イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

本プロトコルの目的は、ポイントオブケア免疫測定法の開発プラットフォームとして使用する、三次元紙ベースデバイスの作製プロセスを実証することです。この手法により、信頼性の高い製造プロセスを備えた紙ベースのマイクロ流体プラットフォームが提供され、デバイスの設計ではなくアッセイの開発に時間と労力を割くことが可能になります。本手法の主な利点は、多くのデバイスを並行して作製でき、学術研究プロジェクトに求められる数量を確保できる点にあります。

一般的に、層の適切なアライメントなど、デバイス作製時には考慮すべき変数が多くあるため、新しいユーザーはこの手法に苦労することがあります。ミスをすると、デバイスが正常に動作しなくなる可能性があります。論文に記載された詳細だけでは組み立てをイメージするのが困難な場合があるため、この手法を視覚的に実演することは極めて重要です。

まず、ワックスプリンターによるパターニングを容易にするため、ストックシートを標準的な用紙サイズにカットして、定性ろ紙のレイヤーを準備します。カットした用紙をプリンターのトレイにセットします。次に、あらかじめ設計したレイヤーを印刷します。

次に、卓上ペーパーカッターを使用して、ナイロンメンブレンのストックロールをシート状に切断します。この際、ナイロンメンブレンの完全性を維持し、破れを防ぐために、取り扱いには細心の注意を払ってください。ナイロンメンブレンは吸湿性があるため、未使用の材料はデシケーターキャビネットに保管してください。ワックスプリンターを用いて、コピー用紙にキャプチャー層のパターンを印刷し、それをライトボックスにテープで固定して、ナイロンメンブレンを配置する際のガイドとして使用します。

次に、以前に印刷したコピー用紙の上に、新しいきれいなコピー用紙を重ねます。新しい用紙をライトボックスにテープで固定しますが、2枚の用紙同士をテープで留めないでください。ここで、カットしたナイロンメンブレンをきれいなコピー用紙の上に置き、メンブレンが下層のコピー用紙の印刷領域を覆っていることを確認します。

ナイロンメンブレンの四辺すべてを、きれいなコピー用紙にテープで固定します。コピー用紙に固定したナイロンメンブレンを、プリンターの手差しトレイにセットします。その後、ナイロンメンブレンを1枚ずつ印刷してください。

重力対流オーブンに入れた際に層の上下を均一に加熱できるよう、印刷した層をアクリルフレームにテープで固定します。次に、層を150 °Cのオーブンに30秒間入れ、ワックスが紙の厚みまで溶け込むまで加熱します。オーブンから紙を取り出した後、裏返してデザインに不備がないかを確認し、ワックスが紙の厚みまで浸透していることを確認してください。

アクリルフレームから紙とナイロンメンブレンを取り出します。次に、カッターを使用して、コピー用紙の支持シートからナイロンメンブレンを切り離します。あらかじめ作成したデザインファイルを用い、ロボットナイフプロッターで両面粘着フィルムをパターンカットします。

次に、粘着剤での補強が必要な紙の型紙レイヤーを、印刷面を下にしてライトボックスの上にテープで固定します。粘着シートの保護ライナーを片側だけ剥がします。粘着シートと紙のレイヤーを合わせて押し付けます。

次に、部分的に組み立てたデバイスを保護スリーブに入れます。続いて、得られた2層構造のアセンブリを自動ラミネーターに通し、接着剤と紙を完全に圧着させ、接合層から気泡を取り除きます。コンジュゲート層をアクリルフレームにテープで固定し、処理対象となる親水性領域がフレームに接触せず、吊り下げられた状態になるようにします。

BSAおよび1X PBSを2.5 µLずつ、コンジュゲート層の親水性領域に添加します。室温で2分間静置してサンプルを乾燥させた後、65 °Cで5分間乾燥させます。続いて、抗β-hCG抗体を接合させた5 ODのコロイド金ナノ粒子を5 µL添加し、同様に乾燥工程を繰り返します。

