イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

このプロトコルの全体的な目標は、3次元の紙ベースのデバイスを製造するプロセスを実証することであり、これをポイントオブケアイムノアッセイを開発するためのプラットフォームとして使用します。この方法は、紙ベースのマイクロ流体プラットフォームに信頼性の高い製造プロセスを提供し、デバイスの設計ではなくアッセイの開発に時間と労力を向けることができます。私たちの技術の主な利点は、多くのデバイスを並行して、学術研究プロジェクトに適した量で準備できることです。

一般に、新しいユーザーは、レイヤーの適切な配置など、デバイスを製造する際に考慮すべき多くの変数があるため、この方法に苦労します。ミスをすると、デバイスが誤動作する可能性があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、原稿で提供される詳細だけでは組み立てを想像するのが難しい場合があるため、非常に重要です。

まず、ストックシートを標準的な用紙サイズにカットして定性的な濾紙を何層にも重ねて準備し、ワックスプリンターでパターニングを容易にします。カットした用紙をプリンタートレイにセットします。次に、以前にデザインしたレイヤーを印刷します。

次に、卓上ペーパーカッターを使用してナイロンメンブレンのストック列をシートにカットし、ナイロンメンブレンの取り扱いに細心の注意を払い、その完全性を維持し、破れから保護します。未使用の材料は、ナイロンメンブレンは湿気に弱いため、デシケーターキャビネットに保管してください。ワックスプリンターを使用して、キャプチャレイヤーパターンをコピー用紙に印刷し、それをライトボックスにテープで貼り付けて、ナイロンメンブレンの位置決めのガイドとして機能します。

これに続いて、前に印刷したコピー用紙の上にきれいなコピー用紙を置きます。ライトボックスには、清潔な用紙をテープで固定しますが、2枚の用紙をテープで固定しないでください。次に、コピー用紙のきれいなシートにナイロンメンブレンのカットシートを置き、メンブレンがコピー用紙の最下層の印刷領域を覆っていることを確認します。

ナイロンメンブレンの4面すべてをコピー用紙のきれいなシートにテープで貼り付けます。コピー用紙で支えられたナイロンメンブレンを手差しプリンタートレイにセットします。次に、一度に1枚のナイロンメンブレンを印刷します。

印刷した層をアクリルフレームにテープで貼り付けて、重力対流式オーブンに入れたときに層の上下を均一に加熱します。次に、ワックスが紙の厚さに溶けるまで、層を摂氏150度のオーブンに30秒間置きます。オーブンから紙を取り除いた後、ワックスが紙の厚みに浸透していることを裏返して、デザインに欠陥がないか確認します。

アクリルフレームから紙とナイロン膜をはがします。次に、ペーパーカッターを使用してコピー用紙のサポートシートからナイロン膜をはがします。ロボットナイフプロッターを使用して、事前に準備したデザインファイルを使用して、粘着フィルムの両面シートをパターン化します。

これに続いて、接着剤で裏打ちする必要がある紙のパターン層を、印刷面を下にしてライトボックスにテープで貼り付けます。接着剤のパターンシートから保護ライナーの片面をはがします。接着剤の型紙と紙の層を一緒に押します。

次に、部分的に組み立てられたデバイスを保護スリップに入れます。次に、得られた2層アセンブリを自動ラミネーターに通して、接着剤と紙を完全に押し合わせ、隣接する層から空気のポケットを取り除きます。アクリルフレームにコンジュゲート層をテープで貼り付け、処理する親水性ゾーンがフレームと接触しないようにします。

2.5マイクロリットルのBSAと1つのX PBSをコンジュゲート層の親水性ゾーンに加えます。サンプルを室温で2分間乾燥させた後、摂氏65度で5分間乾燥させます。これに続いて、抗β hCG抗体に結合した5マイクロリットルの5つのODコロイド金ナノ粒子を加え、乾燥プロセスを繰り返します。

