Name: 連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ連続フローMicrospotterを用いた細胞サブマージ印刷法。血清被覆表面への3T3線維芽細胞の精密配置と蛍光顕微鏡による生存率・形態評価を通じて、薬物スクリーニングと細胞毒性評価の効率化に貢献する革新的な技術です。

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著者は、技術支援のためのクリス·モローを承認したいと思います。資金は、NIH SBIR（R43）助成1R43GM101859-01（MPI）GRANT10940803によって提供された。

1。細胞培養の準備<ol><li>使用するまで液体窒素中でNIH/3T3細胞株を保管してください。 </li><li> 10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いてNIH/3T3細胞について完全培地を調製し、10mMのHEPES緩衝液、50単位/ mlペニシリン、および50μg/ mlのストレプトマイシン。 </li><li> 37℃にて振とう水浴中で2〜3分間、細胞を解凍</li><li> 3分間1500×gで完全なメディアや遠心分離機の5ミリリットル中の細胞を再懸濁。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく細胞上清を取り除きます。 </li><li>メディア5mlに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いて細胞を数える。 <ol><li> 0.5ミリリットルのマイクロチューブに細胞懸濁液と場所を10μlを削除します。 </li><li>細胞懸濁液にトリパンブルー10μlのを追加し、ピペットのチップでかき混ぜる。 </li><li>血球計数器室への染色された細胞のピペットを10μl。 </li><li> 10倍で血球計数器で細胞を数える倍率。 <ol><li> 9大正方形の4のために生きている細胞（小さな白いボールを）カウントします。トリパンブルー染色から濃い青色に表示されない、生きた細胞のみをカウントします。 </li><li>細胞は元の細胞懸濁液中の×10 4細胞/ mlの数を生じ、大きい正方形当たりの細胞の平均数を計算する。 </li><li> 1×10各T25フラスコ中の5mlを合計5細胞/ mlの密度で種子細胞。 </li></ol></li><li> 70％〜80％の集密度に培養細胞の実験を開始する前に。必要に応じて2〜3日ごとにメディアを更新するか。 </li></ol></li></ol> 2。印刷面の準備<ol><li>マーク·組織培養処理ポリスチレン（TCTPS）12ウェルプレートの底面にあるマーカーを持つ矩形のプリントヘッド（X 19ミリメートル7ミリメートル）の大きさ。 </li><li>ピペット50の矩形領域にウシ胎児血清のμLとチップとの全域に広げる。 </li><li>ペトリ皿を残す無菌バイオセーフティーフードのO / Nにおいて血清スポットが完全に乾燥することができます。これらのプレートは、使用前にこれ以上の2日以上を準備する必要があります。 </li></ol> 3。サブマージ印刷<ol><li>蒸留水でプリントヘッドをすすぐ。 <ol><li>蒸留水で60ミリメートルペトリ皿を記入し、表面にプリントヘッドをドッキング。 </li><li>空気ポンプを用いて150μlの/分で2分間線のそれぞれを介して蒸留水を流す。 </li><li>ペトリ皿から水を捨て、きれいな水でそれを埋める。 </li><li>水中で上下に3回プリントヘッドを移動します。 </li></ol></li><li>事前準備12ウェルプレート中の血清でコーティングされたスポット上でプリントヘッドの中心をドッキング。 </li><li>プライム予め温め完全なメディア、チャネルあたり300μlのプリントヘッド。 </li><li>印刷面に50,000細胞/ mlの濃度で細胞を懸濁し、60μL/分、チャンネルあたり100μL。 </li><li>プリントヘッドを置き、反対ドッキング左表面、および2時間、5％CO 2、37℃に設定し、細胞培養インキュベーター中でマニホールド。 </li><li> 2時間インキュベートした後、プリントヘッドを取り外して、培養皿にふたをする。プリントヘッドが除去される時間は、0時間の時点と考えられる。 </li></ol> 4。標準的な細胞培養<ol><li>ステップ2で調製した血清を点着TCTPS 12ウェルプレートの1に予め温めメディアの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 12ウェルTCTPSプレートの単一ウェルにステップ2とピペットから残りの細胞懸濁液の1ミリリットルを取る。これは皿に50,000細胞を含む培養が生成されます。 </li><li> 2時間37℃のインキュベーター内で細胞培養プレートを置きます。 </li><li> 2時間インキュベートした後のタイミングを始める。印刷され、播種サンプル間の一貫性のために、これを0時間の時点と考えられている。 </li></ol> 5。文化の可視化<ol><li> 0,2、24、及び二つの方法の各々からの48時間のテイク細胞日後標準の倒立顕微鏡を用いて上記画像傍接した。 <ol><li>ヨウ化プロピジウムのみ死細胞の核内に組み込まれる赤色蛍光染色を用いて細胞を染色する。 <ol><li>穏やかに任意の破片を除去するために、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS + +）1mlで細胞を3回すすぐ。 </li><li>各培養容器に予め温めPBS + +の1ミリリットルを追加します。 </li><li>各培養容器にヨウ化プロピジウム原液（1 mg / ml）をの1を添加する。 </li><li> 10分間37℃で、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞をインキュベートする。 </li></ol></li><li>イメージ細胞を10倍と40倍の倍率で倒立顕微鏡を使用。 </li></ol></li><li>適切なバイオハザード容器にセルを廃棄。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、この原稿に使用される試薬および/または楽器を生産ワサッチマイクロ流体工学の従業員と株主である。

