小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価

この手順の全体的な目的は、小脳顆粒細胞培養における細胞生存率を正確に測定することです。この手法は、神経科学および神経薬理学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、MISTA細胞培養において、不要なグリア細胞とニューロンを区別できることです。

手順のデモンストレーションは、私の研究室の学部生3名、Lin Jiajia、Wang Jialing、Xu Dilinが行います。まず、大後頭孔にハサミを挿入し、耳から目にかけて頭蓋骨の両側を切断することで、生後8日のラット幼仔の頭部解剖を開始します。その後、ピンセットを用いて頭蓋骨を持ち上げます。

ピンセットを用いて小脳を分離し、解剖溶液が入った35 mmのディッシュに入れます。プレートを解剖顕微鏡のステージに移動させ、2本のピンセットを使用して髄膜と血管を除去します。ブレードで組織を細かく刻み、その後、30 mLの解剖溶液が入った遠心チューブに組織を移します。

室温で1,500 x gにて5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを回収します。次に、ペレットにTrypsin溶液を加え、穏やかに振盪して再懸濁します。

次に、チューブを37 °Cのウォーターバスで15分間加温します。15分後、DNase One、大豆トリプシンインヒビター、および硫酸マグネシウムの溶液を加えて振とうします。その後、室温で1,500 x gで5分間遠心分離します。

上清を吸引した後、ペレットを低濃度のDNase One、大豆トリプシンインヒビター、および硫酸マグネシウム溶液で再懸濁します。次に、15 mLチューブを2本用意します。細胞を2つのチューブに半分ずつ分注し、綿栓付きパストールピペットを用いて60〜70回ピペッティングし、細胞を均質化します。

ホモジナイズ後、各15 mLチューブに硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウム溶液を3 mL加えます。チューブを室温で10分間静置します。時間が経過したら、綿栓をしたパストゥールピペットを用いて上清を注意深く取り除き、新しい15 mLチューブに移します。

室温、1,500 x gで5分間遠心分離します。ペレットに培地を加え、細胞密度が約1.5 x 10⁶ cells/mLになるように希釈します。細胞を6ウェルプレートに分注し、37 °C、5% CO₂のインキュベーター内で培養します。

24時間後、グリア細胞の増殖を抑制するため、AraCストック溶液を最終濃度1 mMになるように添加し、プレートをインキュベーターに戻します。次いで7日目に、D-glucoseストック溶液を最終濃度1 mMになるように50 µL添加します。その後、fluorescein diacetateを最終濃度10 µg/mL、propidium iodideを最終濃度50 µg/mLとなるように、10 mLのPBSに混合して染色を開始します。

FDA/PI溶液をボルテックスで混合し、氷上に置きます。培養プレートを氷上に置きます。ピペットチップで細胞に触れないように注意しながら培養液を吸引し、その後、冷PBSをゆっくりと加えます。

PBSを吸引し、冷やしたFDA/PI、またはFDA/PI Hoechst作業溶液を加えます。プレートを氷上に5分間置きます。次に、FDA/PIまたはFDA/PI/Hoechst作業溶液を吸引した後、各ウェルに冷PBSを加えます。

蛍光顕微鏡が正しくセットアップされていることを確認します。露光時間を100〜300ミリ秒、アナログゲインを2.8倍に設定し、FDA、PI、Hoechstの蛍光発光をそれぞれ520、620、460ナノメートルで検出します。蛍光画像の収集後、位相差モードを用いて通常光下で撮影します。

FDA/PI二重染色では、グラフィック編集ソフトを用いて、FDA陽性層をPI陽性層の上にドラッグして細胞画像を重ね合わせます。レイヤーパネルの不透明度フィールドに50%と入力し、FDA陽性層の不透明度を調整します。レイヤーメニューを開き、[可視統合]ボタンをクリックして2つのレイヤーを結合します。

「イメージ」、「調整」、「明るさ/コントラスト」にある「コントラスト」フィールドに50を入力し、オーバーレイ画像のコントラストを設定します。オーバーレイ画像にFDAおよびPIの二重陽性細胞が存在しないことを確認してください。FDA/PI/Hoechstの三重染色では、再度FDA陽性レイヤーをPI陽性レイヤー上にドラッグして細胞画像をオーバーレイし、FDA陽性レイヤーの不透明度を調整して、前述と同様に画像を統合します。

次に、Hoechst陽性レイヤーを統合レイヤー上にドラッグします。レイヤーパネルの不透明度フィールドに50%と入力してHoechst陽性レイヤーの不透明度を調整し、レイヤーメニューを開いて「可視レイヤーを統合」ボタンをクリックして2つのレイヤーを統合します。蛍光モードで撮影した画像と位相差モードで撮影した画像を比較することで、大型で不規則な形状のグリア細胞と小脳顆粒細胞を視覚的に区別します。

以下の画像は、CGN培養物の中に小型のニューロンと大型で不規則な形状のグリア細胞の両方が存在していることを示しています。この画像は、in vitroで8日目のCGN培養物におけるGAP-43アミノ染色を示しています。青色の矢印はニューロンを示しています。

ここでは、グリア細胞のGFAPアミノ染色を示します。白色の矢印はグリア細胞を示しています。この位相差顕微鏡像は、細胞の形態を示しています。

グリア細胞とニューロンを区別できるFDA/PI共染色は、CGN培養におけるニューロンの生存率を正確に評価する上で有用です。これは、通常の増殖培地で培養し、3色染色のを施した細胞の統合画像です。矢印は典型的なグリア細胞を示しています。

ここでは、同様の培養細胞を低カリウム含有培地で処理しており、矢印は再び典型的なグリア細胞を示しています。また、プロピジウムヨードによる赤色の染色の外観にも注目してください。この手法を習得し、適切に実施すれば、2時間で完了させることができます。

同様の戦略を、一次皮質培養や一次海馬培養などの他の混合細胞培養に適用することで、ニューロンの生存率を正確に分析することが可能です。