連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷
April 22nd, 2014
この3Dマイクロ流体印刷技術は、水没した表面に細胞の配列を印刷します。 セルの配列が3Dフローセルでマイクロ流体的に水中表面に送達される方法を説明します。 水没した表面に印刷することにより、細胞マイクロアレイが作製され、多数の領域で薬物スクリーニングと細胞毒性評価が可能になりました。
この手順の全体的な目標は、血清コーティングされた表面に3つのT、3つの線維芽細胞を印刷することです。これは、まず血清を組織組織培養表面にあらかじめ吸着することによって達成されます。第2ステップは、連続フローマイクロスポッターを使用して線維芽細胞の懸濁液を表面に印刷し、続いて細胞を摂氏37度で2時間インキュベートすることです。
次に、印刷された細胞と標準的な細胞培養で播種された細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、比較のために倒立顕微鏡で可視化します。最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、関連する時点での細胞の生存率、密度、および形態を評価します。ピン印刷などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、プリントヘッドが表面にシールを形成し、細胞培地に浸した状態で細胞を印刷できることです。
細胞のサブマージプリンティングは、新薬候補の安全性と有効性のスクリーニングに役立ちますが、一般的にサブマージプリンティングは他のアプリケーションにも有用です。例えば、新薬候補を組織切片に対して解析したり、臓器系のモデルとして利用したりすることができます。たとえば、肝臓の滲出モデルです。
一般に、この方法に不慣れな人は、プリンターのプライミングや細胞印刷中に空気がラインに入ることができず、細胞死を引き起こす可能性があるため、苦労します。解凍を開始するには、摂氏37度の振とう水浴でNIHの3つのT、3つのセルを2〜3分間解凍します。細胞を5ミリリットルの完全培地に懸濁し、1500Gで3分間遠心分離します。
細胞ペレットを乱さずに細胞上清を除去します。次いで、細胞を5ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞懸濁液の10マイクロリットルを0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。次に、細胞懸濁液に10マイクロリットルのトライアムブルーを加え、ピペットピペットの先端で染色した細胞の10マイクロリットルをヘモサイトメーターチャンバー内で攪拌する。
10倍の倍率で細胞を数える前に、9つの大きな正方形のうち4つについて、小さな白いボールに似た生細胞を数えます。トリッペンブルーの染色から濃い青色に見えない生細胞のみをカウントします。大きな正方形あたりの平均セル数を計算し、その結果、セル数に元の細胞懸濁液中のミリリットルあたり10,000個のセルを掛けたものになります。
次に、各T 25フラスコに合計5ミリリットルを含む1ミリリットルあたり100,000細胞の密度で細胞を播種します。実験を開始する前に、細胞を70〜80%coの流暢さで培養します。印刷面を準備するには、マーカーを使用して、組織培養処理ポリスチレン12の底部にプリントヘッドのサイズの長方形をマークします。
ウェルプレートは、50マイクロリットルのウシ胎児血清を長方形の領域にピペットで移し、それを全領域に広げます。チップを使用して、ウェルプレートを滅菌バイオセーフティフードに一晩置いて、血清スポットを完全に乾燥させます。水中印刷を開始するには、プリントヘッドを蒸留水ですすいでください。
次に、60ミリメートルのシャーレに蒸留水を満たし、空気圧ポンプを使用して、各ラインを通じて各ラインを流れる蒸留水の表面にプリントヘッドをドッキングし、毎分150マイクロリットルで2分間加熱します。次に、ペトリ皿から水を捨て、きれいな水で満たします。次に、プリントヘッドを水中で3回上下に動かします。
プリントヘッドの中央を、事前に準備した12ウェルプレートの血清コーティングスポットにドッキングします。次に、プリントヘッドにPrewarmをプライミングします。チャネルあたり300マイクロリットルの完全なメディア。
複数のプリントを行う場合は、プリントの合間に水すすぎに加えて、漂白剤リンスを追加してください。浮遊細胞を表面にミリリットルあたり50, 000個の細胞の濃度で、毎分60マイクロリットルで印刷します。チャネルあたり100マイクロリットル。
細胞プリンティング後、プリントヘッドを表面とマニホールドにドッキングしたままにして、細胞培養インキュベーターに置きます。二酸化炭素を5%、摂氏37度に2時間設定します。2時間のインキュベーション後、プリントヘッドを取り外し、培養皿に蓋をします。
プリントヘッドが取り外された時間は、ゼロ時間の時点と見なされます。比較のために、標準的な細胞培養も行います。血清スポット12ウェルプレートの1つに1ミリリットルの予熱培地を加え、残りの細胞懸濁液1ミリリットルを取り、12ウェルプレートの1ウェルにピペットで移します。
これにより、皿に50, 000個の細胞を含む培養物が生成されます。細胞培養プレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間置きます。2時間のインキュベーション後、プリントしたサンプルと播種したサンプルが一貫性を保つためのタイミングを開始します。
これは 0 時間の時点と見なされます。0時間後、2時間後、2時間後、2つの方法のそれぞれから細胞を調製し、死細胞の核にのみ取り込まれるヨウ化プロピジウムで染色することにより、イメージングします。まず、カルシウムとマグネシウムを含む1ミリリットルのリン酸パフ生理食塩水で細胞を3回優しくすすぎ、破片を取り除きます。
次に、各培養容器に1ミリリットルの予温培地を加え、次に1マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを加えます。ストック溶液は、ヨウ化プロピジウムで37°Cで染色した細胞を10分間インキュベートした後、倒立顕微鏡で10倍および40倍の倍率で細胞をイメージングします。最後に、細胞を適切なバイオハザード容器に廃棄します。
線維芽細胞株は、NIHの3T細胞を水没した表面にプリントまたは播種した。プリントと播種後、細胞を可視化して、関連する時点での密度と形態を評価しました。画像は、細胞が各時点および各倍率でほぼ同一の表現型を持っていることを示しました。
これらの数値に基づいて、効果的な印刷は最小限であると判断されました。細胞の生存率は、ヨウ化プロピジウム染色剤を使用して評価され、印刷された細胞の生存率は、各時点で着座した細胞と有意に異ならないことが明らかになりました。セルを表面にアタッチする 2 つの方法の主な違いは、セルの密度です。
印刷されたセル密度は、座ったセルと印刷されたセルの両方で、2時間の時点で50%以上減少します。この減少の原因を特定するには、さらなる研究が必要です。ただし、シードと比較した場合の全体的な印刷密度比は大幅に高いままです。
フローセルに印刷された細胞密度は、播種を考慮した細胞が播種と同じ密度で印刷されたが、より小さな領域に印刷された各時点で約10倍の密度であった。最終的な時点では、細胞は同じ密度にありますが、これは細胞の運動性とリソース消費の制限によるものと考えられます。この技術は、その開発以来、創薬分野の研究者が、細胞やがんエイズ、心臓病、その他の需要の高い分野に対する薬物の毒性と有効性の影響を研究する道を開いてきました。
サブマージセルプリンティングをアドヒアランス、プログラム可能な細胞接着などの他の技術と組み合わせて使用することで、この技術の範囲を浮遊細胞に拡大し、創薬や開発スクリーニングを拡大することができます。このビデオを見れば、水中印刷技術を使用して細胞を印刷する方法についてしっかりと理解できるはずです。
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概要
この研究では、水没した表面に細胞配列を印刷できる新しい3Dマイクロ流体プリント技術を提示します。この方法は、制御された微小環境内で細胞を正確に配達することで、薬物スクリーニングと細胞毒性評価を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- マイクロ流体工学
- 細胞生物学
- 薬物スクリーニング
背景
- 3Dプリント技術は生物学的応用で進歩しています。
- 水没プリントにより、より良い細胞生存率と機能性が可能になります。
- 従来の方法では細胞配置の制御が同じレベルで提供されない可能性があります。
- この技術は細胞への薬物効果の評価を向上させることができます。
研究の目的
- 血清コーティングされた表面に線維芽細胞を印刷する方法を開発すること。
- 印刷された細胞と標準的な培養方法の生存率と形態を比較すること。
- 細胞の特性を詳細に分析するために蛍光顕微鏡を使用する。
使用した方法
- 組織培養表面への血清の事前吸着。
- 細胞プリント用の連続フローマイクロスポッター。
- 印刷された細胞の37度セルシウスでのインキュベーション。
