Name: 鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶ鼻粘膜および気管支の流体吸収法。合成吸収性マトリックスを用いた非侵襲的粘膜サンプリング技術で、呼吸器疾患の診断と研究に有用です。

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この作品は組んで帝国国立研究所健康研究 (NIHR) 医学研究センター (BRC)、NIHR 健康保護研究ユニット (HPRU) ロンドン大学インペリアル カレッジで呼吸器感染症から資金によって支えられた資金。NIHR 帝国とイギリス公衆衛生 (PHE) 患者の安全トランスレーショナル ・ リサーチ センターします。見解では、これらの者とは必ずしもこれらの NHS、NIHR、保健や公衆衛生イギリス。

次のプロトコルで使用される技術は、西ロンドン研究倫理委員会 (参照数 15/ロー/0444) によって承認されています。
1. 鼻吸収 (NA)
<ol><li>
NA サンプリングする前の準備
	<ol>
<li>NA を遂行した場合まず手洗いと手袋、患者の前にできれば。</li>
		<li>頭のトーチを使用して鼻腔を検査、鼻腔内を可視化する患者さんの鼻を撤回する彼らの非利き手の親指を使用して医師。 注:鼻鏡は通常必要ありません。</li>
		<li>鼻腔と下鼻甲介サンプリングの前に可視化します。 注:鼻孔 (鼻孔) 円形断面では、彼らはまっすぐ後方に移動します。一般に、膨らみや、鼻孔の外側の壁にインデントとして下鼻甲介を見ることができる鼻中隔を形成スムーズ、フラット内側の壁。たいこの引け目からサンプル鼻甲介、基になる上皮は上気道44の単純な線毛上皮なので。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA サンプリング
	<ol>
<li>サンプリングする場合は、下鼻甲介に対して平らであることの位置を決め、鼻孔の内腔を優しく NA サムを渡します。</li>
		<li>人差し指を使って鼻の粘膜の上にサムを押すドナーをお願いします。NA は、わずかなくすぐり、可能な限り目の散水とマロラクティック発酵がおこるよう可能性があります。 注:成人では、我々 は一般的に 60 NA を実行 s。</li>
		<li>MLF の吸収後、鼻孔から NA デバイスを削除し、元の管に戻します。</li>
		<li>研究室ですぐにサンプルを処理またはこのプロトコルの詳細として、それらを凍結します。 注:鼻の粘膜のチャレンジ モデルの様々 な異なる気道疾患、NA が検討されています。ただし、各研究と患者人口の他の呼吸サンプリング メソッドに対する検証を行わなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 気管支吸収 (BA)
<ol><li>
BA サンプリングする前の準備 注:BA は、気管支鏡検査スイートの専門スタッフによって実行されます。<ol>
<li>カテーテルを BA デバイスを配置すること、前に SAM は押し出しと、カテーテルに撤退を確認します。</li>
		<li>患者に BA を行う前に気管支鏡下シミュレータのモック BA を実施します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BA サンプリング
	<ol>
<li>気管支気管支、右下、右中葉に分割するだけで近位のレベルに気管および右主気管支に気管支鏡を渡します。 注: 私たち通常サンプルから気管支気管支気道内の他のサイトをサンプリングすることができます。カテーテルとサムを観察すると、気管支鏡先端を見ることができない 1 つ。気管支鏡が必要なサンプリング サイトに到着したら、ba、次の簡単な手順を遵守します。</li>
		<li>白の先端が気管支鏡の端に 1 cm の最大に、気道のちょうど表示されるまで、下カテーテル: は気管支鏡の操作チャンネルを通じて BA カテーテルを挿入します。気管支内視鏡やカテーテルの先端を気道の内腔の中心にしてください。カテーテル先端と粘膜に耐摩耗性のリスクを軽減する気管支の粘膜との接触を最小限に抑えるように注意します。</li>
		<li>サム アウト: SAM は右中または右下葉気道の内腔に押し出されますので、BA デバイスのハンドルを押し下げます。直視下気道壁にマロラクティック発酵との接触、サムが作っているように気管支鏡の先端を曲げます。30 の粘膜壁にフラットに気道内でサムを残して s。</li>
		<li>サムの: カテーテルの端に戻って、湿ったサム プローブがストレートや曲がっていないことを確認するため, 気管支鏡に目を通します。必要なカテーテルや気管支鏡の先端が SAM をまっすぐに後ろにできます。直視下カテーテルにストレートのサムを優しくリトラクトします。 注意: 難易度のカテーテルに SAM を取り消し、サムと全体のデバイスを撤回、気道から押し出されます。</li>
		<li>カテーテル: 気管支鏡の操作チャンネルからカテーテル全体を撤回します。</li>