ここで説明した3Dマイクロ流体印刷技術は、よく充填された液体への細胞のmicrofluidically印刷アレイの一意ができる水没面、すなわち 。水没面に印刷することによって、細胞マイクロアレイは、細胞の生理学的に関連する細胞表現型ならびに単一ウェル、図4の底部に細胞を多重化する能力を維持するように製造することができる。microfluidically中の細胞の結果を印刷するこの研究の結果比較可能な細胞形態および生存率、細胞の付着;しかしながら、印刷された細胞は、より密に短い全体的な研究時間が得られる定義された場所に取り付けることができる。短い調査時間は、ハイスループット薬剤スクリーニング用の14大幅なコスト削減をもたらす可能性がある。 マイクロフルイディクスは、以前に細胞のマイクロアレイおよびハイスループット薬剤スクリーニングのために使用されている。研究の数十のアッセイを基にどのように流れるかを詳述しています静的フローの問題を解消する。 19 -残念ながら、これらの研究は、1...

製薬業界における最近の進歩は、薬物スクリーニングおよび分析cytotoxicological 1,2,3ための創薬プロセスにおける細胞マイクロアレイを使用して関心の高まりをもたらした。細胞マイクロアレイを用いたin vitroハイスループットアッセイおよびスクリーニング方法の開発は、迅速かつ費用対効果の高い薬剤候補の開発、ならびに、予めセル1,4の基本的な理解を容易にするであろう。細胞を用いたスクリーニングに伝統的なアプローチは、従来のウェルプレートのプラットフォームを使用しています。しかしながら、このアプローチは、高いコスト、限定されたスループット、および細胞機能に関する定量1,5については限られた能力に制限される。原因これらの制限があるため、携帯マイクロアレイ技術の研究は、分子生物学的特性評価、組織工学、および薬剤スクリーニング1,6のために急成長されている。携帯マイクロアレイの利点は、より小さなサンプルを使用、最小限の影響を含む細胞表現型情報をマスキング異質性、そして最も重要なことには、より高いスループットアプリケーション1,7,8するためのアッセイを自動化する能力。 製薬業界は、現在、マイクロタイターウェルプレート9における薬物スクリーニングのための2D細胞単層培養物とのハイスループット細胞ベースのスクリーニングアッセイを利用する。マイクロタイタープレートのウェル中の多重化セルはユニークな実験のオプションでより高いスループットの可能性を提供しています。さらに、細胞のマイクロアレイのための現在の技術は飛躍的に生体内で 10,11 内から細胞の表現型を変える可能性がある細胞を乾燥させる。これらの問題を克服するために、MFCAは、操作された、 図1に示されている。MFCA 3次元流体工学の設計は、浴中に降下し、シールを形成する表面に対して圧縮されるように、図1のプリントヘッドチップを可能にする。プリントヘッドの柔らかいシリコーンチップは、同じように動作しガスケットと可逆的シールを形成する。 MFCA技術は、細胞培養物及び組織切片システムの両方に必要とされる浸漬表面とのインタフェースを一意に適しており、他のほとんどのアプローチでは困難又は不可能である。ピンやインクジェット印刷は機能しません、と2Dマイクロ流体デバイスは、蒸着やディスクリートスポットの大きな配列とのインタフェースに適していない。さらに、実験の小型化とローカル化することで - 携帯マイクロアレイを - MFCAは、ハイスループットの細胞ベースのスクリーニングアッセイに関連する主要な問題を克服する。 CFMは、表面12,13上の微小スポットの場所を介してサイクル少量流体サンプルに3Dチャンネルのネットワークを使用しています。流れに印刷することによって、生体分子、細胞、および他の試薬は、現在のセルの印刷技術を妨げる空気に曝すことなく敏感な生体分子および細胞の印刷を可能にする、印刷プロセス全体を通して液体環境に維持される。アレイ表面上の捕獲メカニズムが設けられ、このようなハイブリドーマまたは上清として粗物質から直接印刷することも可能である。本稿の目的は、表面上に詳細に2つの細胞型の浸漬印刷を説明することである。

