連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

この手順の全体的な目標は、血清コーティングされた表面に3つのT、3つの線維芽細胞を印刷することです。これは、まず血清を組織組織培養表面にあらかじめ吸着することによって達成されます。第2ステップは、連続フローマイクロスポッターを使用して線維芽細胞の懸濁液を表面に印刷し、続いて細胞を摂氏37度で2時間インキュベートすることです。

次に、印刷された細胞と標準的な細胞培養で播種された細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、比較のために倒立顕微鏡で可視化します。最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、関連する時点での細胞の生存率、密度、および形態を評価します。ピン印刷などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、プリントヘッドが表面にシールを形成し、細胞培地に浸した状態で細胞を印刷できることです。

細胞のサブマージプリンティングは、新薬候補の安全性と有効性のスクリーニングに役立ちますが、一般的にサブマージプリンティングは他のアプリケーションにも有用です。例えば、新薬候補を組織切片に対して解析したり、臓器系のモデルとして利用したりすることができます。たとえば、肝臓の滲出モデルです。

一般に、この方法に不慣れな人は、プリンターのプライミングや細胞印刷中に空気がラインに入ることができず、細胞死を引き起こす可能性があるため、苦労します。解凍を開始するには、摂氏37度の振とう水浴でNIHの3つのT、3つのセルを2〜3分間解凍します。細胞を5ミリリットルの完全培地に懸濁し、1500Gで3分間遠心分離します。

細胞ペレットを乱さずに細胞上清を除去します。次いで、細胞を5ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞懸濁液の10マイクロリットルを0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。次に、細胞懸濁液に10マイクロリットルのトライアムブルーを加え、ピペットピペットの先端で染色した細胞の10マイクロリットルをヘモサイトメーターチャンバー内で攪拌する。

10倍の倍率で細胞を数える前に、9つの大きな正方形のうち4つについて、小さな白いボールに似た生細胞を数えます。トリッペンブルーの染色から濃い青色に見えない生細胞のみをカウントします。大きな正方形あたりの平均セル数を計算し、その結果、セル数に元の細胞懸濁液中のミリリットルあたり10,000個のセルを掛けたものになります。

次に、各T 25フラスコに合計5ミリリットルを含む1ミリリットルあたり100,000細胞の密度で細胞を播種します。実験を開始する前に、細胞を70〜80%coの流暢さで培養します。印刷面を準備するには、マーカーを使用して、組織培養処理ポリスチレン12の底部にプリントヘッドのサイズの長方形をマークします。

ウェルプレートは、50マイクロリットルのウシ胎児血清を長方形の領域にピペットで移し、それを全領域に広げます。チップを使用して、ウェルプレートを滅菌バイオセーフティフードに一晩置いて、血清スポットを完全に乾燥させます。水中印刷を開始するには、プリントヘッドを蒸留水ですすいでください。

次に、60ミリメートルのシャーレに蒸留水を満たし、空気圧ポンプを使用して、各ラインを通じて各ラインを流れる蒸留水の表面にプリントヘッドをドッキングし、毎分150マイクロリットルで2分間加熱します。次に、ペトリ皿から水を捨て、きれいな水で満たします。次に、プリントヘッドを水中で3回上下に動かします。

プリントヘッドの中央を、事前に準備した12ウェルプレートの血清コーティングスポットにドッキングします。次に、プリントヘッドにPrewarmをプライミングします。チャネルあたり300マイクロリットルの完全なメディア。

複数のプリントを行う場合は、プリントの合間に水すすぎに加えて、漂白剤リンスを追加してください。浮遊細胞を表面にミリリットルあたり50, 000個の細胞の濃度で、毎分60マイクロリットルで印刷します。チャネルあたり100マイクロリットル。

細胞プリンティング後、プリントヘッドを表面とマニホールドにドッキングしたままにして、細胞培養インキュベーターに置きます。二酸化炭素を5%、摂氏37度に2時間設定します。2時間のインキュベーション後、プリントヘッドを取り外し、培養皿に蓋をします。

プリントヘッドが取り外された時間は、ゼロ時間の時点と見なされます。比較のために、標準的な細胞培養も行います。血清スポット12ウェルプレートの1つに1ミリリットルの予熱培地を加え、残りの細胞懸濁液1ミリリットルを取り、12ウェルプレートの1ウェルにピペットで移します。

これにより、皿に50, 000個の細胞を含む培養物が生成されます。細胞培養プレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間置きます。2時間のインキュベーション後、プリントしたサンプルと播種したサンプルが一貫性を保つためのタイミングを開始します。

これは 0 時間の時点と見なされます。0時間後、2時間後、2時間後、2つの方法のそれぞれから細胞を調製し、死細胞の核にのみ取り込まれるヨウ化プロピジウムで染色することにより、イメージングします。まず、カルシウムとマグネシウムを含む1ミリリットルのリン酸パフ生理食塩水で細胞を3回優しくすすぎ、破片を取り除きます。

次に、各培養容器に1ミリリットルの予温培地を加え、次に1マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを加えます。ストック溶液は、ヨウ化プロピジウムで37°Cで染色した細胞を10分間インキュベートした後、倒立顕微鏡で10倍および40倍の倍率で細胞をイメージングします。最後に、細胞を適切なバイオハザード容器に廃棄します。

線維芽細胞株は、NIHの3T細胞を水没した表面にプリントまたは播種した。プリントと播種後、細胞を可視化して、関連する時点での密度と形態を評価しました。画像は、細胞が各時点および各倍率でほぼ同一の表現型を持っていることを示しました。

これらの数値に基づいて、効果的な印刷は最小限であると判断されました。細胞の生存率は、ヨウ化プロピジウム染色剤を使用して評価され、印刷された細胞の生存率は、各時点で着座した細胞と有意に異ならないことが明らかになりました。セルを表面にアタッチする 2 つの方法の主な違いは、セルの密度です。

印刷されたセル密度は、座ったセルと印刷されたセルの両方で、2時間の時点で50%以上減少します。この減少の原因を特定するには、さらなる研究が必要です。ただし、シードと比較した場合の全体的な印刷密度比は大幅に高いままです。

フローセルに印刷された細胞密度は、播種を考慮した細胞が播種と同じ密度で印刷されたが、より小さな領域に印刷された各時点で約10倍の密度であった。最終的な時点では、細胞は同じ密度にありますが、これは細胞の運動性とリソース消費の制限によるものと考えられます。この技術は、その開発以来、創薬分野の研究者が、細胞やがんエイズ、心臓病、その他の需要の高い分野に対する薬物の毒性と有効性の影響を研究する道を開いてきました。

サブマージセルプリンティングをアドヒアランス、プログラム可能な細胞接着などの他の技術と組み合わせて使用することで、この技術の範囲を浮遊細胞に拡大し、創薬や開発スクリーニングを拡大することができます。このビデオを見れば、水中印刷技術を使用して細胞を印刷する方法についてしっかりと理解できるはずです。