アクリルフレームに横方向のチャネル層をテープで固定し、処理する親水性ゾーンがフレームと接触しないようにします。10マイクロリットルのブロッキング剤を添加して側方チャネルを処理し、次にコンジュゲート層に使用したのと同じ乾燥プロセスを繰り返します。次に、アクリルフレームにキャプチャー層をテープで貼り付け、処理する親水性ゾーンがフレームに接触しないようにします。

捕捉層を5マイクロリットルの抗αhCG抗体で処理します。サンプルを室温で2分間乾燥させた後、摂氏65度で8分間乾燥させます。2マイクロリットルのブロッキング剤を加え、キャプチャー層と同じ乾燥プロセスを繰り返します。

印刷面を上に向けて、ウォッシュレイヤーをライトボックスにテープで貼り付けます。位置合わせ穴を使用する場合は、ハンドヘルド穴あけツールを使用して後続のレイヤーから穴を取り外してください。キャプチャー層の裏側にある保護フィルムをはがして、接着剤を露出させます。

位置合わせ穴をガイドとして使用してキャプチャ層を洗浄層の上に位置合わせし、次に2つの層を一緒に押して親水性ゾーンに触れないようにして、デバイスの汚染や損傷を最小限に抑えます。その後、インキュベーション層の裏側にある保護フィルムをはがして、接着剤を露出させます。インキュベーション層をキャプチャー層の上に揃え、それらを一緒に押し付けます。

すべてのアクティブなレイヤーが組み立てられるまで、この方法でレイヤーを追加し続けます。次に、部分的に組み立てられたデバイスを保護スリップに置き、ラミネーターを使用して層をしっかりと固定します。洗浄層の背面にある保護フィルムをはがし、ブロット層をデバイスの底面に貼り付けます。

ラミネート加工して3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの組み立てを完了した後、完全に組み立てられたデバイスのシートからハサミを使用して必要な数のデバイスを切り取ります。20マイクロリットルのhCGバッファーのポジティブコントロールサンプルをデバイス上部の親水性ゾーンに加えます。サンプルがデバイス内に完全に吸い込まれたら、15マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。

洗浄バッファーの最初のアリコートがデバイス内に完全に吸い込まれた後、2番目の15マイクロリットルの洗浄バッファーのアリコートを追加します。.アッセイの結果を明らかにするには、ピンセットを使用してデバイスの3つの最上層を剥がし、キャプチャー層を露出させます。ワックスプリンティング法は、紙ベースのマイクロ流体デバイス内に疎水性バリアを形成するために使用でき、再現性のある寸法の流体経路を生成することができます。これは、再現性のある性能と持続時間を持つアッセイにとって重要です。

hCG紙ベースのイムノアッセイの性能は、35の陽性アッセイと35の陰性アッセイを並行して実行することによって実証されました。各データセットの変動係数は、ネガティブサンプルを用いて実施したアッセイで1%、ポジティブサンプルを用いて実施したアッセイで3%と決定しました。インキュベーションチャネルとキャプチャーゾーンを構成する層間のミスアライメントは、正のシグナルに不規則なパターンが発生する可能性があり、定性的シグナルの誤解につながる可能性があります。

ワックスが十分な量で印刷されていない場合、または紙の厚さを通して完全に溶けることを許さない場合、結果として生じる疎水性バリアの完全性が損なわれ、デバイス内での漏れにつながる可能性があります。アッセイの完了に予想以上に時間がかかる場合は、デバイスの製造に不具合がある可能性があります。紙ベースのマイクロ流体デバイスは、研究者に低コストのポイントオブケア分析テストを開発するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。

多くのアプリケーションが存在しますが、ここで示すアプローチは、ヘルスケアで重要なイムノアッセイを実行するための一般的なデバイスアーキテクチャをもたらします。この手順を試行する際は、製造プロセス中および高価な生化学試薬で層を処理する前に、欠陥を確認することを忘れないでください。この方法を習得すれば、印刷層から処理層の組み立てまで、2時間で機能的免疫測定法のシートを調製することができます。

このビデオを見れば、3次元の紙ベースのデバイスの作製方法を十分に理解し、このプラットフォームを他の関心のあるアッセイタイプに合わせて調整するのに十分な快適さが得られるはずです。