Name: 単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 学ぶマイクロ流体チップを用いた単一細胞の蛍光・イムノアッセイによる細胞内タンパク質の定量分析法。この手法により、細胞異質性の理解と精密な細胞応答解析が可能となる。

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作者は感謝して特注の圧力制御システムの構築のために原稿の校正のためのトム·ロビンソン、C.BärtschiおよびH.ベンツを認める。我々はまた、両方のスイス連邦工科大学チューリッヒ、クリーンルーム施設FIRST光学顕微鏡センター（LMC）の使用を承認したいと思います。作業は第7次フレームワークプログラム（ERCの開始グラント、プロジェクト番号203428、nμLIPIDs）の下でメルクセローノと欧州研究会議（ERC）によって賄われていた。

1。 SU-8マスター作製以下のプロトコルが異なるマスクパターンで（回路図や寸法は、図2を参照してください、流体および制御）チャネルの両方のマスター金型を準備します。プロセスは、 図3aに示されている。 <ol><li> 180℃で10分間、4インチのシリコンウェハを加熱することによって開始するスピンコーター上で脱水ウェハをロードし、スピンコート法、SU-8 2015年に次のプロトコルを使用します。 <ol><li> （分注の後、このステップ、開閉蓋の間にSU-8を分配、スピンコーターのオープン蓋）20秒間100rpmでウエハを回転。 </li><li> 10秒500でスピンウエハ（これはウエハ全体上にレジストを広がっていく）。 </li><li> 30秒間、1,750 rpmでスピンウエハ（20ミクロンにレジストの高さを定義します）。 </li></ol></li><li>これがそうでない場合、次の手順でホットプレートに固執するようにアセトン（綿棒を使用）と、ウエハのエッジからレジストを除去。ああにウエハを搬送4分間95℃、熱でotplate。ソフトベーク後に、（365nmで測定された150ミリジュール/ cm 2で）UV光でマスクアライナにおいてソーダ石灰ガラスをテーピングするフォトマスクを介してレジストを露光する。 </li><li>露光後、ホットプレート上で95℃で5分間再度ウェハを加熱する。 RTにウェーハを冷却した後、4分間のSU-8現像液のお風呂にそれを浸す。未露光SU-8を削除するにはやさしく振る。クリーンルームグレードのイソプロパノールでウェーハを洗浄し、窒素でブロー乾燥。開発は（特に細胞トラップ）成功した​​場合、顕微鏡下で確認してください。細胞トラップが完全に開発されている場合は、シリコンウェハの反射が見えるはずです。必要に応じて、数分間、再びウェハを開発しています。 </li><li>全ての残留溶媒を除去し、180℃で2時間、オーブン内でウェハを焼く。ステッププロファイラを有するチャネルの高さを確認してください。高さが所望の高さと異なる場合は、新たなウェハとステップ1.1から始めて、このプロトコルを繰り返し、スピン速度（ステップ1.1.3）を変更。 1H、1H、2H、一晩デシケーター内2H-パーフルオロ-ジメチルクロロシランとのウェハをシラン化によってマスター型の製作を最終決定。 </li></ol> 2。マイクロコンタクトプリント用のマスター作製<ol><li>マイクロコンタクトプリンティングのためのマスターモールドを製造するために、180℃で10分間、シリコンウェハを脱水（レジストシラン化表面に良く付着）30秒間、7,500 rpmで、このウェハ上に1ミリリットルのHDMSをコートにスピン。 AZ1518のスピンコート2ミリリットルを正、このプロトコルのレジスト： <ol><li>ウェハに上のレジストの静的注する。 </li><li> 500 rpmで5秒間ウェハを回転。 </li><li> 4000 rpmで60秒間ウェハを回転。 </li></ol></li><li>ホットプレート上で100℃で50秒間ソフトベークした後、フォトマスクを介して、マスクアライナ上にUV光（21ミリジュール/ 365 nmでのcm 2）のレジストを露光する。 75秒間AZ 726の浴槽にレジストを開発しています。 DI水とブローdで開発されたウェーハをリンス窒素でRY。 50秒間115℃でウェハを加熱して残留溶媒を除去。真空下で一晩ウェハSilanize。 </li></ol> 3。マイクロ流体チップの作製二層デバイスの設計は、これらの実験のために使用される。チップは最終的にガラススライド（ 図3b）上に接合される前に、二つの層は、別々に調製され、接合されている。このステップは、PDMS層の製造およびマイクロコンタクトプリント用PDMSスタンプを説明しています。 <ol><li> 10時01 PDMSの混合物と硬化剤を準備します。 （私たちのデザインを使用して、これは10チップになります）、合計で約80グラムのPDMSを準備します。積極的に両方の部分を混合し、混合物は、バブルフリー（〜30分）になるまで、PDMSを脱ガス。 </li><li>シャーレとテープそれを底部に内部の制御層ウエハを配置します。次に、上にPDMSの約50グラム入れて完全な保証するために80℃のオーブンで少なくとも2時間、ウェハを置くPDMSの硬化。この〜20グラムのPDMSが必要なため、マイクロコンタクトプリント用ウエハに対して同じ手順を繰り返します。 </li><li>スピンコートウェーハ上にPDMSを2000回転の回転速度で流体層と約40μmの高PDMS層を形成した。 80℃で少なくとも1時間オーブンにPDMSを治す</li><li>両方の部分が硬化されると、ウエハから制御層を除去し、カミソリの刃を有する小片に切断した。 1mmの生検パンチャーを用いて圧力接続穴パンチ。ストレージのためには、チャネルを介してテープ片を置くことをお勧めします。 </li><li>二つの層を接合するには、スピンコートされたウェハおよび上部を取り、プラズマクリーナー23に配置します。プラズマ処理後、速や​​かに大きな作動距離を有する顕微鏡下で両方の部品を整列させる。設置されたトップ部分の周りにいくつかの予備のPDMSを追加します。このステップは、しかし、それは、ウェハからPDMSの除去を容易に、必須ではありません。少なくとも1時間80℃のオーブン中にウェハを置き。 </li><li>慎重にウェハからPDMSを除去し、マイクロチップをカットするメスを使用してください。 1.5ミリメートル生検パンチャーと流体接続のためのアクセスホールパンチ。 </li><li> PDMSチップは完了し、ヶ月間保存することができる。オプション：チップ貯水池で使用されている場合は、200μlのピペットチップの上部をカットし、その上に、それを接着するためにいくつかの予備、半硬化PDMSを使用しています。少なくとも1時間、80℃で再びオーブンにチップを置きます。 </li></ol> 4。スライドガラスに接着直接酵素アッセイ用のデバイスを使用するには、接合後に必要な唯一のステップでは、表面のブロックしています。このプロトコルでは、イムノアッセイまたはELISAのためのマイクロ流体チップを使用するように、しかしAに進み、唯一の（ つまり全反射顕微鏡またはSPR用）ガラススライドに結合部位を制限するプロトコルBを参照してください。この制限が重要でない場合は、Aを参照してください。ただし、手順4.3でビオチン化複合体を使用し、ステップ4.8に進んでプロトコルBで完全に機能面を作成します。 プロトコルAとBを実行する前に：それはチップにそれらを導入する前に使用したタンパク質のソリューションのすべてをフィルタリングすることをお勧めします。デブリおよびタンパク質凝集体は、そうでなければ、それによって分析のために使用することができるチャンバの数を減少させる、細胞トラップをブロックすることができる。この目的のために、チャネルにそれらを導入する前にすべてのソリューションをフィルタリングする非タンパク質吸着フィルターユニットを使用する。 プロトコルA（酵素アッセイ） <ol><li>マイクロ流体デバイスを完成させるために、スライドガラス上にPDMS部分を接着。これを行うには、まず、石鹸、蒸留水とエタノールでガラススライドを清掃してください。窒素気流を用いてスライドを乾燥させる。スコッチテープでのPDMS部分を清掃してください。 </li><li> PDMS部分と洗浄されたガラススライドはタイトな結合を保証するために18 W.にて45秒間、プラズマクリーナーに入れ、5分間、ホットプレート（100°C）上のチップを置く。 </li><li>接合後、F、チップを埋めるLUIDは。これを達成する簡単な方法は、遠心力を使用することである。 200μlのピペットチップの下の部分をカットします。