コンピュータベースのタンパク質の構造と機能の予測のためのプロトコル

この手順の目的は、アミノ酸配列からタンパク質分子の三次元構造および生物学的機能を計算によって予測することです。まず、機械学習を用いてタンパク質の二次構造を予測します。次に、配列と予測された二次構造をPDBライブラリ内の既知の構造と照合し、最適な構造テンプレートを特定します。

この手順はスレッディングと呼ばれます。スレッディング手順の後、IT AERプログラムは配列テンプレートのアライメントに基づいてテンプレートをフラグメントに分割し、第3ステップでそれらのフラグメントをフルレングスモデルに再構築します。水素結合ネットワークを最適化し、立体的な重なりを除去するための原子レベルの精緻化を行うことで、完全な原子モデルが構築されます。

本手順の最終ステップは、予測構造を機能ライブラリ内の機能既知のタンパク質と照合し、タンパク質の生物学的機能を特定することです。既存の構造モデリング手法に対するITERの主な利点は、固有の構造フラグメントアセンブリアプローチにあり、これによりスレッディングアラインメントを整合的にネイティブ状態へと近づけることができます。これらの高品質な構造モデルは、正確な構造ベースの機能注釈の基礎となり、科学コミュニティにおけるITERの利用を促進します。

当研究室では、タンパク質配列をiterに送信できるウェブサイトを公開しています。このウェブサイトは、世界中のユーザーが、ITERシミュレーションの管理および実行を行うコンピュータークラスターへのインターフェースを登録するための拠点として機能します。1つのITERシミュレーションジョブは、10件以上の小規模なサブシミュレーションで構成されています。

これらのシミュレーションを単一プロセッサコアを持つ1台のコンピュータで実行すると、100時間以上かかる場合があります。Zang研究室のコンピュータクラスターは、これらのサブシミュレーションを数百台のコンピュータに分散して処理し、2,000件以上のシミュレーションを同時に実行することが可能です。このコンピュータクラスターを用いることで、毎日数百件のI tasterシミュレーションを完了させることができます。

このような能力を備えていても、オンラインIT AERユーザーの待ち時間を最小限に抑え、システムを最適化するためには、多くの作業が必要です。構造および機能モデリング実験を開始するには、IT AERのウェブページにログインしてください。ここで説明するすべての関連ウェブページのURLアドレスは、書面によるプロトコルに記載されています。

アミノ酸配列を所定のフォームにコピーして貼り付けるか、参照ボタンをクリックして配列を直接アップロードしてください。ジョブの名前とメールアドレスを入力します。また、オプションで残基間の外部コンタクトまたは距離拘束を指定することも可能です。

構造モデリングのプロセスにおいて、テンプレートを追加するか、一部のテンプレートタンパク質を除外します。配列を送信するには、run it taserボタンをクリックしてください。送信したジョブの状態は、IT taser queueページにアクセスして確認してください。

検索タブをクリックし、ジョブID番号またはクエリ配列を使用して、送信したジョブを検索します。構造および機能のモデリングが完了すると、予測構造の画像とウェブリンクを含む通知メールが、指定したメールアドレスに送信されます。このリンクをクリックして、結果の表示とダウンロードを行ってください。

二次構造予測の確認から構造解析を開始します。予測結果は、αヘリックスをH、βストランドをS、コイルをCとして表示されます。また、各残基の予測に対する信頼性スコアも考慮してください。タンパク質のコア領域を推定するため、規則的な二次構造予測が長く続く領域を探します。

タンパク質の構造クラスは、二次構造要素の分布に基づいて分析することも可能です。予測された溶媒接近性を確認し、埋没領域と溶媒露出領域を特定してください。クエリにおいて、予測溶媒接近性の値は、埋没した残基のスコア0から、露出した残基のスコア9までの範囲で示されます。

主に埋没した残基を含む領域はタンパク質のコア領域を定義するために使用でき、溶媒に露出した親水性残基を持つ領域は潜在的な水和部位または機能部位となります。クエリタンパク質の予測三次構造を表示するには、左側に表示されているインタラクティブなJMO Appletまでスクロールしてください。アプレットをクリックすると、表示される構造の外観を変更できます。

特定の領域をズームし、予測モデル内の特定の残基タイプを選択するか、残基間距離を算出します。構造モデリングの信頼性スコアを分析し、予測構造の品質を推定します。Csco値は通常-5から2の範囲にあり、スコアが高いほどモデルの品質が良いことを示します。

最初のモデルの推定TMスコアとRMSDは、モデル1の推定精度として示されています。cscoの詳細に関するリンクをクリックしてください。すべてのモデルのcscoクラスターサイズとクラスター密度を分析するには、low metsスレッディングプログラムによって特定されたクエリタンパク質のトップ10スレッディングテンプレートを分析してください。

