆積物試料の同性の促進、（2）硫酸の右濃度と揮発性脂肪酸の供給量（COD / SO 4 2-）の比、（3）分析硫酸塩、硫化物、定期COD及びpHが、（4）微量金属およびビタミンバッチが開始されるたびに含まれている基礎培地をリフレッシュ。それはsludgの開発することを考慮することが重要ですeは、元のサンプルの微生物群集に、右の物質収支（硫酸とCOD）に大きく依存します。それが開発する活動を硫酸還元のための時間がかかりますが、バイオリアクターは、再循環ポンプを停止したり、温度制御を停止するこ...

環境バイオテクノロジーへの最も重要な貢献の一つは、（接種材料）を使用した汚泥は硫酸還元条件下で実行することができたしたバイオリアクターの設計でした。硫酸還元（SR）は、COD、重金属や有機汚染物質、SR汚泥1の望ましい特性になるという事実の同時除去に加えて、硫酸塩の高濃度で含有廃水流の処理を可能にします。硫酸で汚染された排水のいくつかの例としては、皮なめし工場、紙、医薬・化学品製造業1から来ます。メタングラニュール汚泥がsulfidogenesis 2に適合されている場合しかし、文献のほとんどはsulfidogenic汚泥を指します。この適応は、一般的に、バイオリアクター内のCOD / SO 4 2-比を操作し、汚泥2,3にメタンを阻害する化学物質を添加することによって達成されます。長い時間メートルに加えて、バイオリアクターで使用sulfidogenic汚泥はの適応から得られた場合AY sulfidogenic顆粒の形成を必要とする、メタン生成菌と硫酸減速や硫化物の高濃度汚泥の許容範囲との間の競合が発生する可能性のある主要な問題のいくつかであります条件を硫酸還元するため、主にメタン生成汚泥。本研究では、我々は時間をかけてその硫酸還元活性を評価し、実験を行う、上向流嫌気性スラッジブランケット型原子炉（UASB）は熱水噴出堆積物から主にsulfidogenic汚泥（プンタミタ、ナヤリット、メキシコ）を取得する手順を説明還元的脱塩素化への適用を評価しました。それはそのサイトで、特定の場所4に生息する微生物群集が示す硫酸還元活性に起因する硫化物の形成があることが報告されているため、堆積物の場所を選択しました。 断絶があります。sulfidogenesisにメタングラニュール汚泥を適応させるの上に堆積物からこのsulfidogenic汚泥を得る際にアル利点。これらの利点のいくつかは、（1）（3）が存在する汚泥を適応さメタン汚泥で動作他UASBと比較して硫化物の比較的高濃度を許容し、（2）、バイオリアクターを操作するための顆粒を形成する必要がなく、かつ酢酸スラッジの形成を促進する培地に含まれる揮発性脂肪酸の混合物で使用してもメタンを有する基板には競合しません。 海洋堆積物が細菌を発酵し、わずか数5,6を言及する細菌を脱ハロゲン化、硫酸塩還元菌などの微生物の多種多様な自然のプールであるため、この手順はsulfidogenesisを促進するために行きました。このプロトコルを使用して、海洋堆積物から開発コンソーシアムの種類は、硫酸還元したがって、高いS効率を示すことができます<html> ulfate時間とメタン生成菌と硫酸還元菌の毒性として報告よりも高い濃度で硫化物に高い許容度にわたって活性を低下させます。一方、脱ハロゲン化機能は、プロトコルに従うことにより、堆積物に示されている可能性があるが、ここで提案されているが、それは元の微生物のコミュニティに依存してもよいです。この仮定は、還元的脱塩素は呼吸やcometabolismのいずれかによって発生する可能性があるという事実に基づいて行われ、海洋微生物群集7に促進することができる両方の条件。これらの揮発性脂肪酸は、硫酸塩還元菌のいくつかの株によって使用されるため、汚泥を得るために、堆積物の培養基質として、酢酸、プロピオン酸および酪酸の混合物を用いて行きました。これらの酸は、海の堆積物5,6における炭素質材料に関する文献にはいくつかの報告によれば、また、しばしば、海洋堆積物中に見られる炭素化合物の一種です。 コンテンツ &quot;&gt;最後に、世界中の地下で発見された最も毒性の強い化合物および他の水域の一部は、トリクロロエチレン（TCE）やパークロロエチレン（PCE）のような塩素化溶媒である。これらの化合物は、人間のみならず毒性があるが、また、まだ米国8の環境保護庁が優先汚染物質と考えられている。本研究ではsulfidogenic汚泥をしている濃度でTCEを削減するその能力にテストされた実験を提案した微生物、特にTCEへメタン生成条件9,10の下で塩素化合物の生分解について報告範囲。それは、塩素化合物の生分解に関する研究のほとんどはメタン生成条件9,10の下で行われていることを言及する価値がある。我々は、このプロトコルで提案されたTCEを用いた実験であることを考慮します汚泥の潜在的なアプリケーションの良い例。この実験の目的は、EとしましたTCEへの汚泥の許容度および活性を硫酸還元のTCEの影響を評価します。 （1）（2）CODを除去し、（3）削除し、硫酸塩を除去する：塩素化合物の生分解に関する研究のほとんどはメタン条件下で行われることを考慮すると、このプロトコルは、スラッジの形成を同時にするために使用され得ることを示唆する塩素化合物。さらなるステップは、（ほかに硫酸塩およびCODする）メタン生成条件で評価することができない二つの条件をTCEと重金属の同時除去に汚泥​​を評価する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>トリクロロエチレン&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>251402</td><td></td></tr><tr><td>cis-1,2-ジクロロテヒレン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トランス</エム>-1,2-ジクロロエチレン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D-62209</td><td></td></tr><tr><td>塩化ビニル スコッティ標準</td><td>スーパーコ</td><td></td><td>1,000 ppm v/v 窒素中</td></tr><tr><td>エテン スコッティ標準</td><td>スーパールコ</td><td></td><td>99% 純度</td></tr><tr><td>ポンプ</td><td>Masterflex</td><td></td><td>モデル7553-75</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガスタイトシリンジ&nbsp;</td><td>任意の</td><td></td><td>100および200マイクロリットルの</td></tr><tr><td>UASBガラス反応器</td><td>任意の</td><td></td><td>設計</td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ&nbsp;</td><td>任意の</td><td></td><td>FID検出器</td></tr><tr><td>、キャピラリーカラム、SPB-624</td>、<td>supelco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、pHメーター</td><td>、任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイトンチューブ、</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、基礎媒体試薬</td><td>、任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量金属試薬</td><td>、任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビタミン溶液試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸ナトリウム</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>揮発性脂肪酸</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COD測定キット</td><td>HACH</td><td></td><td>範囲 0-15,000 mg/L</td></tr><tr><td>TOPO-TAクローニングキット pCR&reg;4.0;&nbsp;</td><td>Invitrogen, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S.N.A.P. TM Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

上向流嫌気性スラッジブランケット炉内の海洋堆積物やトリクロロエチレンの削減からsulfidogenic汚泥の開発

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

微生物の硫酸塩削減の重要性は、それが環境バイオテクノロジーで提供するさまざまな応用に依存しています。人工的な硫酸塩の減少は化学酸素要求量(COD)および重金属と共に硫酸塩の高濃度を取除くために産業廃水処理で使用される。このプロセスへの最も一般的なアプローチは、主にメタン生成粒状汚泥を硫化に適応させることによって硫化性汚泥を得る嫌気性バイオリアクターを使用することです。このプロセスには時間がかかる場合があり、スラッジ中にメタン生成菌が存在するため、基材の競争が常に排除されるわけではありません。本研究では、熱水噴出孔の堆積物が微生物の元来の供給源である硫化汚泥を得るための新しいアプローチを提案する。硫酸塩と揮発性脂肪酸の存在下で発達する微生物群集は、硫化物による阻害を示さずに長期間にわたって硫酸塩の還元を維持するのに十分な広さです。
このプロトコルは、上流嫌気性スラッジブランケット(UASB)タイプの反応器の堆積物からスラッジを生成する手順を説明しています。さらに、議定書は、トリクロロエチレン(TCE)などの非常に有毒な有機汚染物質のモデルを還元的脱塩素化によって除去する汚泥の能力を実証する手順を示しています。プロトコルは、(1)スラッジの形成とUASBでのその硫酸塩還元活性の測定、(2)スラッジによるTCEを除去する実験、および(3)TCE還元後のスラッジ中の微生物の同定の3つの段階に分かれています。この場合、堆積物はメキシコにあるサイトから採取されましたが、海洋堆積物は硫酸塩還元細菌が豊富な微生物の天然プールであるため、堆積物の異なる供給源が採取された場合、この手順を使用して硫化汚泥を生成する可能性があります。