流体チャネルは、ブロッキング溶液でそれらを埋める（ウシ血清アルブミン（4％w / v）の、またはポリ-L-リジン）グラフト化ポリエチレングリコール（0.05％w / v）のおよび入口に先端を配置する。のいずれかで、水または等張液、 例えば PBSで制御層入口を埋める。 5分間遠心（800×g）でにチップを置きます。チャンネルは、現在は完全に流体を充填する必要があります。いない場合は、この手順を繰り返します。 </li><li>室温で少なくとも30分間ブロッキング溶液をインキュベートする。シリンジポンプを用いて10μL/分の流速でPBSで流体層の外溶液を洗浄する。デバイスは現在、細胞実験の準備ができています。 </li></ol>プロトコルB（イムノアッセイ） 以降のステップ4.7からの表面改質の完全な概要については、 表1を参照してください。 <ol start="5"><li>でBBSA / BSA溶液（ 例えば 1-100）とマイクロコンタクトプリント用cubate PDMSスタンプ。 30分後、蒸留水で十分にスタンプをきれいにし、窒素気流下でスタンプを乾燥させる。すぐに洗浄したガラススライドさせます（ 図4）にスタンプを配置します。 </li><li>プラズマクリーナーの最大電力で45秒（18 W）の酸素プラズマにマイクロ流体チップの上の部分と一緒にスタンプをガラススライドを公開します。プラズマ処理後、スタンプを削除して、デバイスのマイクロチャンバーの下に印刷面を合わせます。 50℃のホットプレート上で30分間チップを配置</li><li>残りの表面をブロックするには、遠心分離器を有するチップに滅菌ろ過したBSA溶液（4％（w / v）のPBS中）（ステップ4.2を参照）を導入。 1時間インキュベートし、PBSで流体層（ステップ4.3参照）から解決策を洗う。チップは、次いで、湿ったボックス内に4℃で直接使用するか、最大2週間保存することができる。 </li><li>完全に機能的結合surfac用電子、リザーバ内アビジン（0.025％（w / v）のPBS中）を導入する。流体チャネルを介してアビジン溶液を引き出すために、30分間に5μl/分の流速を使用する。その後、10分間、PBSをフラッシュします。徹底的に貯水池をすすぐ。 </li><li>その後、プロテインG（0.0025％（w / v）のPBS）で、さらに30分間のフラッシュを追加する。その後さらに10分間PBSで洗浄します。次に、10分間、目的の抗体（0.0001％（w / v）のPBS中）を添加する。 10分後、結合を可能にする15分間の流れを止める。次に、10分間、PBSで洗浄する。 </li></ol> 5。細胞実験プロトコルは、可能性があるため、種々のアッセイの一般的な用語で書かれています。一例としてG6PDH毒性アッセイに必要な試薬が挙げられる。デバイスの初期細胞捕捉効率、 すなわち 200個の細胞のう ​​ち5がトラップされ、約2.5％です。細胞トラップの最終的な占有率が強く使用される細胞株、サスペンドするプロトコルに依存し細胞株および細胞がチャネルを通ってフラッシュされる時間。天然に（例えば、U937など）、懸濁液中で増殖する細胞は、単一細胞は、数分後にチャンバの約75％において見出され得る。他の室のいずれかを充填し、2種類以上のセルによって占有されていない。一般に、単一のセル占有率は、接着細胞株についても小さい。ここに提示むしろ軽度の懸濁化プロトコルを使用する場合、割合は約30％（HEK、MLT細胞）に減少する。単一セルの占有率は、細胞のトリプシン処理によって改善することができるが、これはまた、実験の結果を変化させることができる。 標的分子に依存して、PDMSへの吸着または吸収が結果に影響を与えることができる。吸着は、BSA又はPLL-gの-PEGで表面を遮断することによって低減することができる。吸収はほとんどの親水性生体分子のための可能性は低いですが、それは（小）親油性の細胞成分を確認する必要があります。 <ol><li>特定のプロトコルに従って細胞を調製（ 例えば </EM&gt;薬剤添加）。浮遊細胞の場合は、チップを直接セルを追加。接着細胞株については、細胞懸濁液を生成するための酵素を含まない解離緩衝液を使用する。細胞クラスターの量を減らすために、チップにそれらを導入する前に細胞を絞り込む。 </li><li>シリンジポンプと順方向の流れを使用してチップ上に細胞をロードするのではなく、細胞懸濁液を撤回する。