結果ページを下にスクロールし、正規化Zスコアを確認してスレッディングアライメントの質を分析します。正規化cscoが1より大きいアライメントは、信頼性の高いアライメントであることを示しており、クエリタンパク質と同じフォールドを持つ可能性が最も高くなります。クエリタンパク質とテンプレートタンパク質の間のホモロジーを評価するために、スレッディングアライメント領域および鎖全体の配列同一性を検討してください。

高い配列同一性は、クエリタンパク質とテンプレートタンパク質の間の進化的な親縁性を示す指標となります。カラーで表示されたスレッディングアライメント残基を確認し、クエリおよびテンプレートタンパク質における保存された残基やモチーフを視覚的に特定してください。全鎖アライメントと比較してスレッディングアライメント領域の配列同一性が高いことは、クエリに保存された構造モチーフまたはドメインが存在することを示しています。アライメントを精査し、スレッディングアライメントのカバー率を評価してください。

上位のアライメントのカバレッジが低く、クエリタンパク質の狭い領域にのみ限定されているか、あるいはクエリ配列の長いセグメントで欠落している場合は、そのクエリタンパク質に複数のドメインが含まれていることを示しています。この場合、配列を分割し、各ドメインを個別にモデリングすることを推奨します。結果ページの次の表を確認し、構造アライメントプログラムであるTM-alignによって特定された、最初の予測モデルに対する構造類似性上位10件を決定してください。

TMスコアが0.5より大きい場合は、検出されたアナログとモデルが同様のトポロジーを持ち、クエリタンパク質の構造クラスまたはタンパク質ファミリーを決定するために使用できることを示します。TMスコアが0.3未満のものは、ランダムな構造類似性を意味します。構造的にアライメントされた領域の配列同一性とRMSDを解析し、モデルと構造アナログにおける空間モチーフの保存性を評価してください。

アライメント内で色付けおよび整列された残基ペアを視覚的に確認し、構造的に保存されたこれらの残基およびモチーフを特定します。予測EC番号テーブルを参照し、クエリタンパク質の可能性が高い上位5つの酵素OGを確認してください。これらのテンプレートを用いたEC番号予測の信頼性は、ベンチマーク解析に基づくECスコアとして示されています。

クエリタンパク質とテンプレートタンパク質の間の機能的類似性は、ECスコアが1.1より大きい場合に信頼して解釈することができます。次に、クエリタンパク質と同様のフォールドを持つテンプレート間で、機能のコンセンサスを確認します。複数のテンプレートが同じEC番号を持ち、かつECスコアが1.1より大きい場合、予測の信頼レベルは非常に高くなります。

しかし、ECスコアが高くても、特定されたヒット間にコンセンサスが不足している場合、予測の信頼性は低下するため、ユーザーはジーンオントロジーを確認することが推奨されます。「Term predictions」ビューでは、予測されたジーンオントロジー用語のテーブルを確認し、PDBライブラリ内でジーンオントロジー用語が付与されているクエリタンパク質のホモログ上位10件を特定します。通常、各タンパク質には、その分子機能、生物学的プロセス、および細胞内局在を記述する複数のジーンオントロジー用語が関連付けられています。各用語をクリックするとamigoウェブサイトに移動し、その定義とリネージを分析できます。

クエリタンパク質とテンプレートタンパク質の間の機能的類似性を評価するために、機能的ホモロジースコアの列を分析します。これにより、これらのタンパク質から機能アノテーションを転移させる際の信頼レベルを推定することも可能です。また、遺伝子オントロジー用語のコンセンサス予測テーブルを確認し、テンプレート間での機能の一致性を分析してください。

これらの共通機能は、クエリタンパク質のジーンオントロジー（GO）用語を予測し、そのGO用語予測の信頼レベルを評価するために使用されます。最後に、ページの一番下までスクロールして、クエリタンパク質に対するリガンド結合部位の予測上位10件を確認してください。予測された結合部位は、共通の結合ポケットを共有する予測リガンドコンフォメーションの数に基づいてランク付けされます。特定された最良の結合部位は、すでにJmolアプリに表示されています。

ラジオボタンをクリックして、他の予測結果を解析し、リガンド相互作用残基を可視化してください。BSスコアは、モデルとテンプレートの結合部位間の局所的な類似性を示します。BSスコアが1.1より大きい場合は、予測された結合部位付近の配列および構造の類似性が高いことを示します。