バイオリアクター中の硫酸化の典型的な動作は、 図5に示されている。これは、操作硫酸還元の最初の週の間に遅くなることを注意することが重要です。しかし、ゆっくりと時間をかけて硫酸の90％以上の消費量は接種物は硫酸還元菌が濃縮された、したがって硫酸を削減し、ことのできる微生物群集を、開発していることを示しています。図中の異なる期間が硫酸還元が経時的にその速度を増加させたことを示しています。初めに、バッチは、（期間I）を低減するために硫酸を20日かかったその減少率が増加し、それが供給される硫酸塩（期間II）を低減するのに約10日かかりました。期間IIIは、硫酸還元でより少ない変化を提示し、これは、それが、図5に見られるように10日間の平均で達成された。この期間の後、硫酸塩の還元は4,000 V 4日間の平均（期間IV）及び期間での取り硫酸塩のmg / Lで未満24時間で消費されました。バイオリアクターでのパフォーマンスは、24時間のHRTでの200日後に連続モードに設定されています。 <img alt="図5" src="...

微生物の硫酸塩の減少は、環境バイオテクノロジーにおいて非常に重要なプロセスです。硫化反応器の成功は、他の要因の中でもとりわけ、スラッジの微生物組成に依存します。ここでは、還元的脱塩素化の目的で、UASB反応器の熱水噴出孔堆積物から硫化性汚泥を開発するためのプロトコルを紹介します。