チャネル壁上への細胞の非特異的付着を低減するため、接着剤の懸濁細胞株および10〜20μlの/分の高い流量のために5μl/分の流速を使用する。 </li><li>トラップが満たされると、チャンバーを閉じます。多くの細胞が表面に非特異的に付着すると、10から30μL/分の流速で細胞解離緩衝液でそれらを洗い流すようにしてください。 </li></ol>プロトコルA（酵素アッセイ） <ol start="4"><li>チップを通して溶解バッファーを撤回。この例では、この緩衝液を加えツイーン20（10mMトリス-HCl、10と低浸透圧緩衝液であるのKCl、1.5mMのMgCl 2、1％（v / v）のツイーン20）。溶解のための、すぐに開いたり閉じ室（10〜50μL/分7,21の流量のためのすなわち 500ミリ秒）。 G6PDHアッセイのために、2mMのグルコース-6 - リン酸、0.5mMのNADP、0.5 U / mlのジアホラーゼ、溶解緩衝液に0.3mMのレサズリンを加える。すぐに溶解後、運動反応の監視を開始。 </li></ol> 注意 ：アッセイに適した任意のバッファを選択して、（トリトン、SDSのような）強い洗剤を溶解する細胞は直ちに室開口時の分析物の損失につながることを念頭に置いたが、裸。 プロトコルB（イムノアッセイ） ELISA細胞実験（流量、チャンバー状態など ）の簡単な説明については、 表1を参照してください。 <ol start="5"><li> ELISAのために、直接溶解バッファーに必要な検出試薬（ 例えば二次抗体、標識抗原）を追加します。ここには、気取っを追加しましたN 20は、非特異的吸着を低減します。ステップ5.4に従った細胞を溶解。 （使用される抗原および抗体に応じてインキュベーション時間）に結合できるように、10〜15分間混合物をインキュベートする。 </li><li>チャンネル壁に非特異的に吸着した抗体酵素複合体は、リザーバおよびチャネル内部で既に検出試薬の転換につながることができます。この吸着による問題を低減するために、（チャンバは検出試薬を添加する前に、閉じた状態）インキュベーション時間の間、チップに使用される検出酵素の永久的な阻害剤を洗い流す。 HRPの、永続的に非特異的に吸着した酵素を不活性化するために、水に20 mMの塩酸を使用しています。 </li><li>インキュベーション時間の後、チップへの検出試薬（ 例えば、アンプレックスレッドとHRPのための過酸化水素）を導入する。離れて非結合二次抗体を洗浄するためにすぐにもう一度室を開き、検出試薬を追加する。すぐに運動反応の監視を開始。 </li><li>キャリブレーション：固定化し目的の標的に対する抗体。閉じる室。バッファ内またはオフチップ細胞溶解液中の分析物の異なる濃度を準備します。チップに濃度を適用し、迅速室（開放時間500ミリ秒）内の容積を交換します。この開放時間は、追加の蓄積が検体フラッシングから発生せず、マイクロチャンバーの容積からの分子の特定の数が検出されることを保証するのに十分に短い。ソリューション内部の抗原の既知濃度と室の容量（625 PL）から、室内に金額を計算します。その後、ステップ5.5を続行し、検出部分を紹介します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

マイクロフルイディクス技術は、単一細胞分析のための新しい魅力的な可能性を開いた。具体的には、トラップする可能性と、マイクロ流体ツールで個別に細胞を固定は、単一セルのプロパティと対応に関する体系的な短期的および長期的な研究を可能にした。また、マイクロチップ上に発生した高周波微小液滴、中の細胞のカプセル化は、従来のフローサイトメトリー装置を用いて実施することができない単一の細胞分泌の研究を可能にした。インキュベーションおよび洗浄工程が分析プロトコルに必要とされるときに微小液滴のアプローチは、しかしながら、いくつかの制限がある。我々のアプローチは、細胞捕捉および分離の両方の概念を結合し、したがって、それは、表面固定化抗体に基づく免疫アッセイを含む、より複雑なアッセイを実施することが容易になる。さらに、この方法は、アプリケーションとターゲット分析物に対して非常に柔軟である。 マイクロチップのデザインは、（i）効率を可能にする効率の良い細胞捕捉、種々の緩衝液および試薬の（II）の供給、そして非常に少量（III）信頼性の高いアイソレーションが必要です。このようにして、標的分子の希釈が回避される...

