単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

本実験の全体的な目的は、蛍光法または免疫アッセイを用いて単一細胞溶解物を分析することである。まずマイクロ流体デバイスを作製し、内部チャンバーを抗体でコーティングする。次に、単一細胞をトラップ内に固定し、様々な試薬に曝露して細胞応答を誘導する。

リング形状のバルブを素早く閉じ、溶解バッファーをデバイス内に流します。次に、リング形状のバルブを短時間開き、マイクロチャンバー内で細胞を溶解させます。これにより、微小容量のため、放出されたタンパク質が高濃度で抗体に結合します。最後に、リング形状のバルブを開きます。

チャンバーを洗浄し、密閉されたマイクロチャンバー内に検出試薬を導入します。蛍光顕微鏡を用いて蛍光強度の時間的な増加をモニタリングします。その結果は、個々の細胞から放出される目的の分析物を、本システムで定量的かつ信頼性高く検出できることを示しています。この手法は、単一細胞解析分野における重要な課題の解決に寄与します。

特に、化学的環境の変化に対する細胞応答の体系的な調査が行われました。化学的刺激の結果として、細胞内分子の発現量が増加または減少することを確認できます。この手法には、主に2つの利点があります。

第一に、固定化された細胞を、一定または周期的に変化する規定の化学環境にさらすことができます。第二に、輸送による交差汚染や分析物の損失なく、状態の高感度かつ特異的な分析を行うことができます。まず、付属のテキストプロトコルに従って、3種類の異なるSU-8マスターウェハーを作製します。

1つは流体層の作成に、1つは制御層に、そして3つ目はマイクロコンタクトスタンプに使用します。次に、PDMSと硬化剤を10:1の比率で混合して準備し、マイクロ流体チップを作製します。両液を激しく混合し、溶液を30分間、または気泡がなくなるまで脱気します。

次に、ウェハーをペトリ皿内のコントロール層に配置し、底面にテープで固定します。その上に PDMS を約 50 g 注ぎ、厚さ 4〜5 mm の層を作成し、PDMS を完全に硬化させるため、80 °C のオーブンに少なくとも 2 時間置きます。マイクロコンタクトプリンティング用ウェハーについても同様の手順を繰り返しますが、PDMS は 50 g ではなく約 20 g 使用し、厚さ 4〜5 mm の PDMS 層を作成します。

ボトムレイヤーを準備するには、マイクロ流路層があるウェハ上に、厚さ 40 micron の PDMS 層をスピンコートします。回転速度は 2000 RPM で 60 seconds としてください。すべての部位が硬化した後、PDMS 層をオーブンを用いて 80 °C で 1 hour curing します。

ウェハーからコントロール層を取り除き、カミソリブレードを用いて細かく切断します。次に、1 mmの生検パンチを使用して圧力接続穴を開け、保存のためにチャンネルをテープで覆います。続いて、マイクロコンタクトプリントウェハーからPDMSを取り除き、チャンバー領域と同じサイズのスタンプを準備します。

使用するまで、引き出しの中に入れ、ホコリがつかないように保管します。次に、スピンコートしたウェハーと厚さ4～5 mmのコントロール層をプラズマクリーナーに入れます。0.75 millibarの酸素プラズマを用い、18 wattsで45秒間、各ピースに処理を行います。

プラズマ処理後、作動距離の長い顕微鏡下で両方の層を速やかに合わせます。ウェハからPDMSを剥離しやすくするため、配置した上部パーツの周囲に予備のPDMSを追加します。その後、ウェハを80 °Cのオーブンに少なくとも1時間入れます。

硬化後、メスを使用してウェハーからPDMSを慎重に剥離し、マイクロチップを切り出します。1.5 millimeterの生検パンチを使用して、流体接続用のアクセスホールを開けます。さらに、200 microliterピペットチップの上部を切り取り、予備の半硬化PDMSを用いて、マイクロチップにリザーバーを作成します。これを上部に接着してください。

その後、チップをオーブンに入れ、80 °Cで1時間以上キュアします。まず、ガラススライドとPDMSパーツを洗浄します。ガラススライドを石鹸で洗浄してください。

蒸留水で洗浄し、次にエタノールで再度洗浄します。窒素気流を用いてスライドを乾燥させます。テープを使用して、PDMSからゴミやほこりの粒子を取り除きます。

次に、PDMSパーツと洗浄済みのガラスをセットします。強固な接合を確実にするため、プラズマクリーナーに挿入し、18 Wで45秒間処理します。プラズマ処理後、チップをホットプレート上に5分間置きます。接合後、200 µLピペットチップの先端を数本切り落とします。そこに4% BSA含有のろ過済みPBSを10〜15 µL満たし、デバイスのインレットに配置します。

次に、10〜15 µLのPBSを加えたカットチップを使用し、コントロールチャネルに注入します。続いて、チップを遠心分離機にセットし、800 ×gで5分間遠心分離して、チャネル内を液体で満たします。いずれかのチャネルに気泡が残っている場合は、チャネルが完全に満たされるまでこの手順を繰り返します。

ブロッキング溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートします。次に、PBSを用いて10 microliters per minuteの流速で流体層から溶液を洗浄します。シリンジポンプを使用して、デバイスは細胞実験に使用可能な状態になります。免疫測定のためにガラススライドをプリプリントするには、クリーンなペトリ皿内でPDMSマイクロコンタクトプリントスタンプを0.5%ビオチン化BSAでインキュベートしてください。