		<li>サムを断つ: SAM は滅菌ハサミで切断されは氷の上を cryotube に入れています。これらのサンプルは、このプロトコルで後で説明するよう、さまざまな方法で処理できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. NA と BA の処理をサンプルします。
注:NA と BA から生じるサンプルの実験室の処理のための多数のオプションがあります。これらのプロトコルは、後で使用するためのサンプルを格納し、SAM から MLF サンプルを溶出するを求めます。
<ol><li>
NA と BA のサンプルの即時処理のオプション
	<ol>
<li>オプション 1: は、さらに処理する前に、いくつかの時間のため氷の上湿ったサムを格納します。</li>
		<li>オプション 2: すぐに深い凍結 NA サムズ コレクションの管です。同様に、サンプリング デバイスからハサミで除去した後、セラム チューブで BA SAMs を凍結します。</li>
		<li>オプション 3: 直接または深い凍結を処理する前に溶出バッファー (300 μ L) で戸建のサムを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA と BA のサンプルの溶出バッファーのオプション 注:溶出バッファーの選択は MLF サンプルで分析することに依存し、私達は 4 つの主な選択肢を提案します。<ol>
<li>事前に用意されたアッセイバッファー イムノアッセイ プロシージャに適したを使用します。そのようなバッファーは、蛋白質、例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) の 1% だけでなく、少量の洗剤 (0.05%) を含める必要があります。</li>
		<li>また、セル換散が発生しますので、洗剤の量を格納するバッファーを使用します。 注:1% の濃度でトリトン X または NP40 を含むバッファーを使用します。セル換散バッファーは、サムから溶出して一般的に高いレベルのサイトカインとケモカイン、サイトカイン細胞内と細胞外の両方を有効にします。これらのバッファーは、タンパク質を含める必要があり、1 %bsa と成っています。</li>
		<li>ウイルス RNA または測定のホスト RNA の定量的 PCR などの RNA 測定湿ったサムに直接 RNA 抽出バッファーを追加します。 注:カオトロ ピック RNA 抽出バッファーを含む蛋白質を変化させるため。代わりに、免疫や細胞の換散バッファーで溶出 MLF 流体に RNA 抽出バッファーを追加します。</li>
		<li>質量分析法による評価のための代謝と脂質の抽出のため、トリフルオロ酢酸などの有機溶剤を使用します。 注:これらの試薬の詳細は、マテリアル セクションに含まれます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶出法
	<ol>
<li>いずれかの上記の溶出技術、SAM を目的抽出バッファーと共に、2 mL マイクロ遠心チューブに挿入します。</li>
		<li>渦ミックス 30 サンプル s 緩く接続された体液と生体分子のサムを洗浄します。</li>
		<li>サンプル全体については復旧できるようにには遠心溶出を実行するために、洗浄に使用される同じ 2 mL マイクロ遠心チューブに挿入するスピン フィルター ミニ列に湿ったサムを追加します。 注:2 つのスピン フィルター ミニ列の種類を使用できます。最初には、流体における溶出を許可する場所に SAM を保持するプラスチック製のメッシュのみが含まれています。また、感染性物質を扱う場合は、0.22 μ m の細孔径を持つスピン フィルターを使用します。これらのフィルターは、試料を滅菌し、抗酸菌感染サンプルに適しています。ただし、これらのフィルターは、非特異的相互作用によってフィルターするメディエーターの結合を最小限に抑えるためのバッファーでする必要があります。</li>
		<li>スピン フィルターに湿ったサムを転送するのに滅菌鉗子を使用します。検体の間汚染を防ぐために鉗子を変更します。</li>
		<li>ミニ遠心分離機で 16,000 x g で 20 分間遠心分離機サンプル 4 ° C に冷却</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プロトコルの概要の例
	<ol>
<li>研究室では、ラベル 2 mL サンプル コレクションのマイクロ遠心チューブと溶出バッファーの適切なボリュームを追加 (通常 300 μ L NA; の ba 100 μ L)。シール蓋と氷の場所です。</li>
		<li>次のサンプリング (すぐにまたは実験室で) SAM 鉗子を使用してハンドルから削除されコレクション チューブ (前の手順で作成した) を含むバッファーに置かれます。遠心チューブのキャップはしっかりと閉じられ、さらなる処理のために検査室に、氷の上、サンプルを転送を確認します。</li>
