体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング
2017年8月7日
このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。
この粘膜内層液サンプリング法の全体的な目標は、刺激手順を必要とせずに気道の局所免疫シグネチャを研究することです。この方法により、感染症、喘息、アレルギーなどの小児呼吸器疾患の分野における重要な問題を研究することができます。この方法の利点は、in vivoで刺激を受けていない気道粘膜の免疫メディエーターのレベルが非常に低いことを測定できることです。
手順のデモンストレーションは、Dr.Wolskによって行われます。新生児サンプルを採取するには、まず、繊維状のヒドロキシル化ポリエステルフィルターシートから少なくとも2つの3×15mmのストリップをカットします。次に、新生児をベッドに寝かせ、気道感染症の症状に注意してください。
次に、鉗子を使用して、乳児の各鼻孔の下鼻甲介の前部に約1センチメートルの濾紙を挿入し、必要に応じて新生児に砂糖水を投与して快適にします。サンプリング期間中に発生するくしゃみ、しつこい泣き声、鼻出血に注意してください。2分間の吸収後、濾紙をラベル付きチューブに移し、マイナス80°Cですぐに保管します。
実験手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLisbeth Rosholmです。気道免疫メディエーターの定量には、マイナス80°Cの貯蔵から最大10個のサンプルを氷上に配置し、それらの識別番号を記録します。サンプルが融解したら、被験者ごとに両方の濾紙を濾紙あたり150マイクロリットルの新たに調製された緩衝液に浸し、緩衝液ストック溶液25ミリリットルあたり1つの完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤を補充します。
サンプルを400rpmのプレートシェーカーに5分間移します。バッファーとフィルターペーパーを個々のセルロースアセテートチューブフィルターのカップに移します。サンプルを遠心分離して、マイクロ遠心チューブの底にあるろ過された鼻抽出物を収集します。
次に、カップを取り外し、チューブを氷の上に置きます。次に、鼻抽出物の150マイクロリットルアリコートを低タンパク質結合保存プレートの個々のウェルに移し、分析までプレートを摂氏マイナス80度で保存します。次に、標準的なアッセイプロトコルに従って、高感度電気化学発光ベースのマルチプレックスアレイにより、目的の鼻免疫メディエーターの濃度を測定します。
この代表的な620人の新生児の解析では、測定された免疫メディエーターのほとんどが検出レベルが低いことを示しました。IFNガンマレベルは、サンプルのほぼ半数で検出下限を下回っていましたが、TNFアルファ、CCL4、およびTGFベータレベルは、サンプルの1%未満で検出下限を下回っていました。ヒートマップで示されているように、検出された20のメディエーターレベルでは、強い多重共線性が明らかでした。
無症候性のピコルナウイルスに感染した新生児では、主に1型免疫メディエーターが損なわれたアップレギュレーションプロファイルが観察され、生命の最も早い時期に細菌やウイルスにコロニーを形成する免疫誘発の役割が示唆されました。出生時の同居家族の存在と、特定の1型17型指向性粘膜免疫応答との関連も決定され、この現象と、最後の出産からの時間に逆相関する子宮内免疫プライミング効果との相関の証拠が示されました。さらに、高用量のサプリメントを投与された母親から生まれた子供は、プラセボサプリメントと比較して、特定の免疫メディエーターのアップレギュレーションによって特徴付けられ、ビタミンDがウイルス、細菌、兄弟姉妹、または母親のアトピーによって誘発される免疫応答とは無関係に抗菌免疫応答を促進することが示唆されました。
このマイクロサンプリングの方法は、気管支鏡を介しても使用することができ、下気道の免疫メディエーターを研究することができます。このビデオを見た後、新生児や年長の子供のin vivoで刺激を受けていない気道粘膜のメディエーターを測定する方法についてよく理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、上気道からの未撹乱粘膜内腔液のサンプリングを行う非侵襲的技術を記述しています。あらゆる年齢の被験者のin vivoにおけるタンパク質メディエーター（サイトカインやケモカインなど）の定量化を可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 呼吸器疾患
- 免疫学
- 小児科
背景
- この方法は、刺激手順なしで気道の局所免疫シグネチャを研究します。
- 感染症、喘息、アレルギーなどの小児呼吸器疾患に適用可能です。
- この技術により、in vivoでの刺激されていない気道粘膜の低レベルの免疫メディエーターを測定できます。
- この手順のデモンストレーションはDr. Wolskによって行われます。
研究目的
- 気道粘膜の免疫応答を調査すること。
- 小児呼吸器疾患に関する洞察を提供すること。
- 研究のための非侵襲的サンプリング技術を促進すること。
使用方法
- 上気道からの粘膜内腔液の収集。
- サンプル収集のための繊維状のヒドロキシル化ポリエステルフィルターシートの使用。
- 新生児の気道感染症状の観察。
- 収集したサンプルにおけるサイトカインとケモカインの定量化。
主な結果
- 侵襲的手順なしでの粘膜内腔液の成功的な収集。
- in vivoでの免疫メディエーター測定の能力。
- 小児患者の免疫プロファイルの洞察。
- 呼吸器疾患理解における潜在的な応用。
結論
- この非侵襲的サンプリング方法は気道免疫を研究するのに効果的です。
- この技術は小児呼吸器健康研究を強化できます。
- 将来の研究では免疫メディエーターに関連する知見を拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