親水性ゾーン（処理対象）が吊り下げられ、フレームに接触しないように、ラテラルチャンネル層をアクリルフレームにテープで固定します。10 µLのブロッキング剤を加えてラテラルチャンネルを処理し、その後、コンジュゲート層と同様の乾燥プロセスを繰り返します。次に、親水性ゾーン（処理対象）が吊り下げられ、フレームに接触しないように、キャプチャー層をアクリルフレームにテープで固定します。

キャプチャー層に5 µLの抗α-hCG抗体を処理します。室温で2分間サンプルを乾燥させた後、65 °Cで8分間乾燥させます。2 µLのブロッキング剤を添加し、キャプチャー層で行ったものと同様の乾燥工程を繰り返します。

洗浄層を、印刷面を上にしてライトボックスにテープで固定します。アライメントホール（位置合わせ穴）を使用している場合は、ハンドパンチを使用して以降の層からそれらを取り除きます。キャプチャ層の裏面にある保護フィルムを剥がし、粘着面を露出させます。

アライメント穴をガイドにして、キャプチャ層を洗浄層の上に合わせ、2つの層を押し合わせます。この際、デバイスへの汚染や損傷を最小限に抑えるため、親水性領域に触れないようにしてください。次に、インキュベーション層の背面の保護フィルムを剥がし、粘着面を露出させます。インキュベーション層をキャプチャ層の上に合わせ、それらを押し合わせます。

すべての活性層が組み上がるまで、この方法で層を追加し続けます。次に、部分的に組み立てられたデバイスを保護スリーブに入れ、ラミネーターを使用して各層をしっかりと接着させます。洗浄層の裏面にある保護フィルムを取り除き、ブロット層をデバイスの底面に貼り付けます。

ラミネート処理を行い、3次元紙ベースマイクロ流体デバイスの組み立てを完了させた後、ハサミを使用して、完全に組み立てられたデバイスのシートから必要な数のデバイスを切り出します。デバイス上部の親水性領域に、hCGバッファーの陽性コントロールサンプルを20 µL加えます。サンプルがデバイス内に完全に吸収されたら、15 µLの洗浄バッファーを加えます。

洗浄バッファーの1回目分がデバイスに完全に吸収された後、さらに15 microliterの洗浄バッファーを2回目として加えます。アッセイの結果を確認するために、ピンセットを用いてデバイスの上層3層を剥がし、キャプチャ層を露出させます。ワックス印刷法は、ペーパーベースのマイクロ流体デバイス内に疎水性バリアを形成するために使用でき、再現性のある寸法の流路を作成することが可能です。これは、性能と所要時間の再現性が求められるアッセイにおいて極めて重要です。

hCG紙ベース免疫測定法の性能を実証するため、35回の手法を陽性と陰性のサンプルを用いてそれぞれ並行して実施しました。各データセットの変動係数は、陰性サンプルを用いた測定で1％、陽性サンプルを用いた測定で3％と決定されました。インキュベーションチャネルとキャプチャゾーンを構成する層の間で位置ずれが生じると、陽性信号に不規則なパターンが現れ、定性的な信号の誤解釈を招く可能性があります。

ワックスが十分な量でプリントされていないか、紙の厚み全体に完全に溶け込んでいない場合、得られる疎水性バリアの完全性が損なわれ、デバイス内で漏れが生じる可能性があります。アッセイの完了に予想以上の時間がかかる場合は、デバイスの作製に不具合があったことを示している可能性があります。紙ベースのマイクロ流体デバイスは、低コストなポイント・オブ・ケア分析テストを開発するための汎用性の高いプラットフォームを研究者に提供します。

多くの応用例が存在しますが、ここで実演するアプローチにより、ヘルスケアにおいて極めて重要な免疫測定法を実行するための汎用的なデバイスアーキテクチャが構築されます。この手順を行う際は、作製プロセス中および高価な生化学試薬で層を処理する前に、不備がないか確認することが重要です。層のプリントから処理済み層の組み立てまでの一連の手法を習得すれば、機能的な免疫測定用シートを2時間で準備することが可能です。

このビデオを視聴することで、三次元紙ベースデバイスの作製方法を十分に理解し、このプラットフォームを他の目的のアッセイ形式に適切に適合させることができるようになります。