		<li>30 の転送コンテナーと渦ミックスからサムと溶出バッファーを含むチューブを削除 s。</li>
		<li>滅菌鉗子を使用して、SAM を削除し、(0.22 μ m 酢酸セルロース フィルターの有無にかかわらず) スピン列に置きます。</li>
		<li>コレクションの管から溶出バッファーを収集し、保持します。</li>
		<li>元のコレクションの管で、サムと、スピン列を配置 (または新しい 1 つの場合、滅菌フィルターのサンプル) 列をスピンする収集バッファーを追加。この方法では、洗浄液が SAM からサンプルを溶出するコレクションの管に回転カラムを通過します。</li>
		<li>サンプルを遠心分離機、シール蓋 (16,000 x g, 20 分, 4 ° C)。</li>
		<li>遠心分離機からサンプルを取り出し、ラックに置きます。</li>
		<li>チューブのシール蓋を開き、SAM を含むスピン列を削除します。適切な廃棄容器のサムとスピンの列の処分します。</li>
		<li>慎重に因数にチューブ内に含まれる溶出液ラベル低温管します。溶出液量とボリュームをそれぞれ因数に記録します。</li>
		<li>シールのクライオ チューブを-80 ° C のフリーザーに転送し、使用するまで直立を格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

既存気道サンプリング技術からの結果は非常に変数とみなされますこのフィールド5内の研究の標準化に代替サンプリング技法が必要。NA と BA MLF のサンプリングを許可非侵襲的な方法で、健康と病気の気道の免疫反応を測定するエキサイティングな可能性を秘めています。これらの技術は、既存技術より忍容性、速度サンプリングのサンプリングを繰り返す頻繁機能などさまざまな潜在的な利点を下げるユーザ間の可変性を提供し、免疫メディエーター5 の希釈を減少.吸収と処理方法を使用の期間は、各研究用に最適化およびサンプリング イベントの間が厳格に守らすべき。また、BA、場合慎重に個人間の気道内サンプリング サイト必要がありますレプリケートされます。
NA、そして特に BA は、まだ比較的新しい臨床研究手法です。しかし、これらの技術の利点が代替技術5に対する慎重な検証を含む多くの研究での使用にしました。これらのデバイスは、デバイスの CE マークが呼吸の研究の広まった使用の準備ができて利用可能な今。NA と BA は、代替サンプリング手法よりも多くのより小さいサンプル ボリュームの結果、得られた濃度が高いことができます低豊富な免疫メディエーターの高い感度に 。
目的のダウン ストリーム アプリケーションによって NA と BA のサンプルは、後の処理が、臨床研究環境で研究の実現可能性を高めるため直接固定できます。サンプル処理のためのプロトコルは、特定下位アプリケーションに合うように適応させることができます。推奨処理技術は、核酸、免疫生理活性脂質または蛋白質のコレクションを使用できますが、各研究用に最適化する必要があります。特に、MLF は異なるバッファーで溶出できます。まず、粘膜のサイトカイン、ケモカイン、および抗体6,45を測定する免疫測定法によるバッファーを使用できます。セル換散が発生すると、細胞内サイトカインを含めることを保証するために、洗剤レベルの高いバッファーを使用もできます。ウイルス感染、ウイルスの定量に使用するバッファー カオトロ ピック RNA 抽出ロードは、mRNA と、マイクロバイ ホストします。また、有機溶剤は、リピド ミックスと質量分析法に使用できます。
結論として、MLF 粘膜の表面から直接吸収、呼吸、消化管、泌尿生殖器、および他の粘膜疾患の潜在的な使用とエキサイティングなテクニックです。ただし、これらの有望な吸収の技術をサンプリングし、各疾患の設定 (バイオ マーカー) 個々 の試金のための加工技術の正確な検証が必要になります。さらに、これらの新しい精密粘膜サンプリング テクニックとして必要になります従来のサンプルに対する検証など血液や呼吸、痰から。これらの技術は、微生物、サイトカイン、ケモカイン、プロスタノイド、抗体を測定する MLF を使用できます。

ほとんどの呼吸器疾患を引き起こす炎症反応やアレルギー性鼻炎、ウイルス、真菌感染症、結核、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺の呼吸器粘膜面からのサンプリングのための緊急の必要性があります。線維症や肺がん1。鼻咽頭吸引液 (警察庁)、鼻洗浄、気管支肺胞洗浄 (BAL) は、上部と下部の気道をサンプリングするための一般的な手法です。しかし、これらのテクニックは、貧しい忍容性、炎症性メディエーターの希釈サンプリング2を頻繁に繰り返すことができないなどかなりの問題を提示します。警察庁サンプリングする代わりが群がったナイロン、綿、綿棒の使用またはレーヨン3,4, が、これらも、限界がある不快感や被害鼻上皮といくつかの場合不可逆的な結合を起こすので炎症性メディエーター5。時間以上連続繰り返される一般的にこれらの技術もできない、代替技術は低豊富なサイトカインやケモカイン5,6の検出に効果的かもしれません。さらに、これらの技術に関連付けられているユーザーの変動は大きい患者コホートの要件の結果、データの不整合を生成するかもしれません。
