単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

次の実験の全体的な目標は、蛍光または免疫測定法を使用して単一細胞ライセートを分析することです。これは、最初にマイクロ流体デバイスを作成し、内部チャンバーを抗体でコーティングすることによって達成されます。次に、単一細胞をトラップに固定化し、さまざまな試薬に曝露して、第2ステップで細胞応答を刺激します。

リング状のバルブがすばやく閉じられ、溶解バッファーがデバイス内を流れます。リング状のバルブを短時間開き、細胞をマイクロチャンバー内で溶解することで、放出されたタンパク質を少量で高濃度で抗体に結合させることができます。次に、リング状のバルブが開きます。

チャンバーを洗浄し、閉じたマイクロチャンバーに検出試薬を導入します。蛍光強度の増加は、蛍光顕微鏡を使用して経時的に監視され、その結果は、個々の細胞から放出された目的の分析物を定量的かつ確実に検出するこのシステムの能力を示しています。この方法は、シングルA細胞解析の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

特に、化学環境の変化に対する細胞応答に関する系統的な研究を行いました。化学刺激の結果として、細胞内分子の調節が上下に見られます。この手法には、主に 2 つの利点があります。

1つ目は、固定化された細胞を、一定または周期的に変化する定義された化学環境にさらすことができることです。次に、輸送による二次汚染や分析種の損失なしに、飽和液の高感度で特異的な分析を改革できます。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているように、3つの異なるSU 8つのマスターウェーハを製造します。

1つは流体層の作成に、1つは制御層に、3つ目はマイクロコンタクトスタンプの作成に使用されます。次に、PDMSと硬化剤の10対1の混合物の調製から始めて、マイクロ流体チップを作製します。両方の部分を激しく混合し、溶液を30分間、または混合物が泡なくなるまで脱気します。

次に、ウェーハをペトリ皿内の制御層内に置き、底にテープで貼り付けます。約50グラムのPDMSを上に注ぎ、厚さ4〜5ミリメートルの層を作成し、ウェーハを摂氏80度のオーブンに少なくとも2時間置くと、PDMSが完全に硬化します。マイクロコンタクト印刷ウェーハについても同じ手順を繰り返しますが、50グラムではなく約20グラムのPDMSを使用すると、厚さ4〜5ミリメートルのPDMS層が得られます。

最下層を準備するには、マイクロ流体層を備えたウェーハ上に40ミクロンのPDMS層をスピンコートします。2000 RPMの回転速度で60秒間使用。すべての部品が硬化したら、PDMS層をオーブンで摂氏80度で1時間硬化させます。

ウェーハから制御層を取り外し、かみそりの刃の補助具で細かく切ります。次に、1ミリメートルの生検穿刺を使用して圧力接続穴を開け、チャネルをテープで覆って保管します。次に、マイクロコンタクト印刷ウェーハの上からPDMSを取り外し、チャンバー領域のサイズのスタンプを準備します。

使用するまで、ほこりのない引き出しに保管してください。次に、スピンコーティングされたウェーハと厚さ4〜5mmの制御層をプラズマクリーナーに入れます。0.75ミリバールの酸素プラズマを使用して、18ワットで45秒間ピースを露出させます。

プラズマ処理後、顕微鏡下で両方の層を大きな作動距離で迅速に位置合わせします。ウェーハからのPDMSの除去を容易にするために、配置された上部部品の周りに予備のPDMSを追加します。次に、ウェーハを摂氏80度のオーブンに少なくとも1時間置きます。

硬化したら、メスを使用してウェーハからPDMSを慎重に取り除き、1.5ミリメートルの生検穿刺で流体接続用のマイクロチップパンチアクセス穴を切り取ります。さらに、200マイクロリットルのピペットチップの上部を切断し、予備の半硬化PDMSを使用して、マイクロチップにリザーバーを作成します。上に接着します。

次に、チップを摂氏80度のオーブンで少なくとも1時間硬化させます。スライドガラスとPDMSパーツのクリーニングから始めます。スライドガラスを石鹸できれいにします。

蒸留水ですすいでから、もう一度エタノールですすいでください。窒素の流れを使用してスライドを乾燥させます。テープを使用して、PDMSからゴミやほこりの粒子を取り除きます。

次に、PDMSパーツとクリーニングしたガラスを配置します。18ワットで45秒間プラズマクリーナーにスライドさせて、しっかりと接着し、プラズマ処理後5分間チップをホットプレートに置きます 接着後、200マイクロリットルのピペットチップ下部を切り取ります。10%BSAを含む10〜15マイクロリットルのろ過されたPBSを充填し、デバイスの入口に配置します。

次に、10〜15マイクロリットルのPBSを追加したカットチップを使用し、それらを制御チャネルに入れます。次に、チップを遠心分離機に入れ、重力800倍で5分間回転させて、チャネルを液体で満たします。いずれかのチャネルに空気が残っている場合は、チャネルが完全に満たされるまでこの手順を繰り返します。

ブロッキング溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートします。次に、毎分10マイクロリットルの流量でPBSで流体層から溶液を洗い流します。シリンジポンプを使用して、デバイスは、イムノアッセイ用のスライドガラスを事前に印刷し、清潔なペトリ皿で0.5%ビオチン化BSAを含むPDMSマイクロコンタクト印刷スタンプをインキュベートするための細胞実験の準備が整いました。