- 逆位顕微鏡下での視覚化のためにプロピジウムヨウ化物による染色。
主な結果
- 水没した表面に線維芽細胞の印刷に成功。
- 印刷された細胞と標準的に培養された細胞の生存率と形態の比較。
- 蛍光顕微鏡により、細胞密度と健康状態に関する重要な洞察が明らかに。
- この技術は従来のピンプリント方法に比べて利点を示しました。
結論
- 3Dマイクロ流体プリント方法は細胞配列の作成に効果的です。
- このアプローチは薬物スクリーニングプロセスを改善できます。
- さらなる研究により様々な生物学分野での応用が拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Submerged microfluidic cell printing enables physiologically relevant cell phenotype maintenance and precise spatial organization for drug screening applications. This technology addresses key limitations of conventional printing methods by allowing automated, multiplexed deposition of cells onto submerged surfaces without disturbing material properties. The approach supports predictive cytotoxicity and efficacy assessment across therapeutic areas including oncology, metabolic disease, and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled cell array patterning on submerged surfaces.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining native cell phenotypes during printing and culture.
- Predictive Value: Facilitates functional target validation by preserving cell morphology and viability comparable to standard culture.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream drug screening workflows with consistent cell density and distribution.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility through sealed microfluidic printing that prevents air entrapment and cell death.
- Scalability Value: Enables multiplexed array production for high-throughput compound evaluation in cancer, diabetes, inflammation, and cardiovascular disease models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant systems for monitoring cellular responses to drug candidates without surface disturbance artifacts.
- Continuity Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining cell functionality from printing through 48-hour assessment periods.
- Risk Mitigation: Supports mechanism-based de-risking by allowing direct comparison of printed versus seeded cell responses to compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling precise cell deposition for assay development, supporting lead identification through quantitative viability and morphology assessment, and informing preclinical decisions via density-based phenotypic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled cell array formation that clarifies spatial organization effects on drug response.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible submerged printing that ensures consistent cell-sealing interactions critical for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell viability, density, and morphology via propidium iodide staining and fluorescence microscopy readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining cell phenotypes over 48 hours, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform technology adaptable to multiple cell types and therapeutic areas beyond fibroblast models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of physiologically relevant cell states post-printing.
- Operational Value: Standardization and scalability via automated microfluidic sealing that eliminates variability from manual printing techniques.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable cytotoxicity assessment that reduces late-stage biological risk in drug development.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization enabled by quantitative density and viability metrics that inform resource allocation across projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system operation and sterile cell handling techniques.
- Dependent on pneumatic pump infrastructure and biocompatible printhead materials for consistent sealing.
- Necessitates cross-team standardization of serum pre-adsorption protocols and incubation conditions for reproducibility.
- Involves adaptation considerations when extending to suspension cells or tissue slice models as noted in source material.
- Practical limitation: Air entrapment during priming or printing can cause cell death, requiring meticulous fluid handling.
