鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング

今日は、合成吸収マトリックスを使用して粘膜内層液を吸収する精密粘膜サンプリングの一種であるナソソレーションの技術を実演します。nasosorption samplerは、滅菌クライオチューブ内のハンドルとSAMで構成されています。SAMは、繊維または発泡体のいずれかのポリマーで構成され、柔らかく吸収性があり、サンプル収集のための迅速なウィッキングを備えたように特別に選択されています。

また、SAMはタンパク質の結合が最小限に抑えられているため、吸収された分泌物を効率的に溶出できます。ナソソープションは、赤ちゃんを含むすべての年齢の患者に実行できる、非常に穏やかで非侵襲的な技術です。さらに、数分おきのシリアルサンプリングも可能です。

ナソソープションを実施するときは、まず手を洗い、できれば患者の前で手袋を着用する必要があります。まず、鼻腔を検査します。ヘッドトーチの使用と、臨床医が利き手ではない親指を使用して患者の鼻を引っ込め、鼻腔を視覚化することをお勧めします。

通常、鼻鏡は必要ありません。鼻腔を覗くと、鼻孔は断面が丸くなく、まっすぐ後ろ向きに進んでいます。一般的に、下鼻甲介は膨らみ、つまり鼻孔の外側壁のくぼみとして見られ、鼻中隔は滑らかで平らな内側壁を形成しています。

この下鼻甲介からサンプリングしたいのは、下にある上皮が気道の単純な繊毛上皮であるためです。サンプリング時には、鼻収吸収SAMを内腔に優しく通し、下鼻甲介に対して平らになるように向きを変えます。次に、人差し指を使用してSAMを鼻粘膜に押し付けます。

これにより、MLFが吸収されるため、目から涙が出る可能性のあるわずかなくすぐりを引き起こす可能性があります。通常、60秒の時限吸収を使用します。その後、鼻腔吸収装置を鼻孔から取り出し、クライオチューブに戻して、すぐに氷上に保存してから冷凍することができます。

あるいは、すぐにMLFの溶出に進むこともできます。ナソソープションは、さまざまな鼻粘膜チャレンジモデルやさまざまな気道疾患で研究されています。ただし、この比較的新しい方法では、他の呼吸器サンプリング方法に対する正式な検証が必要です。

気管支吸収の技術は、合成吸収マトリックスを使用して気管支の粘膜内層液をサンプリングします。この方法は、光ファイバー気管支鏡を介して専門の担当者によって行われます。気管支吸収装置は、中央にプラスチック製のガイドワイヤーを備えた外部の中空カテーテルで構成されています。

これは、ハンドピースの活性化時に押し出すことができる端にSAMを持っています。鼻吸着と同様に、SAMストリップは柔らかく吸収性があり、サンプル収集のための迅速なウィッキングを備えています。また、タンパク質の結合が最小限に抑えられているため、吸収された分泌物を効率的に溶出できます。

気管支吸収装置を気管支鏡の下に置く前に、SAMが簡単にカテーテルに押し出され、引き戻されていることを確認するのが普通です。次に、気管支鏡シミュレーターを使用して気管支収着の方法を示します。最初に標準的な気管支鏡検査が行われ、気管支鏡を気管を下って右主気管支に通し、右下葉と右中葉の分割にちょうど近位の中間気管支のレベルに到達します。

このレベルまで挿入すると、5つのステップが実行されます。1つは、カテーテルを下ろすこと。気管支鏡の手術チャネルを通じて、気管支鏡の端から最大1センチメートル遠位まで白い先端が気道に見えるまで、気管支吸収カテーテルを挿入します。

気管支鏡とカテーテルの先端を気道の内腔の中央に保ちます。カテーテルの先端と気管支粘膜との接触を最小限に抑えるように注意して、粘膜損傷のリスクを減らしてください。2つ目は、SAMアウト。

気管支吸収装置のハンドルを押し下げて、SAMストリップが右中央または右下葉気道の内腔に押し出されるようにします。直視下で、気管支鏡の先端を曲げて、SAMが気道壁の粘膜内層液に接触していることを確認します。SAMストリップを気道内に置いて、粘膜壁に対して30秒間平らにします。.

3つ、SAMで。直視下で、SAMを直接カテーテルに戻します。引っ込めるときは、湿ったSAMプローブがまっすぐであることを確認してください。

必要に応じて、カテーテルと気管支鏡の先端を戻してSAMをまっすぐにすることができます。SAMを引っ込めるのが難しい場合は、SAMを押し出して気道から戻した状態でデバイス全体を引き出します。4、カテーテルアップ。

気管支鏡の操作チャネルからカテーテル全体を引き出します。5、SAMをカットオフします。SAMは滅菌ハサミで切断し、クライオチューブに入れ、急速冷凍または直接溶出する前にすぐに氷の上に置く必要があります。

次のビデオクリップは、研究用気管支鏡検査を受けている患者の気道にSAMを押し出している様子を示しています。気管支吸収は現在、さまざまな肺疾患で研究されています。この精密な粘膜サンプリングの方法が、診断的精密検査、患者の層別化およびモニタリングに役立つことを願っています。

ナソソープションと気管支吸収後のラボ処理。合成吸収性マトリックスからの粘膜内層液の溶出。今日は、鼻収着と気管支吸収の非侵襲的粘膜サンプリング技術後の実験室サンプル処理の一般原則を実演します。

