小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価
2017年5月10日
このプロトコルは、神経科学および神経薬理学研究のインビトロモデルとして使用される初代ニューロン培養物である培養小脳顆粒ニューロンにおけるフルオレセインジアセテート（FDA）およびヨウ化プロピジウム（PI）二重染色を使用してニューロン生存度を正確に測定する方法を記載する。
この手順の全体的な目標は、小脳顆粒ニューロン培養における細胞生存率を正確に測定することです。この方法は、神経科学および神経薬理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、MISTA細胞培養において、不要なグリア細胞とニューロンを区別できることです。
手順を実演するのは、Lin Jiajia、Wang Jialing、Xu Dilin、私の研究室の3人の学部生です。最初にハサミを大孔に挿入し、頭蓋骨の両側を耳から目まで切開することにより、生後8日のラットの子犬の頭の解剖を開始します。次に、鉗子を使用して頭蓋骨を持ち上げます。
鉗子を使用して小脳を分離し、解剖液が入った35ミリメートルの皿に入れます。プレートを解剖顕微鏡のステージに移し、2対の鉗子を使用して髄膜と血管を切除します。ブレードを使用して組織を切り刻み、30ミリリットルの解剖液が入った遠心チューブに組織を移します。
室温で1,500 x gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを保存します。次に、ペレットにトリプシン溶液を加え、穏やかに振って再懸濁します。
次に、チューブを摂氏37度のウォーターバスに15分間入れます。15分後、DNase One、大豆トリプシン阻害剤、硫酸マグネシウムの溶液を加えて振とうします。次に、室温で1,500 x gで5分間遠心分離します。
上清を吸引した後、ペレットを希薄でないDNase One、大豆トリプシン阻害剤、および硫酸マグネシウム溶液に再懸濁します。.次に、15ミリリットルのチューブを2本用意します。細胞の半分を各チューブに入れ、綿目に入ったパスツールピペットを使用して60〜70回上下にピペットで動かし、細胞を均質化します。
均質化後、3ミリリットルの硫酸マグネシウムと塩化カルシウム溶液を各15ミリリットルのチューブに加えます。チューブを室温で10分間放置します。時間が経過したら、綿栓付きのパスツールピペットで上清を慎重に取り除き、新しい15ミリリットルのチューブに移します。
室温で5分間遠心分離し、1,500 x g.ペレットに培地を加えて、1ミリリットルあたり6番目の細胞に約1.5 x 10の細胞密度に希釈します。細胞を6ウェルプレートにピペットで移し、インキュベーター内で摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。
24時間後、プレートをインキュベーターに戻す前に、AraCストック溶液を最終濃度1ミリモルまで追加してグリア細胞の増殖を阻害します。次に、7日目に、D-グルコースストック溶液に50マイクロリットルを加えて、最終濃度を1ミリモルにします。染色を開始するには、フルオレセインジアセテートを最終濃度10マイクログラム/ミリリットルに混合し、ヨウ化プロピジウムを最終濃度50マイクログラム/ミリリットルと10ミリリットルのPBSに混合します。
FDA/PI溶液をボルテックスで混合し、氷上に置きます。培養プレートを氷の上に置きます。ピペットチップで細胞に触れないように培地を慎重に吸引し、冷たいPBSをゆっくりと加えます。
PBSを吸引し、次に冷たいFDA / PIまたはFDA / PI Hoechst作業溶液を追加します。プレートを氷の上に5分間置きます。次に、FDA/PIまたはFDA/PI/Hoechst作業溶液を吸引した後、各ウェルに冷たPBSを加えます。
蛍光顕微鏡が正しくセットアップされていることを確認してください。FDA、PI、Hoechstの蛍光発光を、100〜300ミリ秒の露光時間と2.8 xのアナログゲインを使用して、それぞれ520ナノメートル、620ナノメートル、460ナノメートルで検出します。蛍光画像を採取した後、位相差モードを用いて常光下で画像を撮影します。
FDA/PI二重染色の場合は、グラフィック編集ソフトウェアでFDA陽性層をPI陽性層の上にドラッグして、細胞の画像を重ね合わせます。FDAの正のレイヤーの不透明度を調整するには、レイヤーパネルの不透明度フィールドに50%と入力します。2つのレイヤーをマージするには、[レイヤー]メニューを開き、[表示をマージ]ボタンをクリックします。
オーバーレイ画像のコントラストを設定するには、画像、調整、明るさ/コントラストのコントラストフィールドに50を入力します。オーバーレイ画像にFDAとPIのダブルポジティブセルがないことを確認します。FDA/PI/Hoechstの三重染色では、FDA陽性層をPI陽性層に再度ドラッグし、FDA陽性層の不透明度を調整し、前回と同様に画像を合成して、細胞の画像を重ね合わせます。
次に、結合されたレイヤーにHoechstの正のレイヤーをドラッグします。Hoechstの正のレイヤーの不透明度を調整するには、レイヤーパネルの不透明度フィールドに50%と入力し、レイヤーメニューを開いて2つのレイヤーをマージし、表示をマージボタンをクリックします。蛍光モードで撮影された画像と位相コントラストモードで撮影された画像を比較することにより、大きくて不規則なグリア細胞と小脳顆粒ニューロンを視覚的に区別します。
次の図は、小さなニューロンと大きくて不規則なグリア細胞の両方がCGN培養に存在することを示しています。この画像は、in vitroで8日間経過したCGN培養物のGAP-43アミノ染色を示しています。青い矢印はニューロンを示しています。
ここでは、グリア細胞のGFAPアミノ染色を示します。白い矢印はグリア細胞を示しています。この位相差画像は、細胞の形態を示しています。
グリア細胞とニューロンを区別できるFDA/PIフック染色は、CGN培養におけるニューロン生存率の正確な評価に有利です。これは、正常な増殖培地で増殖したトリプル染色細胞の結合画像です。矢印は典型的なグリア細胞を示しています。
ここでは、同様の培養物を低カリウムを含有する培地で処理しており、矢印は再び典型的なグリア細胞を示している。また、赤いヨウ化プロピジウム染色の外観にも注意してください。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。
同様の戦略を、初代皮質培養物や初代海馬培養などの他の混合細胞培養物に適用して、ニューロンの生存率を正確に解析することができます。
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概要
本プロトコルでは、フルオレセインジアセテート（FDA）およびプロピジウムイオダイド（PI）による二重染色を用いて、培養した小脳顆粒ニューロンの生存率を正確に測定する方法について説明します。この手法は、MISTA細胞培養においてニューロンをグリア細胞から区別するために不可欠です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 神経薬理学