過去の多くの研究は、特定のシグナル伝達プロセス4、またはこのようなタンパク質は、5,6、代謝産物、および補因子7,8のような細胞内の生体分子の量で、大きな細胞集団1-3内の細胞間の差異を明らかにした。これらの不均一性は、細胞適応と進化9根本的に重要であるが、また、例えば10-13癌などの疾患の出現および治療 ​​に重要な役割を果たすと考えられている。したがって、単一細胞レベルでの研究は、これらの研究は、生物活性化学物質を用いた治療後の異なる細胞応答を明らかにする場合は特に、生物学的および薬理学的研究において高い関心が持たれている。 近年では、多くの分析プラットフォームは、単一の生細胞の分析または細胞内容物の化学組成を容易に開発されている。蛍光活性化細胞選別（FACS）がゴールドSTですがandard単一の生細胞の非常にハイスループット分析のために、この方法は、細胞内または分泌された化合物の定量に用いることができない。マイクロ流体プラットフォームの出現は、単セルの配置、治療および観察のための新規な分析的な戦略を約束した。マイクロ流体中のマイルストーンはクエイクや同僚14,15によって実現フレキシブルなPDMSバルブの統合に達した。これらのバルブは、彼らは例えば、二つの文化16を分離、チップ上の領域を分離することができるので便利です。さらに、それらは、単一細胞解析に特に適用可能であり、したがって、検体の希釈の問題を低減するのに役立つ。単一細胞分析のためのこのアプローチの電力は、最近ハンセンと平行な17の単一の細胞から数百の遺伝子発現を分析した共同研究者によって実証されている。 タンパク質および代謝産物を標的とする場合、分析は、適切なαの欠如のために非常に困難であるmplification方法、様々な本発明の化合物、および化学的性質におけるそのバリエーション多数。さらに、ほとんどの細胞内生体分子は、従って使用される分析方法は、高い感度を持っている必要があり、数千、数10 18のために、低コピー数で存在することが予想される。そのようなイムノアッセイおよび酵素結合免疫測定法（ELISA）のようなより強力なアッセイは、それらがいくつかの洗浄およびインキュベーション工程、ならびに表面固定化を必要とするため、マイクロ流体デバイスに統合することが困難である。 これらの課題に起因し、それは、タンパク質または代謝産物が単一細胞レベルで定量したところ、わずか数例が報告されていることは驚くべきことではない。例えば、蛍光化合物の分泌の研究は19,20が報告されている。近年、ELISAによる実装は、細胞培養物から分泌された（非蛍光）、タンパク質（THP-1細胞）の分析21と、単一の（iについて提示されたmmune）細胞10。細胞内タンパク質を標的とする、市らは、イムノアッセイ11によって腫瘍細胞におけるシグナル伝達経路の解析のための細胞内タンパク質の同定を容易にするマイクロ流体デバイスを開発した。しかし、タンパク質の相対量のみを測定し、まだ酵素的増幅は、低存在量タンパク質に対するシグナルを増加させるために使用されなかった。 最近では、蛍光アッセイ8とイムノアッセイ22（ 図1）とのシングルセルトラップマイクロデバイスを結合することができました。細胞を受動的に供給し、細胞のあらゆる動きのない媒体および他の化学物質の（急速）の交換を可能にするマイクロサイズハードル構造にトラップされる。各トラップの周囲にリング状の弁は、非常に少量（「マイクロチャンバー」）で、細胞を単離することができます。この弁は、彼、細胞溶解（低浸透圧）のバッファを導入した直後に作動するNCE離れて拡散する細胞内分子または分泌される分子を防止することができる。最も重要なことに起因する体積（plの625）のサイズが小さい分子の大きな希釈が回避される。溶解および分析は、チップの同じ位置で行われるので、輸送に起因する分析物の損失はない。ここに記載のチップ設計は、60マイクロチャンバー合計7または8のいずれかのマイクロチャンバ8の交互の行を含む。線に沿った相互汚染が排除されるように、チャンバは、列に作動される。 プラットフォームは、蛍光アッセイ、ならびに免疫学的ア ​​ッセイ（ 図1d）と組み合わせて使用することができる。後者に関しては、チップ製造および組立工程と適合性である抗体の固定化のためのプロトコルを確立した。したがって、プラットフォームは、単一細胞レベルで、信頼性の高い感受性および定量化アッセイのための道を開く。これまで、我々は、iの分析のために装置を使用しているntracellularと分泌される酵素（酵素アッセイによる相対定量化）、細胞内の補因子、タンパク質と小分子（エンドポイントアッセイやELISAによる絶対定量）。以下では、マイクロコンタクト·プリンティングおよび界面化学を用いて多層ソフトリソグラフィーおよび抗体のパターニングのためのプロトコルを用いて、チップ製造プロセスを説明。さらに、チップの使用および操作のいくつかの例が示されている。

<table><tbody><tr><td>試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント (オプション)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ABCR (カールスルーエ, ドイツ)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル &beta;-D-N,N&prime;-ジアセチルキトビオシド水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck VWR (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (ヴィースバーデン、ドイツ)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 developer</td><td>AZ Electronic Materials (ヴィースバーデン、ドイツ)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、ビオチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>細胞解離バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサメチルジシラザン (HDMS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フルーカ</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG grafted</td><td>SuSoS, (D&uuml;ベンドルフ、スイス)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr><tr><td>グラフトビオチン</td><td>SuSoS、(D&uuml;ベンドルフ、スイス)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>プロテインG、ビオチン</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Si-Mat (Kaufering、ドイツ)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 シリコーンエラストマーキット (PDMS)</td><td>ダウコーニング</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメサン</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント (オプション)</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m PESシリンジ</td><td>フィルターTRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1 / 1.5 mm生検パンチャー</td><td>ミルテックス、ヨークPA</td><td>33-31AA / 33-31A</td><td></td></tr><tr><td>セルトリクスフィルター20&マイクロ;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Hotplate</td><td></td></tr> <tr><td>HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>mask aligner</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M microscope</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, U.K.</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

私たちは、並行して複数の単一細胞における細胞内の生体分子の測定を可能とマイクロ流体デバイスを提供する。この目的のために、細胞を、受動的にマイクロチャンバーの中央に閉じ込められている。制御層の活性化の際に、細胞は、小さなチャンバ内の周囲の容積から隔離される。周囲の容積は、次いで、単離された細胞に影響を与えることなく交換することができる。しかしながら、チャンバの短い開閉時に、チャンバー内の溶液が数百ミリ秒以内に交換することができる。によるチャンバの可逆性のために、細胞は、インキュベーション、洗浄、そして最後に、細胞溶解のために、例えば、高度に制御可能な様式で異なる溶液を順次に露光することができる。密閉マイクロチャンバは、細胞溶解後の希釈を最小限にし、制御し、溶解物の保持を可能にする。溶解および分析は、同じ場所で発生しているため、高感度が、それ以上のDので保持されている分析物のilutionまたは損失は、輸送中に発生します。マイクロチャンバーの設計は、したがって、個々の細胞から放出され、細胞内の分子の非常に小さなコピー数（アトモル、ゼプトモル）の信頼性と再現性の分析を可能にします。さらに、多くのマイクロチャンバは、適切な光学機器を監視するために使用されることを考えると、一度に多くの細胞の分析を可能にするアレイ形式に配置することができる。我々はすでに、細胞内タンパク質、酵素、補因子および相対または絶対定量化可能な方法で、セカンドメッセンジャーを分析するための概念実証研究のためのプラットフォームを使用しています。

当社のプラットフォームは、細胞内の様々なだけでなく、中に存在するか、単一の細胞によって産生され分泌される分子を分析することができます。ここで、我々は可能な様々なアッセイを強調するために、異なる例の研究を紹介したいと思います。我々は、分泌酵素（ 図5a）だけでなく、細胞内の酵素（ 図5b）とタンパク質（ 図5CおよびD）のための例を与える。このような補因子または小分子などのより多くの例については、Eyer ら （2012）およびEyer ら （2013）を参照してください。 まず、分泌された酵素（ 図5a）のためのアッセイを提供する。ホルボールミリステートアセテート（PMA）による活性化の際に、ヒト単球、リゾチーム分泌、細菌の細胞溶解を誘導する酵素を誘導する。このアッセイのために、セルバッファは、4 - メチルβ-D-N、N&#39;-diacetylchitobioside、l...

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