特に、合成吸収性マトリックスから粘膜内層液サンプルを溶出する方法を示します。採取時には、サンプルを氷の上に置いて実験室に輸送する必要があります。サンプルはすぐに処理することも、元のサンプルチューブで直接凍結して後で溶出することもできます。

即時処理を行う場合は、サンプルを元のサンプルチューブに入れて氷上からラボに移すことができます。または、SAMを取り外して、収集時に溶出バッファーに入れ、その後、氷上でラボに移すこともできます。サンプルは、処理前に数時間、バッファー内またはサンプルチューブ内で氷上に留まることができます。

SAMの遠心分離およびスピン溶出の前の洗浄ステップは、サンプル収量の最適化を目的としています。これを達成するために、SAMは目的の抽出バガーと一緒にエッペンドルフチューブに挿入されます。次に、サンプルをボルテックスミキサーで30秒間混合し、緩く付着した流体と生体分子のSAMを洗浄します。

完全なサンプル回収を確実にするために、洗浄に使用したのと同じエッペンドルフチューブ内のスピンインサートに湿ったSAMを追加することで、スピン溶出を行います。この手順には清潔な鉗子を使用し、汚染を防ぐためにサンプル間で交換する必要があります。この方法では、遠心分離を使用してSAMから液体を抽出します。

摂氏 4 度に冷却した遠心分離機で 16, 000 g で 20 分間サンプルを遠心分離します。使用する溶出バガーは、目的のアプリケーションによって決定されます。一般的には、タンパク質含有アミノアッセイバッファーまたはRNA溶解バッファーを使用します。

2種類のスピンフィルターが使用できます。1つ目は、SAMを所定の位置に保持するプラスチックメッシュのみを含み、流体の完全な溶出を可能にします。あるいは、感染性物質を扱う場合は、孔径が0.2μmのスピンフィルターを使用することもできます。

これらのフィルターは、感染したサンプルを除染し、微生物感染が疑われるサンプルに適しています。このようなフィルターが必要な場合は、サンプルを添加する前にタンパク質性バッファーをフィルターに浸透させるプレインキュベーションステップを含めることが重要です。このステップにより、非特異的なタンパク質吸収によるメディエーターのフィルターへの結合が最小限に抑えられます。

以下は、クラス2の病原体を含む除染ステップを必要としないサンプルのナソソープションおよび気管支吸収処理に当研究室で使用した方法の例です。ステップ1では、SAMを適切なバッファーとボルテックスを含むエッペンドルフに30秒間入れます。ナソソープションには通常300マイクロリットルのバッファーを使用し、気管支吸収には100マイクロリットルを使用します。

ステップ2では、SAMを鉗子を使用して除去し、SAMの洗浄に使用するバッファーと一緒にプラスチックメッシュフィルターカップに入れます。ステップ3では、SAMが入ったプラスチックメッシュフィルターカップを元のエッペンドルフに戻します。ステップ4では、フィルターカップ、バッファー、およびSAMを含むエッペンドルフを、摂氏4度で16, 000gで20分間遠心分離します。

遠心分離後、SAMの入ったフィルターカップを取り外して廃棄します。その後、溶出液を分注し、後で分析するために急速凍結することができます。ナソ吸着サンプリングは、多くの臨床呼吸器研究環境に適用されています。

これには、プロスタグランジンD2やインターロイキン5などの経鼻アレルゲンチャレンジ中の炎症メディエーターの測定が含まれます。これらのチャレンジモデル設定で重要なことは、ナソソープションによるサンプリングにより、メディエーターレベルの頻繁なキネティックプロファイリングが可能になり、サンプリングを数分ごとに繰り返すことができることです。ナソソープションは、健康な被験者やアレルギー性喘息患者を対象としたライノウイルス感染のチャレンジ中にも使用され、研究期間中、ナソソープションが毎日繰り返されました。

この研究でナソソープションを使用することで、ライノウイルス感染に対するインターフェロン応答の高感度な特性評価が可能になりました。最後に、細気管支炎の乳児を研究するために、ナソソープションサンプリングを使用しました。この研究では、呼吸器合胞体ウイルスによる感染は、インターフェロンガンマなどの高レベルの炎症メディエーターと関連していました。

重要なことに、ナソソープションによるサンプリングにより、乳児の研究に健康な対照群を含めることができる。気管支吸収は、健康な被験者とアレルギー性喘息患者を対象としたライノウイルスチャレンジ研究でも使用されました。この研究では、ライノウイルス感染中に下気道の炎症メディエーターであるインターフェロンガンマ、ITAC、IL-10、およびIL-5が有意に増加したことが示されました。

この手法を下気道の研究に含めると、気管支肺胞洗浄などの従来の方法では検出できない可能性のあるメディエーターのレベルを測定する可能性が生まれます。結論として、粘膜内層液は非侵襲的に取得でき、感染や炎症における炎症反応を測定するエキサイティングな可能性を秘めています。溶出方法は、サンプルの性質と測定するパラメータに応じて適合させる必要があります。

特に、MLFは、粘膜サイトカインとケモカイン、ウイルス感染、ウイルス量、細菌および真菌感染症、マイクロバイオーム、および粘膜抗体の測定に使用できます。最後に、粘膜のサンプリングおよび溶出法には、個々のプロジェクトに合わせた開発と慎重な検証が必要です。