小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価

この手順の全体的な目標は、小脳顆粒ニューロン培養における細胞生存率を正確に測定することです。この方法は、神経科学および神経薬理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、MISTA細胞培養において、不要なグリア細胞とニューロンを区別できることです。

手順を実演するのは、Lin Jiajia、Wang Jialing、Xu Dilin、私の研究室の3人の学部生です。最初にハサミを大孔に挿入し、頭蓋骨の両側を耳から目まで切開することにより、生後8日のラットの子犬の頭の解剖を開始します。次に、鉗子を使用して頭蓋骨を持ち上げます。

鉗子を使用して小脳を分離し、解剖液が入った35ミリメートルの皿に入れます。プレートを解剖顕微鏡のステージに移し、2対の鉗子を使用して髄膜と血管を切除します。ブレードを使用して組織を切り刻み、30ミリリットルの解剖液が入った遠心チューブに組織を移します。

室温で1,500 x gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを保存します。次に、ペレットにトリプシン溶液を加え、穏やかに振って再懸濁します。

次に、チューブを摂氏37度のウォーターバスに15分間入れます。15分後、DNase One、大豆トリプシン阻害剤、硫酸マグネシウムの溶液を加えて振とうします。次に、室温で1,500 x gで5分間遠心分離します。

上清を吸引した後、ペレットを希薄でないDNase One、大豆トリプシン阻害剤、および硫酸マグネシウム溶液に再懸濁します。.次に、15ミリリットルのチューブを2本用意します。細胞の半分を各チューブに入れ、綿目に入ったパスツールピペットを使用して60〜70回上下にピペットで動かし、細胞を均質化します。

均質化後、3ミリリットルの硫酸マグネシウムと塩化カルシウム溶液を各15ミリリットルのチューブに加えます。チューブを室温で10分間放置します。時間が経過したら、綿栓付きのパスツールピペットで上清を慎重に取り除き、新しい15ミリリットルのチューブに移します。

室温で5分間遠心分離し、1,500 x g.ペレットに培地を加えて、1ミリリットルあたり6番目の細胞に約1.5 x 10の細胞密度に希釈します。細胞を6ウェルプレートにピペットで移し、インキュベーター内で摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。

24時間後、プレートをインキュベーターに戻す前に、AraCストック溶液を最終濃度1ミリモルまで追加してグリア細胞の増殖を阻害します。次に、7日目に、D-グルコースストック溶液に50マイクロリットルを加えて、最終濃度を1ミリモルにします。染色を開始するには、フルオレセインジアセテートを最終濃度10マイクログラム/ミリリットルに混合し、ヨウ化プロピジウムを最終濃度50マイクログラム/ミリリットルと10ミリリットルのPBSに混合します。

FDA/PI溶液をボルテックスで混合し、氷上に置きます。培養プレートを氷の上に置きます。ピペットチップで細胞に触れないように培地を慎重に吸引し、冷たいPBSをゆっくりと加えます。

PBSを吸引し、次に冷たいFDA / PIまたはFDA / PI Hoechst作業溶液を追加します。プレートを氷の上に5分間置きます。次に、FDA/PIまたはFDA/PI/Hoechst作業溶液を吸引した後、各ウェルに冷たPBSを加えます。

蛍光顕微鏡が正しくセットアップされていることを確認してください。FDA、PI、Hoechstの蛍光発光を、100〜300ミリ秒の露光時間と2.8 xのアナログゲインを使用して、それぞれ520ナノメートル、620ナノメートル、460ナノメートルで検出します。蛍光画像を採取した後、位相差モードを用いて常光下で画像を撮影します。

FDA/PI二重染色の場合は、グラフィック編集ソフトウェアでFDA陽性層をPI陽性層の上にドラッグして、細胞の画像を重ね合わせます。FDAの正のレイヤーの不透明度を調整するには、レイヤーパネルの不透明度フィールドに50%と入力します。2つのレイヤーをマージするには、[レイヤー]メニューを開き、[表示をマージ]ボタンをクリックします。

オーバーレイ画像のコントラストを設定するには、画像、調整、明るさ/コントラストのコントラストフィールドに50を入力します。オーバーレイ画像にFDAとPIのダブルポジティブセルがないことを確認します。FDA/PI/Hoechstの三重染色では、FDA陽性層をPI陽性層に再度ドラッグし、FDA陽性層の不透明度を調整し、前回と同様に画像を合成して、細胞の画像を重ね合わせます。

次に、結合されたレイヤーにHoechstの正のレイヤーをドラッグします。Hoechstの正のレイヤーの不透明度を調整するには、レイヤーパネルの不透明度フィールドに50%と入力し、レイヤーメニューを開いて2つのレイヤーをマージし、表示をマージボタンをクリックします。蛍光モードで撮影された画像と位相コントラストモードで撮影された画像を比較することにより、大きくて不規則なグリア細胞と小脳顆粒ニューロンを視覚的に区別します。

次の図は、小さなニューロンと大きくて不規則なグリア細胞の両方がCGN培養に存在することを示しています。この画像は、in vitroで8日間経過したCGN培養物のGAP-43アミノ染色を示しています。青い矢印はニューロンを示しています。

ここでは、グリア細胞のGFAPアミノ染色を示します。白い矢印はグリア細胞を示しています。この位相差画像は、細胞の形態を示しています。

グリア細胞とニューロンを区別できるFDA/PIフック染色は、CGN培養におけるニューロン生存率の正確な評価に有利です。これは、正常な増殖培地で増殖したトリプル染色細胞の結合画像です。矢印は典型的なグリア細胞を示しています。

ここでは、同様の培養物を低カリウムを含有する培地で処理しており、矢印は再び典型的なグリア細胞を示している。また、赤いヨウ化プロピジウム染色の外観にも注意してください。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。

同様の戦略を、初代皮質培養物や初代海馬培養などの他の混合細胞培養物に適用して、ニューロンの生存率を正確に解析することができます。