本実験の全体的な目的は、蛍光法または免疫アッセイを用いて単一細胞溶解物を分析することである。まずマイクロ流体デバイスを作製し、内部チャンバーを抗体でコーティングする。次に、単一細胞をトラップ内に固定し、様々な試薬に曝露して細胞応答を誘導する。リング形状のバルブを素早く閉じ、溶解バッファーをデバイス内に流します。次に、リング形状のバルブを短時間開き、マイクロチャンバー内で細胞を溶解させます。これにより、微小容量のため、放出されたタンパク質が高濃度で抗体に結合します。最後に、リング形状のバルブを開きます。チャンバーを洗浄し、密閉されたマイクロチャンバー内に検出試薬を導入します。蛍光顕微鏡を用いて蛍光強度の時間的な増加をモニタリングします。その結果は、個々の細胞から放出される目的の分析物を、本システムで定量的かつ信頼性高く検出できることを示しています。この手法は、単一細胞解析分野における重要な課題の解決に寄与します。特に、化学的環境の変化に対する細胞応答の体系的な調査が行われました。化学的刺激の結果として、細胞内分子の発現量が増加または減少することを確認できます。この手法には、主に2つの利点があります。第一に、固定化された細胞を、一定または周期的に変化する規定の化学環境にさらすことができます。第二に、輸送による交差汚染や分析物の損失なく、状態の高感度かつ特異的な分析を行うことができます。まず、付属のテキストプロトコルに従って、3種類の異なるSU-8マスターウェハーを作製します。1つは流体層の作成に、1つは制御層に、そして3つ目はマイクロコンタクトスタンプに使用します。次に、PDMSと硬化剤を10:1の比率で混合して準備し、マイクロ流体チップを作製します。両液を激しく混合し、溶液を30分間、または気泡がなくなるまで脱気します。次に、ウェハーをペトリ皿内のコントロール層に配置し、底面にテープで固定します。その上に PDMS を約 50 g 注ぎ、厚さ 4〜5 mm の層を作成し、PDMS を完全に硬化させるため、80 °C のオーブンに少なくとも 2 時間置きます。マイクロコンタクトプリンティング用ウェハーについても同様の手順を繰り返しますが、PDMS は 50 g ではなく約 20 g 使用し、厚さ 4〜5 mm の PDMS 層を作成します。ボトムレイヤーを準備するには、マイクロ流路層があるウェハ上に、厚さ 40 micron の PDMS 層をスピンコートします。回転速度は 2000 RPM で 60 seconds としてください。すべての部位が硬化した後、PDMS 層をオーブンを用いて 80 °C で 1 hour curing します。ウェハーからコントロール層を取り除き、カミソリブレードを用いて細かく切断します。次に、1 mmの生検パンチを使用して圧力接続穴を開け、保存のためにチャンネルをテープで覆います。続いて、マイクロコンタクトプリントウェハーからPDMSを取り除き、チャンバー領域と同じサイズのスタンプを準備します。使用するまで、引き出しの中に入れ、ホコリがつかないように保管します。次に、スピンコートしたウェハーと厚さ4～5 mmのコントロール層をプラズマクリーナーに入れます。0.75 millibarの酸素プラズマを用い、18 wattsで45秒間、各ピースに処理を行います。プラズマ処理後、作動距離の長い顕微鏡下で両方の層を速やかに合わせます。ウェハからPDMSを剥離しやすくするため、配置した上部パーツの周囲に予備のPDMSを追加します。その後、ウェハを80 °Cのオーブンに少なくとも1時間入れます。硬化後、メスを使用してウェハーからPDMSを慎重に剥離し、マイクロチップを切り出します。1.5 millimeterの生検パンチを使用して、流体接続用のアクセスホールを開けます。さらに、200 microliterピペットチップの上部を切り取り、予備の半硬化PDMSを用いて、マイクロチップにリザーバーを作成します。これを上部に接着してください。その後、チップをオーブンに入れ、80 °Cで1時間以上キュアします。まず、ガラススライドとPDMSパーツを洗浄します。ガラススライドを石鹸で洗浄してください。蒸留水で洗浄し、次にエタノールで再度洗浄します。窒素気流を用いてスライドを乾燥させます。テープを使用して、PDMSからゴミやほこりの粒子を取り除きます。次に、PDMSパーツと洗浄済みのガラスをセットします。強固な接合を確実にするため、プラズマクリーナーに挿入し、18 Wで45秒間処理します。プラズマ処理後、チップをホットプレート上に5分間置きます。接合後、200 µLピペットチップの先端を数本切り落とします。そこに4% BSA含有のろ過済みPBSを10〜15 µL満たし、デバイスのインレットに配置します。次に、10〜15 µLのPBSを加えたカットチップを使用し、コントロールチャネルに注入します。続いて、チップを遠心分離機にセットし、800 ×gで5分間遠心分離して、チャネル内を液体で満たします。いずれかのチャネルに気泡が残っている場合は、チャネルが完全に満たされるまでこの手順を繰り返します。ブロッキング溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートします。次に、PBSを用いて10 microliters per minuteの流速で流体層から溶液を洗浄します。シリンジポンプを使用して、デバイスは細胞実験に使用可能な状態になります。免疫測定のためにガラススライドをプリプリントするには、クリーンなペトリ皿内でPDMSマイクロコンタクトプリントスタンプを0.5%ビオチン化BSAでインキュベートしてください。30分後、スタンプを蒸留水で迅速かつ十分に洗浄し、窒素気流下で乾燥させます。乾燥後、速やかにスタンプを洗浄済みのガラススライド上に配置し、パターン化されたビオチン化BSAを転写させます。配置した後はスタンプを動かさず、スタンプがガラススライドに密着していることを確認してください。密着していない場合は、スタンプを軽く叩きますが、強く押し付けないでください。