上向流嫌気性スラッジブランケット炉内の海洋堆積物やトリクロロエチレンの削減からSulfidogenic汚泥の開発

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

本実験の全体的な目的は、AUASB（嫌気性上向流式スラッジブランケット）リアクターを用いて海洋堆積物から硫化物生成スラッジを調製し、トリクロロエチレン（TCE）の還元に対する性能を評価することである。これは、海洋堆積物を回収して多様な微生物群を得ることで達成される。これらの微生物群は、適切なミネラル、培地ビタミン、および電子ドナーとして機能する揮発性脂肪酸が存在する環境下で、硫酸塩還元菌を濃縮させる。第二のステップとして、海洋堆積物をAUASBリアクターへの接種源として使用し、硫酸塩還元活性が定常状態に達するまで、数週間にわたって硫酸塩還元条件下に設定・維持する。次に、硫酸塩生成能を持つUASBリアクター内のコンソーシアムを用いて、TCE還元能を評価し、硫酸塩生成が活性である状態で汚染有機物を変換する汚泥の能力を検討します。結果から、バイオリアクター内で硫化物生成が確立され、微生物コミュニティの解析に基づき、硫酸還元条件下で汚泥がTCEを還元できたことが示されました。これは、TCEの還元が硫酸還元細菌と発酵細菌からなるコンソーシアムによって行われたことを示唆しています。メタン生成菌の汚泥をTCEに馴化させる既存の手法と比較した本手法の主な利点は、得られた汚泥が高濃度の硫酸塩に耐性があり、メタン生成菌との基質競合が生じない点にあります。一般的に、この手法に不慣れな人は、スロットがすぐに形成されることを期待するため、苦労することがあります。栄養塩や硫化物のバイオリアクターへの添加頻度が、必要とされるよりも少なすぎたり多すぎたりする傾向があります。このようなアプローチは、系の不均衡を招くだけの結果となります。反応の経過と次のステップへの適切なタイミングを把握するために、COD、硫酸塩、および硫酸塩の定期的な分析を行うことが有用です。有機物の分解と汚染物質の除去を兼ね備えた、極めて活性の高い硫酸塩生成系を構築したいと考えたことが、この手法を考案したきっかけとなりました。これは、特に一部の汚染物質に重金属が混在している場合、メタノゲン条件下では達成できないことです。コンソーシアム内の細菌の同定には、高性能な機器を用いた一般的な手法を用いました。分析の標的としたのは16S rRNA遺伝子領域であり、本手順を開始することで、細菌に関する興味深い全般的知見を得ました。テキストプロトコルに従って海洋サンプルを採取します。ラボに到着後、堆積物サンプルを大量に採取し、適切なメッシュを使用して堆積物から炭素質物質の大きな破片を除去します。堆積物をメッシュに通した後、選択した部分を混合して均質にします。本研究では、全有効容量が3 Lの上昇流式嫌気性スラッジブランケットガラスリアクターを使用します。堆積物、基礎培地緩衝液、および揮発性脂肪酸の最終容量が、リアクターの最終有効容量と等しくなるようにしてください。リアクターのワーキングボリュームを考慮して、塩化リン酸窒素、マグネシウム塩、微量金属、およびビタミンを含み、重炭酸緩衝液で調製した基礎培地のストック溶液を準備します。次に、酢酸、プロピオン酸、および酪酸で構成される揮発性脂肪酸のストック溶液を準備します。化学的酸素要求量（COD）の比率を2.5：1：1とし、リアクター内の最終COD濃度が2.7 g/Lになるようにします。最後に、硫酸イオンの最終濃度が4,000 mg/Lになるように、適切な濃度の硫酸ナトリウムストック溶液を調製します。溶液の調製が完了したら、堆積物がリアクターの底まで到達するように、基礎培地の一部と混ぜ合わせてリアクターに投入します。残りの基礎培地と緩衝液を、揮発性脂肪酸溶液および硫酸溶液と混合します。揮発性脂肪酸溶液を液体に注ぎ入れます。次に、混合した溶液をリアクターに加えます。リアクターの接続部と配管をリサイクルポンプにセットします。次に、リサイクル流速を60 milliliters per minuteに設定します。温度チャンバー内のバイオリアクターを定期的に34 degrees Celsiusに設定してください。温度変動が小さいことを確認します。最後に、ガス置換カラムへの接続を行います。1週間の培養後、液体サンプルを5〜7 mL採取し、COD、硫酸塩、硫化物含有量およびpHの分析を行います。標準法に従い、メチレンブルー法を用いて液体中の硫化物を分析します。まず、25 mLのメスフラスコに酢酸亜鉛溶液を5 mL入れます。次に、サンプルの200 µLを酢酸亜鉛溶液に速やかに加えます。続いて、DMP溶液2.5 mLと硫酸鉄(III)アンモニウム溶液125 µLを加えます。メスフラスコに蒸留水を加え、25 mLまで満たします。青色が安定するように、反応が進行するまで30分間待ちます。反応が完了した後、少なくとも15分間、かつ最大60分まで待機します。分光光度計でサンプルを測定するため、最終的な青色溶液を波長670ナノメートルで読み取ります。ターボ比色法を用いて、硫酸バリウムとして硫酸量を定量します。まず、25mLのメスフラスコに5mLの調整液を入れます。次に、あらかじめ11,320 ×gで遠心分離したサンプルを1 mL加えます。