テンプレート内の既知の結合部位と比較したモデルにおいて、ITは他の有用な機能へのリンクを含むメインウェブページです。フォーラム機能では、ユーザーがオンラインアカウントを作成し、構造モデリングに関する支援や結果の解釈について他のITERユーザーに助けを求めることができます。ダウンロード機能を利用することで、ユーザーはiterおよび関連パッケージをダウンロードし、自身のコンピュータにインストールすることが可能です。

これにより、モデリング実験の実行に必要な時間を短縮できます。キュー機能により、送信したすべてのジョブのステータスをIT a Qページで確認することが可能です。また、ユーザーは完了したジョブのモデリング構造の画像を視覚的に検査することもできます。

このページでは、CSCOの期待TMスコア、第1モデルの期待RMSD、および投稿日とともに、IT AERの結果ページの抜粋が表示されています。ここには、高速フォーマットされたクエリ配列、予測二次構造、および関連する信頼度スコアと残基の予測溶媒接近性が示されています。解析されたコア領域とクエリ内の潜在的な水和部位は、それぞれシアン色と赤色の矩形でハイライトされています。ここでは、クエリタンパク質の三次構造予測が示されています。

予測モデルはインタラクティブなJMLアプリアウトレットに表示され、ユーザーは分子の表示を変更することができます。また、ダウンロードリンクをクリックすることでモデルをダウンロードすることが可能です。モデルの品質を推定するための信頼性スコアはcscoとして報告されます。Loomisスレッディングプログラムによって特定された上位10件のスレッディングテンプレートとアライメントを示すitta A結果ページの例を提示します。

スレッディングアライメントの質は正規化Zスコアに基づいて評価され、1を超える値は信頼性の高いアライメントであることを示します。テンプレート内でクエリ残基と同一であるアライメント済み残基は、保存された残基またはモチーフの存在を示すために色で強調表示されます。逆に、上位のテンプレートの大部分でアライメントが見られない場合は、クエリタンパク質に複数のドメインが存在することを示しており、アライメントされていない残基はドメインリンカー領域に対応します。

この表は、TM-align構造アライメントプログラムによって特定された上位10個の構造アナログおよび構造アライメントを示しています。アナログのランキングは、構造アライメントのTMスコアに基づいています。TMスコアが0.5より大きい場合は、比較した2つの構造が類似したトポロジーを有していることを示します。

TMスコアが0.3未満であることは、2つのランダムな構造間の類似性を意味します。構造的にアライメントされた残基ペアは、アミノ酸の特性に基づいて色で強調表示され、アライメントされていない領域はダッシュで示されます。以下は、PDBライブラリにおいてクエリタンパク質の酵素ホモログを同定したITR結果ページの例です。

EC番号予測の信頼レベルはECスコアに基づいて分析され、ECスコアが1.1より大きい場合は、クエリタンパク質とテンプレートタンパク質の間に機能的な類似性があることを示します。クエリタンパク質の遺伝子オントロジー（Gene Ontology）用語予測テーブルには、遺伝子オントロジーテンプレートライブラリ内のクエリタンパク質の機能的ホモログが、機能的ホモロジースコアに基づいてランク付けされて含まれています。これら上位スコアのヒットから共通の機能的特徴を導き出し、クエリタンパク質の最終的な遺伝子オントロジー用語予測を生成します。

予測されたジーンオントロジー用語の品質はgeoスコアに基づいて推定されます。geoスコアが0.5より大きい場合は信頼性の高い予測であることを示しており、ここでは例として、コファクターアルゴリズムを用いた上位10件のタンパク質リガンド結合部位予測を表示するIT AZAの結果ページを示しています。予測された結合部位のランキングは、共通の結合ポケットを共有する予測リガンドコンフォメーションの数に基づいています。クエリにおいて、BSスコアは予測された結合部位とテンプレート結合部位の間の局所的な配列および構造の類似性を測定する指標であり、結合部位ポケットの保存性を分析するのに有用です。

ISERはタンパク質の構造および機能予測において最も効率的なアルゴリズムの一つですが、あくまでコンピュータアルゴリズムによる予測であることに留意することが重要です。例えば、残基間のコンタクトや結合情報などの実験データや機能的な知見があれば、予測精度を向上させる上で非常に有用です。IT AERサーバーでは、高まる関心に対応するため、モデリング手順中にこれらの情報を組み込むためのポータルを提供しています。

Zang研究室は、非営利の研究目的向けにIT AERソフトウェアを無料で公開しました。私たちは現在、IT AERおよびアイテスターの改良を積極的に進めており、本ソフトウェアの提供によってZang研究室以外での大規模な活用が進み、科学コミュニティにおけるさらなる研究の促進と発展に寄与することを期待しています。