次に、スタンプとマイクロ流体チップの上部を一緒にプラズマチャンバーに入れ、18 wattsで45秒間、酸素プラズマにさらします。プラズマ処理後、ガラススライドからスタンプを取り除きます。表面に息を吹きかけると、パターンが可視化されます。プリントされた表面の上にマイクロチャンバーを合わせます。位置を合わせた後、チップを50 °Cのホットプレート上に30分間置き、残りの表面をブロッキングします。前述の手順に従い、遠心分離機を用いて4%のBSA（PBS調製、滅菌フィルターろ過済み）溶液をチップ内に導入し、マイクロチップを30分以上インキュベートした後、PBSを用いて10 µL/minの流速で流体層から溶液を洗浄します。シリンジポンプを用いて、チップをそのまま使用するか、または加湿ボックス内で4°Cで最大2週間保存した後に使用します。次に、PBSに溶解したavadonをリザーバーに導入し、完全に機能する結合表面を作成します。その後、溶液を流してavadonを流路内に引き込みます。リザーバーを十分に洗浄し、チャネル内をPBSでフラッシュします。次に、リザーバーにprotein Gを添加し、チャネル内に引き込みます。リザーバーとチップをPBSで洗浄し、余剰なprotein Gを洗い流します。次に、目的の抗体をリザーバーに加え、チャネル内に流します。その後、流れを止めて結合させ、PBSでチャネルを洗浄します。細胞をチャネルに導入する前に、蛍光標識アナログを用いてプリンティングプロセスの品質を確認することができます。ここで示したHEK 293細胞などの付着細胞を、酵素フリー解離バッファーを用いて回収し、フィルターに通して細胞クラスターの数を減らします。ろ過後、それらをシリンジに充填します。細胞密度を300, 000 cells/mLとし、シリンジポンプを用いて10～20 µL/minの流速で約3分間順方向に流し、チップに細胞をロードします。本例のような接着性細胞の場合、トラップが満たされた際の細胞の非特異的な付着を防ぐため、上層に3 barの圧力をかけてチャンバーを密閉します。その後、顕微鏡でチャンバー内を確認してください。チャンバー内部の表面に多くの細胞が非特異的に付着していることが認められた場合は、速やかに密閉を解除し、10～30 µL/minの流速で細胞解離バッファーを流して洗浄してください。グルコース-6-リン酸脱水素酵素（G6PDH）アッセイでは、2 mMのグルコース-6-リン酸、0.5 mMのADP、0.5 U/mLのDIAアレイ、および0.3 mMのNADを溶解バッファーに添加し、十分に混合させます。チャンネルが洗浄された後、G6PDH溶解バッファーを30 µL/minの流速でチップ内に導入します。溶解バッファーを流しながら、チャンバーを素早く開閉させ、開いた時間を500 msにして溶解液をチャンバーに導入し、溶解直後から反応速度論的モニタリングを開始します。この例では、蛍光生成物の経時的なモニタリングが可能です。ここでは、オレンジ色の食用色素を満たし、マイクロチャンバー上の制御層を加圧して密閉したチャンバーアレイを示しています。チャンバーの密閉後、緑色の食用色素をチャネル内に流し、チャンバーの密封性を確認しています。各チャンバーにはわずか 625 picoliters の液体が含まれており、溶解細胞から放出される分子の濃度を分析に十分な高さに維持します。さらに、バルブを開閉することで、チャンバー間のクロスコンタミネーションを排除できます。これらのチャンバー内では、単一の PMA 活性化 U 9 37 細胞から放出されたリソソーム量などの分析物を測定することが可能です。これは、リソソームがチャンバー内で蛍光分子の生成を酵素的に触媒するためです。緑色の線は、単一の細胞が存在するチャンバーにおける蛍光強度の経時的な変化を示しています。また、細胞を含まないチャンバーの蛍光強度を黒色の点線で示しています。比較として、このアッセイでは細胞内酵素G6PDHを測定することにより、膜完全性に対する毒性分子の影響を示しています。黒色の線は毒性の影響を受けていないコントロールサンプルを、オレンジ色の線は示された毒性の影響を受けた細胞を表しています。これは、細胞内タンパク質の免疫測定法の例です。表面にGFP抗GFP抗体を固定し、細胞を溶解させた後、GFPタンパク質の結合キネティクスをTURF顕微鏡を用いて視覚化しました。0.1秒の時点で溶出バッファーが導入されます。0.2秒では、表面にGFPが蓄積し始めており、これは細胞溶解が起こり、GFPが表面に拡散したことを意味します。0.3秒で、GFPの抗体への結合が完了します。この最後の例では、遊離したGA DHが表面のキャプチャー抗体に結合し、その後、HRP標識検出抗体が添加されました。結合していないすべての検出抗体を洗浄した後、検出試薬を導入し、時間をかけて反応させました。ここでは、この方法を用いて測定したU 9 37細胞とHEC 2 93細胞における、以前は細胞内に存在していたGA DHの動物量的な比較を示します。このビデオを視聴することで、マイクロ流体チップの準備方法、イムノアッセイを可能にするための表面修飾方法、そして最終的に、単一細胞解析にデバイスを使用する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、シングルセル生物学の分野における多くの重要な疑問を解決するのに役立てることができます。

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Bioengineering

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単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

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