メスフラスコに蒸留水を加え、全量を25 mLにします。ここに塩化バリウムを1 g加え、ボルテックスミキサーで1分間混合します。硫酸バリウムが形成されるまで4分間待ち、分光光度計を用いて波長420 nmでサンプルの測定を行います。COD測定の準備として、測定の妨げとなる残存硫化物を除去するため、サンプルを十分に遠心分離します。遠心分離後、COD測定キットの反応バイアルにサンプルを2 mL加えます。バイアルを密閉し、穏やかに攪拌して混合物を均質化します。別の反応バイアルに2 mLの蒸留水を加え、混合物を均質化してブランクを調製します。バイアルを分解装置に入れ、150 °Cで2時間加熱します。その後、バイアルを取り出し、暗所で冷却させます。分光光度計を用いて、波長 620 nanometers でバイアルの吸光度を測定します。次に、ガス置換カラムからガス量を確認します。硫酸塩が消費されたら、各バッチに新しい培地と栄養素を供給してください。以前と同様に、硫酸塩の消費率が24時間以内に80%を超え、その状態が1週間以上続いた場合、リアクターの運転を連続モードに切り替えます。ポンプの流量を調整して水力学的滞留時間（HRT）を24時間に設定し、硫酸塩濃度を4 g/L、CODを10 g/Lに維持します。1 HRTサイクル後にリアクターを停止し、以前と同様に、COD濃度10 g/Lを用いて各バッチに新鮮な培地と新しい栄養素を供給します。バイオリアクターへの供給が完了したら、液相を5〜7 mL分サンプリングし、COD、硫酸塩、硫化物、およびpHの分析を1時間ごとに実施してください。また、TCE試験で発生したガス量を記録します。バイオリアクターの液相における最終濃度が300 µMとなるように、TCEのストック溶液を調製してください。34 °CにおけるTCEのヘンリー定数（無次元定数）を用いて、化合物のヘッドスペースへの分配を検討します。次に、任意の日にテキストプロトコルで言及されている方法を用いて、分析対象となる各化合物のガスクロマトグラフ用標準曲線を作成します。1 HRTサイクル後にリアクターを停止させ、以前と同様に COD 濃度 10 g/L の新鮮な培地および新しい栄養源を各バッチに供給します。バイオリアクターへの給餌後、ストック溶液からTCEをバイオリアクター内の液体に直接添加します。バイオリアクターの液相における最終TCE濃度は300 micromolarにする必要があります。1回のHRTサイクルの終了時に、HRTを12時間に設定します。液体のサンプルを採取し、COD、硫酸塩、および硫化物の分析を行います。また、ヘッドスペースのサンプルを採取し、ガスクロマトグラフで分析を行います。バイオリアクターにおける硫酸還元剤の典型的な挙動をここに示します。運転開始後の数週間は、硫酸還元速度が緩やかであることに注意してください。異なる期間に分けられているのは、硫酸還元の速度が時間の経過とともに上昇し、最終的に24時間未満で4,000 mg/Lの硫酸塩が消費されるに至ったことを示しています。その後、リアクターは連続運転体制で稼働しました。硫酸塩還元におけるリアクターの代表的な結果から、汚泥の生成過程が示されています。ここでは、硫化物濃度、COD消費量、およびpHの経時的な変化を示します。これらの結果は、バイオリアクターを数週間連続運転させた後に行われた実験で得られたものです。汚泥のTCE還元能を試験した実験において、得られた結果をここに示します。得られた硫酸還元活性は、TCE添加前の値よりもわずかに低い結果となりました。ガスクロマトグラフによる分析では、TCEの約80%がエタン硫酸に還元されたことが明らかになりました。また、本プロトコルを用いて調製した汚泥中から、硫酸還元菌、発酵菌、および脱ハロゲン化菌が同定されました。*Desulfovibrio*、*Desulfurella*、*Clostridium dehalogenans*、*Desulfotomaculum* などの細菌属は、硫酸還元および塩素化合物の生物分解に関連していることが知られています。この手法を習得すれば、適切に実施することで、異なる海洋堆積物を用いて同様に行うことができます。この定着に要する時間は、堆積物の起源によって異なる場合があります。この手順を行う際は、COD、硫酸塩、および硫酸塩のマスバランスを定期的に確認することが最も重要であることに留意してください。得られたロッジの活性が高ければ高いほど、TCEの還元に、さらには硫酸還元条件下で分解可能な他のあらゆる毒性化合物の分解に利用できる可能性が高まります。このビデオを視聴することで、USBリアクターを用いて海洋堆積物からGenics Lodgeを構築し、TCE還元におけるその性能を評価する方法について十分に理解できるはずです。また、リアクターへの接種方法、還元反応の時間的経過の追跡方法、および本手順に従ったTCE還元の試験実施方法についても理解を深めることができます。全般的にどれだけの細菌が存在するか、あるいはコンソーシアムがどのようにして光生成的な環境でTCEを分解できるかといった追加の疑問に答えるために、他の遺伝子解析の周期的なシーケンシングなどの他の手法を実施することができます。

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