体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング
2017年8月7日
このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。
この粘膜内層液サンプリング法の全体的な目標は、刺激手順を必要とせずに気道の局所免疫シグネチャを研究することです。この方法により、感染症、喘息、アレルギーなどの小児呼吸器疾患の分野における重要な問題を研究することができます。この方法の利点は、in vivoで刺激を受けていない気道粘膜の免疫メディエーターのレベルが非常に低いことを測定できることです。
手順のデモンストレーションは、Dr.Wolskによって行われます。新生児サンプルを採取するには、まず、繊維状のヒドロキシル化ポリエステルフィルターシートから少なくとも2つの3×15mmのストリップをカットします。次に、新生児をベッドに寝かせ、気道感染症の症状に注意してください。
次に、鉗子を使用して、乳児の各鼻孔の下鼻甲介の前部に約1センチメートルの濾紙を挿入し、必要に応じて新生児に砂糖水を投与して快適にします。サンプリング期間中に発生するくしゃみ、しつこい泣き声、鼻出血に注意してください。2分間の吸収後、濾紙をラベル付きチューブに移し、マイナス80°Cですぐに保管します。
実験手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLisbeth Rosholmです。気道免疫メディエーターの定量には、マイナス80°Cの貯蔵から最大10個のサンプルを氷上に配置し、それらの識別番号を記録します。サンプルが融解したら、被験者ごとに両方の濾紙を濾紙あたり150マイクロリットルの新たに調製された緩衝液に浸し、緩衝液ストック溶液25ミリリットルあたり1つの完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤を補充します。
サンプルを400rpmのプレートシェーカーに5分間移します。バッファーとフィルターペーパーを個々のセルロースアセテートチューブフィルターのカップに移します。サンプルを遠心分離して、マイクロ遠心チューブの底にあるろ過された鼻抽出物を収集します。
次に、カップを取り外し、チューブを氷の上に置きます。次に、鼻抽出物の150マイクロリットルアリコートを低タンパク質結合保存プレートの個々のウェルに移し、分析までプレートを摂氏マイナス80度で保存します。次に、標準的なアッセイプロトコルに従って、高感度電気化学発光ベースのマルチプレックスアレイにより、目的の鼻免疫メディエーターの濃度を測定します。
この代表的な620人の新生児の解析では、測定された免疫メディエーターのほとんどが検出レベルが低いことを示しました。IFNガンマレベルは、サンプルのほぼ半数で検出下限を下回っていましたが、TNFアルファ、CCL4、およびTGFベータレベルは、サンプルの1%未満で検出下限を下回っていました。ヒートマップで示されているように、検出された20のメディエーターレベルでは、強い多重共線性が明らかでした。
無症候性のピコルナウイルスに感染した新生児では、主に1型免疫メディエーターが損なわれたアップレギュレーションプロファイルが観察され、生命の最も早い時期に細菌やウイルスにコロニーを形成する免疫誘発の役割が示唆されました。出生時の同居家族の存在と、特定の1型17型指向性粘膜免疫応答との関連も決定され、この現象と、最後の出産からの時間に逆相関する子宮内免疫プライミング効果との相関の証拠が示されました。さらに、高用量のサプリメントを投与された母親から生まれた子供は、プラセボサプリメントと比較して、特定の免疫メディエーターのアップレギュレーションによって特徴付けられ、ビタミンDがウイルス、細菌、兄弟姉妹、または母親のアトピーによって誘発される免疫応答とは無関係に抗菌免疫応答を促進することが示唆されました。
このマイクロサンプリングの方法は、気管支鏡を介しても使用することができ、下気道の免疫メディエーターを研究することができます。このビデオを見た後、新生児や年長の子供のin vivoで刺激を受けていない気道粘膜のメディエーターを測定する方法についてよく理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、上気道から非侵襲的に、攪乱されていない粘膜ライニング液を採取する手法について説明します。これにより、あらゆる年齢層の被験者を対象に、サイトカインやケモカインなどのタンパク質メディエーターのin vivoレベルを定量化することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 呼吸器疾患
- 免疫学
- 小児科学
背景
- この手法では、刺激処置を行わずに気道の局所的な免疫シグネチャーを解析します。
- 感染症、喘息、アレルギーなどの小児呼吸器疾患に適用可能です。
- 本技術により、in vivo の非刺激気道粘膜における低濃度の免疫メディエーターの測定が可能になります。
- 処置のデモンストレーションは Wolsk 博士によって行われます。
研究目的
- 気道粘膜における免疫応答を調査すること。
- 小児の呼吸器疾患に関する知見を提供すること。
- 研究のための非侵襲的なサンプリング技術を促進すること。
使用方法
- 上気道からの粘膜ライニング液の採取。
- サンプル採取のための繊維状水酸化ポリエステルフィルターシートの使用。
- 新生児における気道感染症状の観察。
- 採取したサンプル中のサイトカインおよびケモキンの定量。
主な結果
- 侵襲的な処置を行うことなく、粘膜ライニング液を効率的に採取できる。
