血管平滑筋細胞と大動脈石灰化と炎症のイメージングの石灰化

本手順の全体的な目的は、大動脈の血管石灰化をex vivoで可視化し、培養したマウス初代大動脈平滑筋細胞を用いてin vivoの血管石灰化をモデル化することです。この手法は、血管石灰化の分子メカニズムを研究するためのin vitroモデルを提供し、in vivoでの血管石灰化およびマクロファージ炎症の評価を可能にすることで、血管疾患生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、疾患の早期段階であっても、アテローム性動脈硬化病変におけるマクロファージ活性とカルシウム沈着の共局在を感度よく定量化できることです。

Caitlinと私に加え、当研究室の技術者であるRobert Tainshが本手順を実演します。まず、アルコール綿で尾部を消毒し、側方の尾静脈を確認します。次に、30ゲージの針を抵抗なく尾部へ挿入しながら、シリンジを前方へ軽く加圧します。

次に、100 µLのカルシウムNIRおよび/または100 µLのカテプシンNIRを一定の速度で注入します。5秒後に針を抜き、注入から3時間から24時間後に大動脈を採取します。解剖顕微鏡下で腹膜を除去し、腹部臓器を露出させます。

続いて、大動脈を切断しないように注意しながら、胃腸器官を取り除きます。その後、前隔膜に側切開を加え、そのまま腹部にかけて切開を続けます。解剖用鋏を用いて、肋骨の側面を切断し、胸骨上部に付着している軟部組織を除去して、胸郭を切り離します。

次に肋骨を切り除き、肺を露出させます。慎重に肺を取り出してください。続いて、大動脈を損傷させないように注意しながら、気管と食道を慎重に取り除きます。

続いて、腸骨分岐部から大動脈弓までの大動脈周囲の軟組織を除去します。大動脈周囲脂肪の除去には注意してください。その後、胸部大動脈および大動脈弓の主要分枝周囲に残っている脂肪および軟組織を除去します。

次に、胸腺を除去します。続いて、近位大動脈から慎重に切り離し、胸腔から心臓を取り出します。その後、腸骨分岐部で遠位大動脈を横断切断します。

インスリン注射針を用いて、大動脈弓から大動脈へ生理食塩水を注入し、残存する血液細胞を洗い流します。大動脈を大動脈弓血管とともに切り離し、体内から完全に摘出します。イメージングの準備が整うまで、大動脈を氷上の生理食塩水溶液中に保持します。

このステップでは、解剖が完了するまで、大動脈を冷たいHBSSに浸しておきます。無菌的な組織培養フード内で、大動脈を35 X 10 millimeterの組織培養ディッシュ内の大動脈消化液に移します。その後、37 degree Celsiusで、緩やかな間欠的ロッキングを行いながら30分間インキュベートします。

消化後、大動脈は伸展またはほつれたような外観を呈します。解剖顕微鏡下で、中膜を損なわないように大動脈の外膜を除去します。そのためには、大動脈の一端から外層を剥がし、靴下を脱がせるように下層の中膜から取り除きます。

外膜を除去した後、残った大動脈を新しい培養皿に入れ、細胞培養培地を用いて37°Cで2〜4時間インキュベートします。その後、大動脈を幅1〜2mmのリング状に切断します。これらのリングを大動脈消化液を入れた新しい組織培養皿に移し、37°Cで緩やかに間欠的なロッキングを行いながら120分間インキュベートします。

インキュベーション中に、ピペットで溶液を数回上下に吸い込み、細胞を再懸濁させます。その後、5 mLの温めた細胞培養培地を消化液に加え、15 mLコニカルチューブに移します。チューブを200 Gで5分間遠心分離します。次に、培地を吸引し、目的の量の細胞培養培地で細胞を再懸濁させます。

血管平滑筋細胞に石灰化を誘導するため、細胞を6ウェル培養プレートに移植し、接着させます。次に、石灰化培地を再添加します。細胞を37°Cで少なくとも7日間インキュベートしてください。

その後、細胞培養プレートから培地を吸引します。イオン水で細胞を1回洗浄します。10%ホルマリン1 mLに室温で20分間浸し、細胞を固定します。

その後、ホルマリンを除去し、固定した細胞を蒸留水で5分間洗浄します。次に、60〜100ワットの電球の下で、1mLの5%硝酸銀溶液を用いて細胞を1〜2時間インキュベートします。その後、硝酸銀溶液を吸引し、蒸留水で5分間洗浄します。

5分後、細胞を5%チオ硫酸ナトリウム蒸留水溶液1mLに入れ、5分間置いて未反応の銀を除去します。その後、蒸留水で5分間細胞を洗浄します。これにより、von Kossa染色された細胞を標準的な倒立光顕微鏡で観察できる状態になります。

この図では、野生型、MGPノックアウトマウス、およびLDLRノックアウトマウスの尾静脈にカルシウムNIRおよびカテプシンNIRを注入し、24時間後に大動脈を採取してNIR蛍光イメージングで評価しました。野生型マウスでは、大動脈の石灰化やマクロファージの存在はほとんど認められません。LDLRノックアウトマウスの大動脈では、マクロファージの集積と共局在する広範な石灰化が認められます。

対照的に、MGPノックアウトマウスでは、マクロファージの浸潤がない状態で大動脈石灰化が起こります。本実験では、MGPノックアウトマウスから培養大動脈VSMCを単離し、GFPまたはMGPを発現するアデノウイルスを感染させました。野生型マウスから単離した大動脈VSMCには、コントロールのスクランブルsiRNAまたはMGPを標的とするsiRNAをトランスフェクションしました。

細胞を石灰化培地Aで7日間培養し、その後、固定してvon Kossa染色を行った。カルシウム染色の定量は、バックグラウンド除去後、ImageJソフトウェアを用いて算出した。これらの手法の開発により、科学者はアテローム性動脈硬化および血管石灰化をex vivoでイメージングすることが可能となった。

また、in vitroで血管石灰化をモデル化することも可能です。これにより、血管疾患に対する新規薬剤治療の効果を試験できる可能性が広がります。このビデオを視聴することで、マウスの一次大動脈血管平滑筋細胞における大動脈の単離方法、および近赤外蛍光イメージングプローブを用いたアテローム性動脈硬化プラークとin vitroでの石灰化した血管平滑筋の可視化方法について、十分に理解できるはずです。