また、天然および合成スポンジを使用して吸収技術は粘膜表面から MLF を収集するために使用されています。眼科用スポンジは天然セルロース (例えば、Weck cel) で構成されるサンプル唾、子宮頚部、膣分泌物7に使用されています。さらに、ポリビニル アルコール (PVA) から作られた合成スポンジと水酸化ポリ酢酸ビニル (HPVA) の活用8をされています。7 つの異なる吸収材料はポリウレタン ミニ スポンジは人間の涙10を収集するために使用されてきたが、抗体9を測定する前の唾液をサンプリングの比較されています。
綿植物から天然セルロース濾紙は、アラム、13,1412,1992年11、、、同僚の先駆的な論文から鼻分泌液を吸収するため広く使用されています 15,16,17。ろ紙ディスク フィルター カード (例えばシャンドン) から生産されているおよび鼻汁中の課題を制御後と自然のアレルゲン暴露18,19 ヒスタミン、サイトカインの測定に利用されています。 ,20,21。ただし、フィルター ペーパーの異なるバッチは蛋白質の結合およびサイトカインを解放するいくつかの失敗の度合いで異なります。合成吸収性マトリックス (SAM) を使用してメソッド開発2,22,23をされているため。Sam は通常 na というが使用鼻 MLF を取得する今これらの吸収性材料が快適に使用し、時間の長時間にわたって、MLF を炎症を起こしている鼻からも頻繁な間隔で取得できます。
鼻吸収は、上気道の MLF のサンプリングのための SAM を使用して精密粘膜サンプリングの形式です。NA デバイスとして CE マークが付いている医療機器クリーン ルームを用いた医療グレードの材料から製造され、ほこりやアレルゲンの無料です。NA サンプラー滅菌 cryotube のハンドルとサムから成ります。SAM は通常繊維、高分子で構成されていますも泡として利用可能だし、ソフトと吸収、サンプル コレクションの急速な吸湿発散性で選択されます。Sam 吸収分泌物の効率的な溶出できるように最小限のタンパク結合があります。NA は、すべての年齢層のドナーに対して実行できる非常に穏やかな、非侵襲的な手法です。さらに、シリアルのサンプリング、数分にも可能です。NA がサンプリング テクニック5既存の上部気道に対して検証され、繰り返しサンプリング速度論的データ アレルゲン23,24,25気道への挑戦、次の世代ができましたエンドトキシンの26とウイルス型 TLR アゴニスト (Jha、a.ら、原稿準備のために)。NA は、ウイルス細気管支炎30乳児アトピー27,28,29の自然史を調査するのにも使用されています。
気管支鏡下の特定 (BMS) は、オリンパス31,32,33によって開発されている気道内 MLF のコレクションのプロシージャです。残念ながら、この BMS システムが日本にはライセンスのみ。オリンパスは、2 つの BMS システムを供給: 線維性水酸化ポリエステル (FHPE) との 1 つは34,35,36,37, プローブし、綿とプローブの33,38,39,40,41,42,43。 大きなネックは、粘膜接触出血、血液で汚染されたすべてのサンプルの半分を引き起こした喘息患者で使用される BMS プローブをされています。著者らは結論サンプル MLF 喘息患者43で末梢気道からこの BMS システムを使用することは不可能だった。
代わりに、以下のライノ ウイルス6, 気管支喘息患者の実験的感染症、下気道の気管支の調査の間に実行することができますソフト SAM を使用して BA を開発しました。BA デバイスで構成されています: 外部中空カテーテル、ハンドピースを活性化、サムを押し出し、その端に SAM を持つ中央のプラスチック ガイド ワイヤ。ナ、BA キット、クリーン ルームを用いた医療グレードの材料から製造されて、ホコリやアレルゲンが。さらに、デバイスは、CE マークおよびガンマ線照射があります。サム ストリップは、吸収性、ソフト、サンプル コレクションの迅速ウィッキングします。また吸収分泌物の効率的な溶出できるように最小限のタンパク結合があります。デバイスは、気管支鏡の作業経路を通じ合うことができるとに急速に使用することができます、気道内の特定のサイトで MLF を正確にサンプルします。バル、BMS とは異なり接触出血または追加の患者不快感ポスト プロシージャの BA はされません。
NA と BA のサンプルの処理によく考慮する必要があります。サンプルをすることができます直接冷凍し、バッチで処理またはすぐに処理することができます。サイトカイン、ケモカインや免疫グロブリンは、ウイルス、細菌、有害の溶出のイムノアッセイを含む特定の下流のアプリケーションに対する処理の種類を調整ことができ、宿主細胞に RNA が関連付けられています。提案する臨床コレクションと研究室の臨床研究者のためのガイドとして NA と BA に関連する処理技術。