- 生体内で免疫媒介物質を測定することが可能である。
- 小児患者の免疫プロファイルに関する知見が得られる。
- 呼吸器疾患の理解における潜在的な応用が期待される。
結論
- 非侵襲的なサンプリング方法は、気道免疫の研究に有効です。
- この手法は、小児の呼吸器健康に関する研究を促進させることができます。
- 今後の研究により、免疫介在物質に関する知見がさらに拡大することが期待されます。
よくある質問
業界における実用的な重要性
この非侵襲的な粘膜裏層液サンプリング法により、刺激を加えることなく上気道粘膜内のin vivo免疫メディエーターを直接定量することが可能となり、気道免疫活性の生理学的に妥当なアウトカムを得ることができます。本手法は、生後早期の免疫プロファイリングおよび縦断的モニタリングを可能にし、遺伝的および環境的曝露を免疫表現型に関連付けることで、呼吸器治療開発におけるメカニズム面のデリスキングを促進します。新生児および小児コホートへの適用は、特に喘息、アレルギー、および感染症の文脈において、エンドタイピングや疾患進行のモニタリングに対する予測価値を提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 非刺激の粘膜組織において免疫介在物質のベースラインレベルおよび誘導レベルを測定することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 小児集団における機能的ターゲットバリデーションのための、再現性があり低侵襲なマトリックスを提供する。
- 予測的価値： 無症候性ウイルス感染や兄弟からの曝露影響などの臨床的表現型と介在物質プロファイルの相関を通じて、生物学的リスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：定量的な免疫プロファイリングのための高感度電気化学発光マルチプレックスアレイに適合する、溶出タンパク質サンプルを生成します。
- 標準化：一貫したフィルターペーパー吸収および溶出プロトコルを使用し、被験者間および時点間で分析物の再現性のある回収を保証します。
- 拡張性：大規模な新生児コホート（n=620）における実現可能性が実証されており、疫学的研究および介入研究におけるハイスループットスクリーニングへの応用をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的連続性： 出生から小児期までの中長期的なサンプリングを可能にし、初期の免疫シグネチャーと後の呼吸器疾患の転帰を関連付ける。
- バイオマーカーの整合性： 無症状のピコルナウイルス感染新生児におけるタイプ1およびタイプ17免疫メディエーターの上昇を検出し、免疫エンドタイプの特定における有用性を示唆する。
- メカニズムによるリスク低減： 母親へのビタミンD補充と抗菌免疫応答との関連を明らかにし、免疫調節介入のターゲット優先順位付けを支持する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、in vivoでの免疫メディエーターの直接測定を可能にすることで、リード化合物の同定前にターゲットの選択および経路の解明を導き、ディスカバリーバイオロジー段階に適合します。
- 探索生物学：ex vivoでの操作や刺激によるアーティファクトを伴わずに、粘膜組織における免疫経路の活性化に関する仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：マルチプレックス免疫測定法の読み取りに適した標準化された溶出液を生成し、治療群または曝露群間での比較分析を容易にします。
- 分析学：定量的メディエーターレベルを算出することで、共線性、免疫ネットワーク活性、および表現型との関連性の統計的評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：新生児の免疫プロファイルと、小児期の呼吸器症状および環境曝露を関連付け、リスク層別化に基づいた進展判断を支援します。
- 企業的な再利用：呼吸器疾患モデルや治療法全般に適用可能な、プラットフォーム互換性のあるサンプリング技術を提示しています。
運用および企業への影響
- 科学的価値：天然の粘膜微小環境における内因性免疫活性を捉えることで、標的バリデーションに対する予測的な信頼性を提供する。
- 運用的価値：標準化された回収、溶出、および保存手順により再現性を確保し、分析前変動を最小限に抑える。
- 戦略的価値：免疫調節メカニズムを初期の免疫シグネチャーに結びつけることで、go/no-go決定を改善し、呼吸器系プログラムにおける後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：適切かつ縦断的なヒトモデルにおける粘膜免疫経路への実証された影響に基づき、リスク調整済みの候補優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 被験者の快適性とサンプルの完全性を確保するため、新生児の気道解剖学および緩やかなサンプリング技術に関するトレーニングが必要です。
- 分析物の検出には、ウルトラフィルターチューブ、プレートシェーカー、および電気化学発光免疫測定法のインフラへのアクセスが必要です。
- 抽出中のメディエーターの分解を防ぐため、プロテアーゼ阻害剤を含む標準化されたバッファー調製が必要です。
- 年長の子供や他の粘膜部位に適用する場合、サンプリング時間またはフィルターサイズの調整が必要です。
- 分析物の含有量に制限があり、一部のメディエーターは検出限界以下になることが多いため、低発現ターゲットに対するアッセイ感度の最適化が必要です。