<table><tbody><tr><td>連続フローマイクロスポッター</td><td>ワサッチマイクロフルイディクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>細胞用ベース培地</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>細胞培地添加剤(コントロールpH)</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>細胞培地添加物</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>細胞培地添加物</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>細胞計数用染色細胞</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>細胞計数用細胞室</td></tr><tr><td>ニコン エクリプス TS100</td><td>ニコン</td><td></td><td>細胞のチェックに使用</td></tr><tr><td>ニコン エクリプス TE2000-U</td><td>ニコン</td><td></td><td>画像</td></tr><tr><td>収集に使用リン酸緩衝生理食塩水(カルシウムおよびマグネシウムを含む)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>継代前およびPI TrypLE Expressによる染色前の細胞のすすぎ</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>表面から細胞を除去するために使用</td></tr></tbody></table>

連続フローmicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

マイクロアレイアプリケーションのための細胞の印刷は、印刷後に生理学的に関連性のある細胞表現型を維持する問題、目的の細胞の不十分な組織化と分布、およびアレイ内の標的領域に薬物および/または栄養素を送達できない問題を含む重大な課題を抱えています。 当社の3Dマイクロ流体プリンティング技術は、自動化された多重化された方法で、細胞の配列を水没した表面にシールして印刷する独自の能力を備えています。 マイクロ流体セルアレイ(MFCA)3D流体工学の設計により、プリントヘッドの先端を液体で満たされたウェルまたはディッシュに下げ、表面に対して圧縮してシールを形成することができます。 プリントヘッドの柔らかいシリコンチップはガスケットのように機能し、圧力をかけたり後退させたりすることでリバーシブルシールを形成することができます。 ピンプリンターやインクジェットプリンターなどの他のセル印刷テクノロジーは、水中アプリケーションで印刷できません。 水中表面印刷は、細胞の表現型を維持し、材料の表面特性を乱すことなく表面上のこれらの細胞を監視するために不可欠です。 水中の表面に印刷することにより、がん、糖尿病、炎症、感染症、心血管疾患など、さまざまな領域での薬物スクリーニングと細胞毒性評価を可能にする細胞マイクロアレイが作製されます。

