August 16th, 2017
このプロトコルの目的は、首尾一貫した命名と分類基準に欠けているグループの発散の蛋白質のための参照を開発します。このリファレンスでは、分析と全体としてグループの議論を促進し、設立名に加えて、使用することができます。
この手順の全体的な目標は、標準的なスプレッドシートソフトウェアを使用して、命名法と分類の一貫した基準がないグループ内の発散タンパク質の参照を作成することです。この方法は、無脊椎動物の防御を含む防御ペプチドのシステイン安定化α-βスーパーファミリーなど、混乱した命名法や一貫性のない命名法を持つ関連タンパク質間の関係を明らかにするのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的のタンパク質を視覚的に簡単に表現できることです。
まず、目的のタンパク質グループの定義特性を特定します。例えば、昆虫防御の溶液構造におけるCSα-βフォールドとphormia terraenovaeからの援助は、CSα-βスーパーファミリーを定義します。このフォールドには、システイン安定化ヘリックスと呼ばれる小さなモチーフも含まれており、CXCの上流のCXXXCによって識別されます。
4つのシステインは2つのジスルフィド結合を形成します。CSα-βモチーフを完成させるために、追加のシステインペアによって3番目のジスルフィド結合が形成されます。最終的には、タンパク質の構造または機能に関連する少なくともいくつかの重要な特徴を知ることが重要です。
これがなければ、参照を生成するための基礎はありません。次に、これらの定義機能をスプレッドシートに入力します。保存されたフィーチャの列を使用し、これらのフィーチャ間のスペースを表します。
列の幅は数字に収まるように十分に確保し、幅を一定にしてください。行で、シーケンスを記述します。シーケンスを特徴として示すには、関数 fill を使用して特徴ボックスに色を塗りつぶします。
次に、特徴間の間隔を示すために、その間のボックスにアミノ酸の数を入力します。次に、構造データベースと公開された結果に基づいて、グループのメンバーとして以前に確立された代表的な配列を追加します。必要に応じて、追加のシステインなど、配列のサブグループを定義する可能性が高い特徴を追加します。
特定の配列に特徴が欠落している場合は、ボックスを埋めずに、介在するアミノ酸を表すボックスと組み合わせます。これを行うには、Merge and Center関数を使用します。代表的な配列が入力されたら、明確に関連する配列のグループを特定します。
次に、これらのグループの特性を要約します。特徴間のアミノ酸の数が異なる場合は、ハイフンを使用して範囲を示すか、スラッシュを使用していくつかの特定の数を示します。必要に応じて、関連性がある可能性のある特徴や、参照に含めるほど一般的でない特徴に創造的な注釈を付けます。
例えば、システインはスーパーファミリーにおいて重要であるため、追加のシステインの存在を標識することができる。新しく同定された配列をスプレッドシートに追加すると、クマムシのように、1つの種の配列がスーパーファミリーのいくつかの異なるグループに分類されることがあります。完了したら、スプレッドシートの行を並べ替えて、種内のバリエーションや分類グループ間のバリエーションを強調表示できます。
このデモでは、無料で入手できるMEGA 6ソフトウェアを使用しています。ただし、他のソフトウェアも同様に使用できます。新しい整列を開始するには、[整列]タブの[整列の編集/ビルド]を選択します。
次に、表示されるボックスで[新しい線形を作成]を選択し、[OK]をクリックします。次に、[プロテイン] を選択します。次に、[編集] メニューの [ファイルからシーケンスを挿入] を選択して、シーケンスをインポートします。シーケンスはFASTA形式である必要があります。
さまざまなアミノ酸タイプを反映した背景色がデフォルトで表示され、[表示]メニューのトグルでオフにすることができます。すべてのシーケンスを入力したら、屈曲アームアイコンをクリックし、次にAlign Proteinをクリックして、筋肉アルゴリズムを使用してシーケンスをアラインメントします。メッセージの場合、アライメントのために何も選択されていません。
「Select all?」 (すべて選択しますか?) ポップアップが表示されたら、[OK] を選択します。一部のパラメータはポップアップウィンドウで変更できますが、このデモではデフォルトで十分です。次に、タンパク質スーパーファミリーの重要な特徴に基づいてアライメントを確認します。
上部のバーには、アミノ酸が完全に保存されている任意の位置にアスタリスクが表示されます。最初のアラインメントでは、保存された4つのシステインのうち3つが同定されます。1つのシーケンスが明らかにずれています。
ずれたシーケンスを修正するには、ダッシュを強調表示し、誤ってアミノ酸を削除せずにDeleteキーを押します。次に、スペースを追加してアミノ酸を適切な配置に移動します。配列を手動でアラインメントした後、CXXXCモチーフの最後のシステインがアラインメント全体で保存されることに注意してください。
多くの場合、シーケンスの最も重要な特徴に優先順位を付けるために、手動調整が必要です。以前に確立されたCS α-βスーパーファミリーのスプレッドシートのアライメントにより、結合形成の5つの基本パターンが明らかになりました。新たに同定されたクマムシの配列は、これらのパターンの全範囲に当てはまりました。
次に、系統解析を用いて、このタンパク質群がどのように進化したかを調べました。ただし、シーケンスは一般的に短く、非常に分岐しています。したがって、結果として生じる樹木の解像度は低く、洞察がほとんど提供されませんでした。
マルチプル配列のアラインメントは、リファレンスを使用して最適化されましたが、最尤解析とベイズ系統解析では、依然として解像度が低かったです。ほとんどのクレードは、低いレベルの支援しか持っていませんでした。しかし、2つのツリーのうち少なくとも1つで5つの小グループがサポートされました。
分類群内でシステイン数が異なる配列は、異なるグループから同じパターンを持つ配列よりも密接に関連している可能性があります。このビデオを見れば、スプレッドシートソフトウェアを使用して重要なタンパク質特性を簡単に視覚化する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際、タンパク質のグループに最も関連性の高い特性を決定することは、多くの場合、反復的なプロセスであり、参照の改訂が必要になる可能性が高いことを覚えておくことが重要です。
新しい配列はいつでもスプレッドシートに追加でき、分類や分析に役立つ可能性のある新しい特徴を追加できる複数のバージョンを持つことは容易です。スプレッドシートのアライメントにより、構造的および機能的特徴を簡単に視覚化できますが、系統解析などの他の方法を実行して、進化的関係に関する追加の洞察を得ることができます。
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このプロトコルは、現在一貫した命名法と分類基準がないグループ内の発散性タンパク質の基準を作成することを目的としています。関連タンパク質間の関係を明確にすることで、この基準はグループに関する議論と分析を強化します。
Protein classification challenges can impede target validation and comparative analyses across discovery programs, especially when nomenclature and sequence diversity obscure functional relationships. Establishing a reference framework that prioritizes structural and activity-related features enables more reliable placement of new sequences and supports cross-functional R&D discussions. This approach enhances predictive confidence and portfolio decision-making for protein families with high sequence divergence.
This reference-based method integrates into the discovery continuum from early target identification through lead optimization, especially for protein families with complex sequence diversity.