30分後、蒸留水でスタンプを完全かつ迅速に洗浄し、窒素の流れの下でスタンプを乾燥させます。乾いたら、洗浄したスライドガラスにスタンプをすばやく置き、パターン化されたビオチン化BSAを堆積させます。貼付後はスタンプを動かさず、スタンプがスライドガラスに接触していることを確認してください。

少しでもタップしない場合は、スタンプをタップしますが、強く押し下げないでください。次に、スタンプをマイクロ流体チップの上部と一緒にプラズマチャンバーに配置し、18ワットの酸素プラズマに45秒間さらします。プラズマ処理後、スライドガラスからスタンプをはがします。

表面で息をすると、パターンが見えます。マイクロチャンバーを印刷面の上に合わせます。位置合わせしたら、チップを摂氏50度のホットプレートに30分間置いて残りの表面をブロックし、前に示すようにPBS中の4%滅菌ろ過BSA溶液を遠心分離機でチップに導入し、マイクロチップを少なくとも30分間インキュベートした後、PBSで溶液をPBSで毎分10マイクロリットルの流量で洗浄します。

シリンジポンプを使用して、チップを直接使用するか、湿度の高い箱で摂氏4度で最大2週間保管します。次に、PBS中のアバドンをリザーバーに導入することにより、完全に機能する結合面を作成します。溶液を流して、その後、アバドンを流体チャネルに引き込みます。

リザーバーをよくすすぎ、チャネルをPBSで洗い流します。次に、プロテインGをリザーバーに加え、チャネルを通して引き抜きます。余分なプロテインGは、リザーバーとチップをPBSですすいで洗い流します。

次に、目的の抗体をリザーバーに添加し、チャネルに流します。次に、PBSでチャネルを蛍光的に洗浄する前に結合を可能にするために流れを停止し、標識されたアナログを使用して、チャネルに細胞を導入する前に印刷プロセスの品質を確認できます。ここに示すHE 2 9 3細胞などの付着細胞を酵素フリー解離バッファーを使用して回収し、それらをろ過して細胞クラスターの数を減らし、ろ過したらシリンジにロードします。

ミリリットルあたり300、000細胞で、シリンジポンプの順方向の流れを使用してチップ上に細胞をロードし、これらのような接着性細胞のための毎分10〜20マイクロリットルの速度で約3分間、トラップが充填されたときに細胞の非特異的な付着を防ぐために、最上層を3本のバーで加圧してチャンバーを閉じます。次に、顕微鏡を使用してチャンバーを調べます。チャンバー内の表面に非特異的に付着している細胞が多い場合は、すぐに細胞を開けて、毎分10〜30マイクロリットルの流速で細胞解離バッファーで洗い流してみてください。

グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼまたはG 6 PDHアッセイでは、2ミリモルグルコース、6リン酸塩0.5ミリモル、DP0.5単位/ミリリットルDIAアレイ、0.3ミリモルRINを溶解バッファーに加え、十分に混合されていることを確認します。チャネルがクリアされたら、G six PDH溶解バッファーをチップに30マイクロリットル/分の流量で引き込みます。溶解バッファーが流れている間、チャンバーをすばやく開閉し、500ミリ秒間開いたままにして、溶解が開始した直後に溶解がチャンバーに入るのを待って、速度論的反応を監視します。

この例では、蛍光製品を経時的に監視できます。ここに示されているのは、オレンジ色の食用色素で満たされ、マイクロチャンバーの上の制御層を加圧することによって閉じられたチャンバーの配列です。チャンバーの閉鎖後、緑色の食用染料をチャネルを通してすすぎ、チャンバーの気密性を示しました。

各チャンバーには、わずか625ピコリットルの液体が含まれており、lys細胞から放出される分子の濃度を分析に十分な高さに保ちます。さらに、バルブは、チャンバー間の相互汚染を排除するように開閉することができます。これらのチャンバー内では、PMA活性化U9 37細胞がチャンバー内の蛍光分子の産生を酵素的に触媒するため、単一のPMA活性化U9 37細胞から放出されるリソソームの量などの分析物を測定することができます。

緑色の線は、1つの細胞が占めるチャンバーの蛍光強度の経時変化を表しています。また、細胞のないチャンバーの蛍光強度も黒点で示されています。比較のために、このアッセイは、細胞内酵素G six PDHを測定することにより、膜の完全性に対する毒性分子の影響を示しています。

黒線は毒性の影響を受けない対照サンプルを表し、オレンジ色の線は示されている毒素の影響を受けた細胞を表しています。これは、細胞内タンパク質のイムノアッセイの例です。GFP抗GFP抗体を表面に固定化し、細胞を溶解すると、GFPタンパク質の結合速度を芝顕微鏡で可視化しました。

時間0.1は、時間0.2でGFPが表面に蓄積し始めているときに溶解バッファーが導入されたことを示しています。これは、細胞溶解が起こり、GFPが表面に拡散したことを意味します。GFPの抗体への結合は、時間0.3で完了する。この最後の例では、遊離したGA DHが結合して表面上の抗体を捕捉し、次にHRP共役検出抗体を添加しました。

結合していない検出抗体をすべて洗い流した後、検出試薬を導入し、経時的に反応を行いました。これは、この方法を使用して測定されたU9 37細胞とHEC2 93細胞との間の動物量における以前の細胞内GA DHの量の比較です。このビデオを見れば、マイクロ流体チップの調製方法、イムノアッセイを可能にするための表面改質方法、そして最後に、シングルセル解析にデバイスを使用する方法について十分に理解できるはずです。

この方法は、シングルセル生物学の分野で多くの疑問を提起するのを助けるために採用することができます。