<table><tbody><tr><td>Nasosorption (成人、幅7mm)</td><td>ハント開発</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>患者グループ/年齢ごとに異なるサイズが用意されています。</td></tr><tr><td>気管支吸収</td><td>ハント開発</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>最小気管支鏡チャンネルサイズ 2mm;最大作業長 815mm</td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;共演&nbsp;スピンX&nbsp;遠心分離管フィルター(メンブレンなし)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;共演&nbsp;スピンX&nbsp;遠心分離管フィルター(0.22um膜)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>CLS8160-24EA</td><td>感染リスクのあるサンプルの滅菌用。</td></tr><tr><td>アッセイ(溶出)バッファー</td><td>ミリポア</td><td>AB-33k</td><td>ミリポアのウェブサイトには掲載されていませんが、お問い合わせやシダーレーンなどの一般的なラボ用品会社から入手できます。0.05%のTween-20と1%のBSAが含まれています。</td></tr><tr><td>NP-40細胞溶解バッファー</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>ウシ血清アルブミンを1%(w/v)に添加します。より高い絶対メディエーターレベルを回復することができます。</td></tr><tr><td>バッファーRLT(RNA抽出)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>鼻吸着および気管支吸着サンプルからRNAを回収することができます。</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>302031-100ML-M</td><td>HPLCアプリケーションで使用するサンプルの溶出用</td></tr><tr><td>2.0mlマイクロ遠心チューブ</td><td>Costar</td><td>3213</td><td>Spin-Xチューブフィルターには2mlチューブが必要ですが、従来の1.5mlチューブではこれらに適合しません。</td></tr></tbody></table>

鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

鼻吸収 (NA) と気管支吸収 (BA) の方法は、人間の上気道の粘膜内層液 (MLF) を吸収するのに合成吸収性マトリックス (SAM) を使用します。NA は、下鼻甲介、液を吸収し、最小限の不快感が発生する非侵襲的な手法です。NA は、上気道のサンプリングを繰り返す頻繁機能で再現可能な結果をもたらした。
比較では、呼吸器粘膜、鼻咽頭吸引 (警察庁) や従来の拭き取りなどのサンプリングの方法より侵襲的と大きなデータ変動の可能性があります。他の方法は限界がある、例えば、生検および気管支のプロシージャ侵襲、喀痰を含む多くの死者と死にかけている細胞し、液状化を必要とする、呼気凝縮液 (EBC) 含まれている水や唾液などし洗浄のサンプルが希釈し変数です。
BA は、クリニックで気管支鏡の作業チャネルを介して実行できます。サンプリングは忍し、気道内の複数のサイトで行うことができます。BA の結果気管支肺胞洗浄 (BAL) のサンプルよりも少ない希釈されて MLF サンプルで。
この記事は、NA と、BA のテクニックだけでなく、必要な下流バイオ マーカーの測定対象に合わせた結果のサンプルの検査処理を示します。これらの吸収技術は、臨床呼吸器研究で使用される従来のサンプリング技術を有効な手段です。

NA は、研究の数で簡単に利用されているし、粘膜の炎症を非侵襲的測定します。鼻にアレルゲンの投与、上昇するとマスト細胞の脱顆粒 (スウェーツら、に備えて原稿) に沿って数分 (図 1)、落下プロスタグランジン D2 (PGD2) レベルを観察できます。また、IL-5 (図 2、 24からの許可と再版される) などのタイプ II 炎症のメディエーターは次の鼻アレルギー チャレンジ23,24時間で測定できます。アレルギー性喘息患者と健常者の実験的感染は、NA はインターフェロン γ (IFN-γ) を含む調停のパネルを測定する (図 3、 6から許可を得て転載) の 7 日間にわたっていました。さらに、幼児の自然な呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 感染、NA 実証非 RSV 細気管支炎と健全なコントロール (児に対する IFN-γ などの炎症性サイトカインの高いレベルに関連付けられる RSV図 4、 30からの許可と再版される)。興味深いことに、RSV と非 RSV 細気管支炎の鑑別は、時間一致警察庁サンプル (図 4) で重要でした。