線維芽細胞株NIH/3T3細胞を沈め表面に印刷又は播種した。細胞を、1ml当たり5×10 4細胞の密度まで増殖させた。細胞は、伝統的な細胞培養技術を用いて播種した。細胞は、大判、チャネルは、タンパク質および他の生体分子のために使用CFM以上（〜500μm）を大きい十二フローセルプリントヘッドを用いて印刷した。細胞は、血清コーティングされた表面に印刷または播種した。印刷処理は、図1に示されている。 印刷および播種後、細胞を関連する時間点（0、2、24、及び48時間）での密度および形態学を評価するために可視化した。これらの時点での細胞の細胞密度および形態を顕微鏡10Xおよび40Xの倍率を用いて評価した。画像は、細胞が各時点で各倍率図2においてほぼ同一の表現型を有することを示している。これらの図の効果に基づいて印刷は最小限であると決定された。 細胞生存率は、PI染色を用いて評価した。 図3に示すように、印刷され...

この3Dマイクロ流体印刷技術は、水没した表面に細胞の配列を印刷します。 セルの配列が3Dフローセルでマイクロ流体的に水中表面に送達される方法を説明します。 水没した表面に印刷することにより、細胞マイクロアレイが作製され、多数の領域で薬物スクリーニングと細胞毒性評価が可能になりました。