- 細胞生物学
背景
- 小脳顆粒細胞は、研究で用いられる主要な神経細胞培養系である。
- 細胞生存率の正確な測定は、神経科学研究において極めて重要である。
- フルオレセインジアセテートおよびプロピジウムヨードは、一般的な生存率染色剤である。
- 本手法により、神経細胞とグリア細胞の区別が可能となる。
研究目的
- ニューロンの生存率を測定するための信頼性の高いプロトコルを提供すること。
- 神経薬理学および神経科学の研究を促進すること。
- 実験的環境における細胞培養への理解を深めること。
使用した手法
- 小脳顆粒ニューロンを得るための生後8日齢のラット仔の解剖。
- 生細胞染色のためのフルオレセインジアセテート（FDA）の適用。
- 死細胞を染色するためのプロピジウムヨード（PI）の使用。
- 生存率を評価するための染色細胞の解析。
主要な結果
- 生存ニューロンと死細胞の正常な判別。
- 学部生によるプロトコルの実演。
- さまざまな神経科学的応用における本手法の妥当性の検証。
- 培養ニューロンにおける細胞生存率への理解の深化。
結論
- FDAおよびPI染色法は、神経細胞の生存率を評価するのに有効です。
- 本プロトコルは、今後の神経科学および神経薬理学研究に役立ちます。
- 正確な生存率評価は、実験の完全性を維持するために極めて重要です。
よくある質問
業界における実用的意義
混合グリア・ニューロン共培養におけるニューロンの生存能を正確に評価することは、信頼性の高い神経薬理学スクリーニングおよびターゲットバリデーションにとって極めて重要です。本手法は、ニューロン特異的なリードアウトを可能にし、グリア細胞の混入による偽シグナルを低減することで、予測の信頼性を向上させます。これにより、小脳および関連ニューロンモデルを用いた化合物スクリーニングにおいて、スケールアップ可能で再現性のある生存能指標を提供し、初期段階の創薬意思決定を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： グリア細胞による干渉から神経細胞の生存シグナルを分離することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： プライマリーカルチャーにおける神経細胞の生存／死別の判別について、標準化された蛍光ベースの読み出し手段を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物スクリーニングの高コンテンツイメージングワークフローに適合する、定量的な生存率データを生成する。
- 運用上の価値： 定義された染色プロトコルと蛍光顕微鏡の設定により、アッセイの再現性をサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：混合培養におけるニューロン特異的な生存率測定を可能にすることで、疾患関連系の忠実度を高めます。
- 実用的価値：皮質、海馬、および小脳モデル間で転用可能な生存率評価により、発見から前臨床検証までの連続性を実現します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のニューロンモデルの調製から化合物誘導性の生存率評価に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、リード化合物の同定および前臨床段階でのトリアージを支援します。
- 探索生物学：混合グリア・ニューロン培養におけるニューロンの応答を単離することにより、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：化合物がニューロンの生存に及ぼす影響を評価するための、アッセイにそのまま利用可能な再現性の高い生存率出力を提供します。
- 分析：マルチプレックス蛍光読み取り（FDA、PI、Hoechst）により、異なる条件下での生存率の定量的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連モデルにおいて、生存率評価がグリアではなくニューロンの生物学的特性を反映することを保証し、前臨床研究へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：複数の初代ニューロン培養システムに適用可能な、再利用可能な生存率プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：生存率アッセイにおけるグリア細胞混入によるメカニズム上の曖昧さを排除し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：細胞調製、染色、およびイメージングパラメータを明確に定義することで、標準化とスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値：ニューロン特異的な生存率データを提供することで、偽の神経毒性シグナルによる後段階での脱落を減らし、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：正確なニューロン生存率プロファイルに基づいた、リスク調整後の化合物の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 初代神経細胞培養の解離および蛍光顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- FDA (520 nm)、PI (620 nm)、およびHoechst (460 nm) に適したフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡へのアクセスが必須となります。
- 染色のタイミング、抗体の取り扱い、および画像解析プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 小脳顆粒細胞以外の他の神経細胞培養タイプに適用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 実用上の制限として、毒性や信号の飽和を避けるために、染色の時間と濃度の慎重な最適化が必要であることが挙げられます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
8:19
Conclusion
7:08
Results: Double and Triple Stainings in CGN Culture
0:46
Tissue Harvest from 8 Day Old Sprague-Dawley Rats
3:51
FDA-PI Double Staining and FDA-PI-Hoechst Triple Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture
5:30
Assessment of Neuronal Viability