BA は、ライノ ウイルス、アレルギー喘息の実験的感染時にも使われました。IFN-γ、CXCL11、ライノ ウイルス感染、レベル 4 日 IL-10 と IL-5 (図 5のベースラインから上昇を認めたA、B、C および D は、それぞれ)。さらに、この手法は、健康コントロール (図 5 6から許可を得て転載) (図 5) を基準にして、ライノ ウイルス感染時にアレルギー性喘息患者の気道で IL 5 高値を示した。
アッセイバッファー 0.05% Tween 20 と 1 %bsa を含むを使用して溶離されるサンプルから生成されたこれらの代表的な結果 (材料の表を参照してください)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> 図 1: 急速な生成およびプロスタグランジン D2 次の鼻汁中のクリアランス。ティモシー草花粉鼻アレルギー チャレンジ シリアル サンプルで鼻吸収波からプロスタグランジン D2 (PGD2) の測定 (n = 5)。各行は、1 人の個人からのデータを表します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> 図 2: IL-5 次の鼻汁中の運動測定。シリアル鼻吸収サンプル鼻汁中の IL-5 の生産。3 繰り返しの参加者とアレルゲンの課題研究を実施した (n = 19) プラセボ (青)、低の用量 (10 mg) の経口プレドニゾン (オレンジ)、または高用量 (25 mg) 経口プレドニゾン (赤) アレルゲン投与前に 1 時間。行を表す幾何平均と誤差は、すべての参加者の 95% 信頼区間。(図は 2017 情報漏洩者ら、粘膜免疫学の許可を得て転載)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> 図 3: ライノ ウイルス感染インターフェロン-γ の誘導します。健康な成人の感染チャレンジ中に (n = 11、青) とアレルギー性喘息患者 (n = 28、赤) ライノ ウイルス 16、鼻吸収サンプリング インターフェロン γ (IFN-γ) のレベルを測定する使用されました。データは、四分位範囲を示す誤差範囲を個人や B) 中間レベルの A) 生スパゲッティ プロットとして表されます。(図は、ヘンゼルらから許可を得て転載6).<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> 図 4: Nasosorption 差別乳児の rs ウイルス感染症に関連付けられている高架のインターフェロン-γ 。鼻吸収と鼻咽頭吸引 (NPA) は、細気管支炎呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 感染症に関連付けられている乳児のインターフェロン-γ レベルを測定する使用された (赤、n = 12)、非 RSV 呼吸器病原体 (緑、n = 12)、および健康コントロール (青、n = 9)。Kruskall-ウォリス検定ダンズ補正を用いた多重比較用データを行った (* * *p&lt; 0.001)。ラインは中央値を表し、誤差範囲、四分位範囲します。(図ア スウェイツらから許可を得て変更30).<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> 図 5: ライノ ウイルス感染時に気管支の吸収サンプル中の炎症メディエーター 。 健常者のライノ ウイルス 16 感染 (n = 10、青) とアレルギー性喘息ボランティア (n = 23、赤)、気管支の吸収はベースライン時および感染 4 日目 D) IL-5、C) IL-10、B) CXCL11 A) IFN-γ のレベルを測定する使用されました。ウィルコクソンによって分析されたデータは署名ランク テスト (一致するサンプル)、マンホイットニー検定 (比類のないサンプル)。図は、ヘンゼルらから許可を得て転載6<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

本稿では、具体的には合成吸収性マトリックス (SAM) を使用して、上部および下気道の粘膜内層液 (MLF) をサンプリングして鼻粘膜および気管支の吸収の技術の使用について説明します。これらのメソッドより標準化と既存の呼吸サンプリング手法よりも忍容性を提供します。

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