30分後、スタンプを蒸留水で迅速かつ十分に洗浄し、窒素気流下で乾燥させます。乾燥後、速やかにスタンプを洗浄済みのガラススライド上に配置し、パターン化されたビオチン化BSAを転写させます。配置した後はスタンプを動かさず、スタンプがガラススライドに密着していることを確認してください。

密着していない場合は、スタンプを軽く叩きますが、強く押し付けないでください。次に、スタンプとマイクロ流体チップの上部を一緒にプラズマチャンバーに入れ、18 wattsで45秒間、酸素プラズマにさらします。プラズマ処理後、ガラススライドからスタンプを取り除きます。

表面に息を吹きかけると、パターンが可視化されます。プリントされた表面の上にマイクロチャンバーを合わせます。位置を合わせた後、チップを50 °Cのホットプレート上に30分間置き、残りの表面をブロッキングします。前述の手順に従い、遠心分離機を用いて4%のBSA（PBS調製、滅菌フィルターろ過済み）溶液をチップ内に導入し、マイクロチップを30分以上インキュベートした後、PBSを用いて10 µL/minの流速で流体層から溶液を洗浄します。

シリンジポンプを用いて、チップをそのまま使用するか、または加湿ボックス内で4°Cで最大2週間保存した後に使用します。次に、PBSに溶解したavadonをリザーバーに導入し、完全に機能する結合表面を作成します。その後、溶液を流してavadonを流路内に引き込みます。

リザーバーを十分に洗浄し、チャネル内をPBSでフラッシュします。次に、リザーバーにprotein Gを添加し、チャネル内に引き込みます。リザーバーとチップをPBSで洗浄し、余剰なprotein Gを洗い流します。

次に、目的の抗体をリザーバーに加え、チャネル内に流します。その後、流れを止めて結合させ、PBSでチャネルを洗浄します。細胞をチャネルに導入する前に、蛍光標識アナログを用いてプリンティングプロセスの品質を確認することができます。ここで示したHEK 293細胞などの付着細胞を、酵素フリー解離バッファーを用いて回収し、フィルターに通して細胞クラスターの数を減らします。ろ過後、それらをシリンジに充填します。

細胞密度を300, 000 cells/mLとし、シリンジポンプを用いて10～20 µL/minの流速で約3分間順方向に流し、チップに細胞をロードします。本例のような接着性細胞の場合、トラップが満たされた際の細胞の非特異的な付着を防ぐため、上層に3 barの圧力をかけてチャンバーを密閉します。その後、顕微鏡でチャンバー内を確認してください。チャンバー内部の表面に多くの細胞が非特異的に付着していることが認められた場合は、速やかに密閉を解除し、10～30 µL/minの流速で細胞解離バッファーを流して洗浄してください。

グルコース-6-リン酸脱水素酵素（G6PDH）アッセイでは、2 mMのグルコース-6-リン酸、0.5 mMのADP、0.5 U/mLのDIAアレイ、および0.3 mMのNADを溶解バッファーに添加し、十分に混合させます。チャンネルが洗浄された後、G6PDH溶解バッファーを30 µL/minの流速でチップ内に導入します。溶解バッファーを流しながら、チャンバーを素早く開閉させ、開いた時間を500 msにして溶解液をチャンバーに導入し、溶解直後から反応速度論的モニタリングを開始します。

この例では、蛍光生成物の経時的なモニタリングが可能です。ここでは、オレンジ色の食用色素を満たし、マイクロチャンバー上の制御層を加圧して密閉したチャンバーアレイを示しています。チャンバーの密閉後、緑色の食用色素をチャネル内に流し、チャンバーの密封性を確認しています。

各チャンバーにはわずか 625 picoliters の液体が含まれており、溶解細胞から放出される分子の濃度を分析に十分な高さに維持します。さらに、バルブを開閉することで、チャンバー間のクロスコンタミネーションを排除できます。これらのチャンバー内では、単一の PMA 活性化 U 9 37 細胞から放出されたリソソーム量などの分析物を測定することが可能です。これは、リソソームがチャンバー内で蛍光分子の生成を酵素的に触媒するためです。

緑色の線は、単一の細胞が存在するチャンバーにおける蛍光強度の経時的な変化を示しています。また、細胞を含まないチャンバーの蛍光強度を黒色の点線で示しています。比較として、このアッセイでは細胞内酵素G6PDHを測定することにより、膜完全性に対する毒性分子の影響を示しています。

黒色の線は毒性の影響を受けていないコントロールサンプルを、オレンジ色の線は示された毒性の影響を受けた細胞を表しています。これは、細胞内タンパク質の免疫測定法の例です。表面にGFP抗GFP抗体を固定し、細胞を溶解させた後、GFPタンパク質の結合キネティクスをTURF顕微鏡を用いて視覚化しました。

0.1秒の時点で溶出バッファーが導入されます。0.2秒では、表面にGFPが蓄積し始めており、これは細胞溶解が起こり、GFPが表面に拡散したことを意味します。0.3秒で、GFPの抗体への結合が完了します。この最後の例では、遊離したGA DHが表面のキャプチャー抗体に結合し、その後、HRP標識検出抗体が添加されました。

結合していないすべての検出抗体を洗浄した後、検出試薬を導入し、時間をかけて反応させました。ここでは、この方法を用いて測定したU 9 37細胞とHEC 2 93細胞における、以前は細胞内に存在していたGA DHの動物量的な比較を示します。このビデオを視聴することで、マイクロ流体チップの準備方法、イムノアッセイを可能にするための表面修飾方法、そして最終的に、単一細胞解析にデバイスを使用する方法について十分に理解できるはずです。

この手法は、シングルセル生物学の分野における多くの重要な疑問を解決するのに役立てることができます。