連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

この手順の全体的な目的は、血清でコーティングした表面にT3線維芽細胞をプリントすることです。まず、組織培養表面に血清を予め吸着させます。次に、連続フローマイクロスポッターを用いて線維芽細胞懸濁液を表面にプリントし、続いて細胞を37°Cで2時間インキュベートします。次に、プリントされた細胞および標準的な細胞培養で播種された細胞をプロピジウムイージドで染色し、倒立顕微鏡下で観察して比較します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、適切なタイムポイントにおける細胞の生存率、密度、および形態を評価します。ピンプリンティングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、プリントヘッドが表面を密閉するため、細胞培地に浸した状態で細胞をプリントできることです。細胞の浸漬プリンティングは、新薬候補の安全性および有効性のスクリーニングに有用ですが、一般的に浸漬プリンティングは他のアプリケーションにも有用です。例えば、組織切片を用いた新薬候補の解析や、器官系のモデルとして利用することが可能です。一例として、肝臓灌流モデルなどが挙げられます。一般的に、この方法に不慣れな方は、プリンターのプライミングおよび細胞プリント中にラインへ空気が混入すると細胞死を招く可能性があるため、苦労することがあります。まず、NIH 3T3細胞を37 °Cの振盪水槽で2〜3分間解凍します。細胞を5 mLの完全培地で再懸濁し、1500 ×gで3分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さないように細胞上清を除去します。次に、細胞を5 mLの培地で再懸濁し、細胞懸濁液10 µLを0.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。続いて、細胞懸濁液にトリパンブルー10 µLを加え、ピペットのチップで混ぜ合わせます。染色した細胞10 µLをヘモサイトメーターのチャンバーにピペットで注入します。10倍の倍率で細胞を計数する前に、小さな白い球体に似た生細胞を、9つの大きな区画のうち4つ分カウントします。トリパンブルー染色により濃い青色に見えない生細胞のみをカウントしてください。大きな区画1つあたりの平均細胞数を算出し、その細胞数に10,000を乗じることで、元の細胞懸濁液中の1ミリリットルあたりの細胞数を求めます。次に、T 25フラスコ1本あたり合計5 mLの液量で、100,000 cells/mLの密度で細胞を播種します。実験を開始する前に、細胞を70〜80%のコンフルエンシーまで培養します。プリント表面を準備するために、組織培養処理済みポリスチレン12の底面に、プリントヘッドと同じサイズの長方形をマーカーで書き込みます。ウェルプレートの長方形の領域に胎児牛血清を50 µL分注し、領域全体に広げます。チップを外した後、血清のスポットを完全に乾燥させるため、ウェルプレートを滅菌済みのバイオセーフティーキャビネット内に一晩放置します。没入プリントを開始するには、プリントヘッドを蒸留水で洗浄してください。次に、60 millimeterのペトリ皿に蒸留水を満たし、プリントヘッドを表面に固定させます。ニューマチックポンプを用いて、各ラインに150 microliters per minuteの流量で2分間蒸留水を流します。その後、ペトリ皿の水を捨て、きれいな水で満たします。次に、プリントヘッドを水の中で3回上下に動かします。あらかじめ準備した12ウェルプレート内の血清コーティング部位の中央にプリントヘッドをドッキングさせます。次に、Prewarmを用いてプリントヘッドをプライミングします。完全培地を1チャンネルあたり300 µL使用してください。複数回のプリントを行う場合は、プリント間の水洗浄に加えて漂白剤による洗浄を行ってください。その後、懸濁細胞を濃度50,000 cells/mL、流速60 µL/minで表面にプリントします。1チャネルあたり100 µL使用します。セルプリンティング後、プリントヘッドを左側のドッキング位置に戻し、マニホールドとともに細胞培養インキュベーターに入れます。5% carbon dioxide、37 °Cに設定し、2時間培養します。2時間の培養後、プリントヘッドを取り出し、培養皿に蓋をします。プリントヘッドを取り外した時点を0時間として定義します。比較のため、標準的な細胞培養も同時に行います。血清をスポットした12ウェルプレートの1つのウェルに、あらかじめ温めておいた培地を1 mL加え、次に残りの細胞懸濁液1 mLを採取し、12ウェルプレートの別の1つのウェルにピペットで分注します。これにより、ディッシュ内に50,000個の細胞を含む培養液が作成されます。細胞培養プレートを37°Cのインキュベーターに2時間置きます。2時間のインキュベーション後、プリントサンプルと播種サンプルの整合性を保つため、タイマーを開始します。これを0時間の時点とします。0、2、24、および48時間後に、死細胞の核にのみ取り込まれるプロピジウムヨードで染色し、2つの方法それぞれで細胞をイメージング用に調製します。まず、デブリを除去するため、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水1 mLで細胞を3回静かに洗浄します。次に、あらかじめ加温した培地を1 mLずつ各培養容器に加え、続いてプロピジウムヨードストック溶液を1 µL加えます。プロピジウムヨードで染色した細胞を37 °Cで10分間インキュベートした後、倒立顕微鏡を用いて10倍および40倍の倍率で細胞をイメージングします。最後に、細胞を適切なバイオハザード容器に廃棄してください。線維芽細胞株であるNIH 3T3細胞を、浸漬表面にプリントまたは播種しました。プリントおよび播種後、適切な時間経過における細胞密度と形態を評価するために可視化を行いました。画像から、各タイムポイントおよび各倍率において、細胞がほぼ同一の表現型を有していることが示されました。これらの数値に基づき、有効なプリント量は最小限であったと判断されました。プロピジウムヨード染色を用いて細胞生存率を評価したところ、プリントされた細胞の生存率は、各タイムポイントにおいて播種された細胞と有意な差がないことが明らかになりました。細胞を表面に付着させるこれら2つの方法の主な違いは、細胞密度にあります。2時間後の時点において、播種した細胞とプリントした細胞の両方で、プリントされた細胞密度が50%以上減少しました。この減少の原因を特定するためには、さらなる研究が必要です。しかしながら、播種した細胞と比較した全体的なプリント密度比は、依然として有意に高い値を示しています。フローセル内のプリントされた細胞密度は、各タイムポイントにおいて播種細胞の約10倍の密度となりました。これは、播種時と同じ密度で、より狭い範囲に細胞がプリントされたためと考えられます。最終タイムポイントでは細胞密度が同一となっており、これは細胞の運動性とリソース消費の制限によるものと考えられます。本技術の開発以降、創薬分野の研究者が、細胞に対する薬物毒性や有効性の影響を研究する道が開かれ、がん、心疾患、およびその他の需要の高い分野への応用が進んでいます。潜水細胞プリンティングを、接着性やプログラム可能な細胞接着などの他の技術と併用することで、この手法を浮遊細胞まで拡張でき、創薬および開発スクリーニングの範囲を広げることが可能です。このビデオを視聴することで、当社の潜水プリンティング技術を用いて細胞をプリントする方法について、十分な理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

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