今日は、合成吸収マトリックスを使用して粘膜内層液を吸収する精密粘膜サンプリングの一種であるナソソレーションの技術を実演します。nasosorption samplerは、滅菌クライオチューブ内のハンドルとSAMで構成されています。SAMは、繊維または発泡体のいずれかのポリマーで構成され、柔らかく吸収性があり、サンプル収集のための迅速なウィッキングを備えたように特別に選択されています。また、SAMはタンパク質の結合が最小限に抑えられているため、吸収された分泌物を効率的に溶出できます。ナソソープションは、赤ちゃんを含むすべての年齢の患者に実行できる、非常に穏やかで非侵襲的な技術です。さらに、数分おきのシリアルサンプリングも可能です。ナソソープションを実施するときは、まず手を洗い、できれば患者の前で手袋を着用する必要があります。まず、鼻腔を検査します。ヘッドトーチの使用と、臨床医が利き手ではない親指を使用して患者の鼻を引っ込め、鼻腔を視覚化することをお勧めします。通常、鼻鏡は必要ありません。鼻腔を覗くと、鼻孔は断面が丸くなく、まっすぐ後ろ向きに進んでいます。一般的に、下鼻甲介は膨らみ、つまり鼻孔の外側壁のくぼみとして見られ、鼻中隔は滑らかで平らな内側壁を形成しています。この下鼻甲介からサンプリングしたいのは、下にある上皮が気道の単純な繊毛上皮であるためです。サンプリング時には、鼻収吸収SAMを内腔に優しく通し、下鼻甲介に対して平らになるように向きを変えます。次に、人差し指を使用してSAMを鼻粘膜に押し付けます。これにより、MLFが吸収されるため、目から涙が出る可能性のあるわずかなくすぐりを引き起こす可能性があります。通常、60秒の時限吸収を使用します。その後、鼻腔吸収装置を鼻孔から取り出し、クライオチューブに戻して、すぐに氷上に保存してから冷凍することができます。あるいは、すぐにMLFの溶出に進むこともできます。ナソソープションは、さまざまな鼻粘膜チャレンジモデルやさまざまな気道疾患で研究されています。ただし、この比較的新しい方法では、他の呼吸器サンプリング方法に対する正式な検証が必要です。気管支吸収の技術は、合成吸収マトリックスを使用して気管支の粘膜内層液をサンプリングします。この方法は、光ファイバー気管支鏡を介して専門の担当者によって行われます。気管支吸収装置は、中央にプラスチック製のガイドワイヤーを備えた外部の中空カテーテルで構成されています。これは、ハンドピースの活性化時に押し出すことができる端にSAMを持っています。鼻吸着と同様に、SAMストリップは柔らかく吸収性があり、サンプル収集のための迅速なウィッキングを備えています。また、タンパク質の結合が最小限に抑えられているため、吸収された分泌物を効率的に溶出できます。気管支吸収装置を気管支鏡の下に置く前に、SAMが簡単にカテーテルに押し出され、引き戻されていることを確認するのが普通です。次に、気管支鏡シミュレーターを使用して気管支収着の方法を示します。最初に標準的な気管支鏡検査が行われ、気管支鏡を気管を下って右主気管支に通し、右下葉と右中葉の分割にちょうど近位の中間気管支のレベルに到達します。このレベルまで挿入すると、5つのステップが実行されます。1つは、カテーテルを下ろすこと。気管支鏡の手術チャネルを通じて、気管支鏡の端から最大1センチメートル遠位まで白い先端が気道に見えるまで、気管支吸収カテーテルを挿入します。気管支鏡とカテーテルの先端を気道の内腔の中央に保ちます。カテーテルの先端と気管支粘膜との接触を最小限に抑えるように注意して、粘膜損傷のリスクを減らしてください。2つ目は、SAMアウト。気管支吸収装置のハンドルを押し下げて、SAMストリップが右中央または右下葉気道の内腔に押し出されるようにします。直視下で、気管支鏡の先端を曲げて、SAMが気道壁の粘膜内層液に接触していることを確認します。SAMストリップを気道内に置いて、粘膜壁に対して30秒間平らにします。.3つ、SAMで。直視下で、SAMを直接カテーテルに戻します。引っ込めるときは、湿ったSAMプローブがまっすぐであることを確認してください。必要に応じて、カテーテルと気管支鏡の先端を戻してSAMをまっすぐにすることができます。SAMを引っ込めるのが難しい場合は、SAMを押し出して気道から戻した状態でデバイス全体を引き出します。4、カテーテルアップ。気管支鏡の操作チャネルからカテーテル全体を引き出します。5、SAMをカットオフします。SAMは滅菌ハサミで切断し、クライオチューブに入れ、急速冷凍または直接溶出する前にすぐに氷の上に置く必要があります。次のビデオクリップは、研究用気管支鏡検査を受けている患者の気道にSAMを押し出している様子を示しています。気管支吸収は現在、さまざまな肺疾患で研究されています。この精密な粘膜サンプリングの方法が、診断的精密検査、患者の層別化およびモニタリングに役立つことを願っています。ナソソープションと気管支吸収後のラボ処理。合成吸収性マトリックスからの粘膜内層液の溶出。今日は、鼻収着と気管支吸収の非侵襲的粘膜サンプリング技術後の実験室サンプル処理の一般原則を実演します。特に、合成吸収性マトリックスから粘膜内層液サンプルを溶出する方法を示します。採取時には、サンプルを氷の上に置いて実験室に輸送する必要があります。サンプルはすぐに処理することも、元のサンプルチューブで直接凍結して後で溶出することもできます。即時処理を行う場合は、サンプルを元のサンプルチューブに入れて氷上からラボに移すことができます。または、SAMを取り外して、収集時に溶出バッファーに入れ、その後、氷上でラボに移すこともできます。サンプルは、処理前に数時間、バッファー内またはサンプルチューブ内で氷上に留まることができます。