体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。

この粘膜内層液サンプリング法の全体的な目標は、刺激手順を必要とせずに気道の局所免疫シグネチャを研究することです。この方法により、感染症、喘息、アレルギーなどの小児呼吸器疾患の分野における重要な問題を研究することができます。この方法の利点は、in vivoで刺激を受けていない気道粘膜の免疫メディエーターのレベルが非常に低いことを測定できることです。

手順のデモンストレーションは、Dr.Wolskによって行われます。新生児サンプルを採取するには、まず、繊維状のヒドロキシル化ポリエステルフィルターシートから少なくとも2つの3×15mmのストリップをカットします。次に、新生児をベッドに寝かせ、気道感染症の症状に注意してください。

次に、鉗子を使用して、乳児の各鼻孔の下鼻甲介の前部に約1センチメートルの濾紙を挿入し、必要に応じて新生児に砂糖水を投与して快適にします。サンプリング期間中に発生するくしゃみ、しつこい泣き声、鼻出血に注意してください。2分間の吸収後、濾紙をラベル付きチューブに移し、マイナス80°Cですぐに保管します。

実験手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLisbeth Rosholmです。気道免疫メディエーターの定量には、マイナス80°Cの貯蔵から最大10個のサンプルを氷上に配置し、それらの識別番号を記録します。サンプルが融解したら、被験者ごとに両方の濾紙を濾紙あたり150マイクロリットルの新たに調製された緩衝液に浸し、緩衝液ストック溶液25ミリリットルあたり1つの完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤を補充します。

サンプルを400rpmのプレートシェーカーに5分間移します。バッファーとフィルターペーパーを個々のセルロースアセテートチューブフィルターのカップに移します。サンプルを遠心分離して、マイクロ遠心チューブの底にあるろ過された鼻抽出物を収集します。

次に、カップを取り外し、チューブを氷の上に置きます。次に、鼻抽出物の150マイクロリットルアリコートを低タンパク質結合保存プレートの個々のウェルに移し、分析までプレートを摂氏マイナス80度で保存します。次に、標準的なアッセイプロトコルに従って、高感度電気化学発光ベースのマルチプレックスアレイにより、目的の鼻免疫メディエーターの濃度を測定します。

この代表的な620人の新生児の解析では、測定された免疫メディエーターのほとんどが検出レベルが低いことを示しました。IFNガンマレベルは、サンプルのほぼ半数で検出下限を下回っていましたが、TNFアルファ、CCL4、およびTGFベータレベルは、サンプルの1%未満で検出下限を下回っていました。ヒートマップで示されているように、検出された20のメディエーターレベルでは、強い多重共線性が明らかでした。

無症候性のピコルナウイルスに感染した新生児では、主に1型免疫メディエーターが損なわれたアップレギュレーションプロファイルが観察され、生命の最も早い時期に細菌やウイルスにコロニーを形成する免疫誘発の役割が示唆されました。出生時の同居家族の存在と、特定の1型17型指向性粘膜免疫応答との関連も決定され、この現象と、最後の出産からの時間に逆相関する子宮内免疫プライミング効果との相関の証拠が示されました。さらに、高用量のサプリメントを投与された母親から生まれた子供は、プラセボサプリメントと比較して、特定の免疫メディエーターのアップレギュレーションによって特徴付けられ、ビタミンDがウイルス、細菌、兄弟姉妹、または母親のアトピーによって誘発される免疫応答とは無関係に抗菌免疫応答を促進することが示唆されました。

このマイクロサンプリングの方法は、気管支鏡を介しても使用することができ、下気道の免疫メディエーターを研究することができます。このビデオを見た後、新生児や年長の子供のin vivoで刺激を受けていない気道粘膜のメディエーターを測定する方法についてよく理解できるはずです。