連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

この手順の全体的な目的は、血清でコーティングした表面にT3線維芽細胞をプリントすることです。まず、組織培養表面に血清を予め吸着させます。次に、連続フローマイクロスポッターを用いて線維芽細胞懸濁液を表面にプリントし、続いて細胞を37°Cで2時間インキュベートします。

次に、プリントされた細胞および標準的な細胞培養で播種された細胞をプロピジウムイージドで染色し、倒立顕微鏡下で観察して比較します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、適切なタイムポイントにおける細胞の生存率、密度、および形態を評価します。ピンプリンティングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、プリントヘッドが表面を密閉するため、細胞培地に浸した状態で細胞をプリントできることです。

細胞の浸漬プリンティングは、新薬候補の安全性および有効性のスクリーニングに有用ですが、一般的に浸漬プリンティングは他のアプリケーションにも有用です。例えば、組織切片を用いた新薬候補の解析や、器官系のモデルとして利用することが可能です。一例として、肝臓灌流モデルなどが挙げられます。

一般的に、この方法に不慣れな方は、プリンターのプライミングおよび細胞プリント中にラインへ空気が混入すると細胞死を招く可能性があるため、苦労することがあります。まず、NIH 3T3細胞を37 °Cの振盪水槽で2〜3分間解凍します。細胞を5 mLの完全培地で再懸濁し、1500 ×gで3分間遠心分離します。

細胞ペレットを乱さないように細胞上清を除去します。次に、細胞を5 mLの培地で再懸濁し、細胞懸濁液10 µLを0.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。続いて、細胞懸濁液にトリパンブルー10 µLを加え、ピペットのチップで混ぜ合わせます。染色した細胞10 µLをヘモサイトメーターのチャンバーにピペットで注入します。

10倍の倍率で細胞を計数する前に、小さな白い球体に似た生細胞を、9つの大きな区画のうち4つ分カウントします。トリパンブルー染色により濃い青色に見えない生細胞のみをカウントしてください。大きな区画1つあたりの平均細胞数を算出し、その細胞数に10,000を乗じることで、元の細胞懸濁液中の1ミリリットルあたりの細胞数を求めます。

次に、T 25フラスコ1本あたり合計5 mLの液量で、100,000 cells/mLの密度で細胞を播種します。実験を開始する前に、細胞を70〜80%のコンフルエンシーまで培養します。プリント表面を準備するために、組織培養処理済みポリスチレン12の底面に、プリントヘッドと同じサイズの長方形をマーカーで書き込みます。

ウェルプレートの長方形の領域に胎児牛血清を50 µL分注し、領域全体に広げます。チップを外した後、血清のスポットを完全に乾燥させるため、ウェルプレートを滅菌済みのバイオセーフティーキャビネット内に一晩放置します。没入プリントを開始するには、プリントヘッドを蒸留水で洗浄してください。

次に、60 millimeterのペトリ皿に蒸留水を満たし、プリントヘッドを表面に固定させます。ニューマチックポンプを用いて、各ラインに150 microliters per minuteの流量で2分間蒸留水を流します。その後、ペトリ皿の水を捨て、きれいな水で満たします。次に、プリントヘッドを水の中で3回上下に動かします。

あらかじめ準備した12ウェルプレート内の血清コーティング部位の中央にプリントヘッドをドッキングさせます。次に、Prewarmを用いてプリントヘッドをプライミングします。完全培地を1チャンネルあたり300 µL使用してください。

複数回のプリントを行う場合は、プリント間の水洗浄に加えて漂白剤による洗浄を行ってください。その後、懸濁細胞を濃度50,000 cells/mL、流速60 µL/minで表面にプリントします。1チャネルあたり100 µL使用します。

セルプリンティング後、プリントヘッドを左側のドッキング位置に戻し、マニホールドとともに細胞培養インキュベーターに入れます。5% carbon dioxide、37 °Cに設定し、2時間培養します。2時間の培養後、プリントヘッドを取り出し、培養皿に蓋をします。

プリントヘッドを取り外した時点を0時間として定義します。比較のため、標準的な細胞培養も同時に行います。血清をスポットした12ウェルプレートの1つのウェルに、あらかじめ温めておいた培地を1 mL加え、次に残りの細胞懸濁液1 mLを採取し、12ウェルプレートの別の1つのウェルにピペットで分注します。

これにより、ディッシュ内に50,000個の細胞を含む培養液が作成されます。細胞培養プレートを37°Cのインキュベーターに2時間置きます。2時間のインキュベーション後、プリントサンプルと播種サンプルの整合性を保つため、タイマーを開始します。

これを0時間の時点とします。0、2、24、および48時間後に、死細胞の核にのみ取り込まれるプロピジウムヨードで染色し、2つの方法それぞれで細胞をイメージング用に調製します。まず、デブリを除去するため、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水1 mLで細胞を3回静かに洗浄します。

次に、あらかじめ加温した培地を1 mLずつ各培養容器に加え、続いてプロピジウムヨードストック溶液を1 µL加えます。プロピジウムヨードで染色した細胞を37 °Cで10分間インキュベートした後、倒立顕微鏡を用いて10倍および40倍の倍率で細胞をイメージングします。最後に、細胞を適切なバイオハザード容器に廃棄してください。

線維芽細胞株であるNIH 3T3細胞を、浸漬表面にプリントまたは播種しました。プリントおよび播種後、適切な時間経過における細胞密度と形態を評価するために可視化を行いました。画像から、各タイムポイントおよび各倍率において、細胞がほぼ同一の表現型を有していることが示されました。

これらの数値に基づき、有効なプリント量は最小限であったと判断されました。プロピジウムヨード染色を用いて細胞生存率を評価したところ、プリントされた細胞の生存率は、各タイムポイントにおいて播種された細胞と有意な差がないことが明らかになりました。細胞を表面に付着させるこれら2つの方法の主な違いは、細胞密度にあります。

2時間後の時点において、播種した細胞とプリントした細胞の両方で、プリントされた細胞密度が50%以上減少しました。この減少の原因を特定するためには、さらなる研究が必要です。しかしながら、播種した細胞と比較した全体的なプリント密度比は、依然として有意に高い値を示しています。

フローセル内のプリントされた細胞密度は、各タイムポイントにおいて播種細胞の約10倍の密度となりました。これは、播種時と同じ密度で、より狭い範囲に細胞がプリントされたためと考えられます。最終タイムポイントでは細胞密度が同一となっており、これは細胞の運動性とリソース消費の制限によるものと考えられます。本技術の開発以降、創薬分野の研究者が、細胞に対する薬物毒性や有効性の影響を研究する道が開かれ、がん、心疾患、およびその他の需要の高い分野への応用が進んでいます。

潜水細胞プリンティングを、接着性やプログラム可能な細胞接着などの他の技術と併用することで、この手法を浮遊細胞まで拡張でき、創薬および開発スクリーニングの範囲を広げることが可能です。このビデオを視聴することで、当社の潜水プリンティング技術を用いて細胞をプリントする方法について、十分な理解を得ることができます。