SAMの遠心分離およびスピン溶出の前の洗浄ステップは、サンプル収量の最適化を目的としています。これを達成するために、SAMは目的の抽出バガーと一緒にエッペンドルフチューブに挿入されます。次に、サンプルをボルテックスミキサーで30秒間混合し、緩く付着した流体と生体分子のSAMを洗浄します。完全なサンプル回収を確実にするために、洗浄に使用したのと同じエッペンドルフチューブ内のスピンインサートに湿ったSAMを追加することで、スピン溶出を行います。この手順には清潔な鉗子を使用し、汚染を防ぐためにサンプル間で交換する必要があります。この方法では、遠心分離を使用してSAMから液体を抽出します。摂氏 4 度に冷却した遠心分離機で 16, 000 g で 20 分間サンプルを遠心分離します。使用する溶出バガーは、目的のアプリケーションによって決定されます。一般的には、タンパク質含有アミノアッセイバッファーまたはRNA溶解バッファーを使用します。2種類のスピンフィルターが使用できます。1つ目は、SAMを所定の位置に保持するプラスチックメッシュのみを含み、流体の完全な溶出を可能にします。あるいは、感染性物質を扱う場合は、孔径が0.2μmのスピンフィルターを使用することもできます。これらのフィルターは、感染したサンプルを除染し、微生物感染が疑われるサンプルに適しています。このようなフィルターが必要な場合は、サンプルを添加する前にタンパク質性バッファーをフィルターに浸透させるプレインキュベーションステップを含めることが重要です。このステップにより、非特異的なタンパク質吸収によるメディエーターのフィルターへの結合が最小限に抑えられます。以下は、クラス2の病原体を含む除染ステップを必要としないサンプルのナソソープションおよび気管支吸収処理に当研究室で使用した方法の例です。ステップ1では、SAMを適切なバッファーとボルテックスを含むエッペンドルフに30秒間入れます。ナソソープションには通常300マイクロリットルのバッファーを使用し、気管支吸収には100マイクロリットルを使用します。ステップ2では、SAMを鉗子を使用して除去し、SAMの洗浄に使用するバッファーと一緒にプラスチックメッシュフィルターカップに入れます。ステップ3では、SAMが入ったプラスチックメッシュフィルターカップを元のエッペンドルフに戻します。ステップ4では、フィルターカップ、バッファー、およびSAMを含むエッペンドルフを、摂氏4度で16, 000gで20分間遠心分離します。遠心分離後、SAMの入ったフィルターカップを取り外して廃棄します。その後、溶出液を分注し、後で分析するために急速凍結することができます。ナソ吸着サンプリングは、多くの臨床呼吸器研究環境に適用されています。これには、プロスタグランジンD2やインターロイキン5などの経鼻アレルゲンチャレンジ中の炎症メディエーターの測定が含まれます。これらのチャレンジモデル設定で重要なことは、ナソソープションによるサンプリングにより、メディエーターレベルの頻繁なキネティックプロファイリングが可能になり、サンプリングを数分ごとに繰り返すことができることです。ナソソープションは、健康な被験者やアレルギー性喘息患者を対象としたライノウイルス感染のチャレンジ中にも使用され、研究期間中、ナソソープションが毎日繰り返されました。この研究でナソソープションを使用することで、ライノウイルス感染に対するインターフェロン応答の高感度な特性評価が可能になりました。最後に、細気管支炎の乳児を研究するために、ナソソープションサンプリングを使用しました。この研究では、呼吸器合胞体ウイルスによる感染は、インターフェロンガンマなどの高レベルの炎症メディエーターと関連していました。重要なことに、ナソソープションによるサンプリングにより、乳児の研究に健康な対照群を含めることができる。気管支吸収は、健康な被験者とアレルギー性喘息患者を対象としたライノウイルスチャレンジ研究でも使用されました。この研究では、ライノウイルス感染中に下気道の炎症メディエーターであるインターフェロンガンマ、ITAC、IL-10、およびIL-5が有意に増加したことが示されました。この手法を下気道の研究に含めると、気管支肺胞洗浄などの従来の方法では検出できない可能性のあるメディエーターのレベルを測定する可能性が生まれます。結論として、粘膜内層液は非侵襲的に取得でき、感染や炎症における炎症反応を測定するエキサイティングな可能性を秘めています。溶出方法は、サンプルの性質と測定するパラメータに応じて適合させる必要があります。特に、MLFは、粘膜サイトカインとケモカイン、ウイルス感染、ウイルス量、細菌および真菌感染症、マイクロバイオーム、および粘膜抗体の測定に使用できます。最後に、粘膜のサンプリングおよび溶出法には、個々のプロジェクトに合わせた開発と慎重な検証が必要です。

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鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング

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