Name: バイオ エンジニア リング アプリケーション用先端材料の抗菌特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ 先端材料の抗菌特性評価プロトコル。アガーディスク拡散試験とISO 22196:2007接触法を用いて、Staphylococcus aureusやEscherichia coliに対する抗菌活性を測定し、バイオエンジニアリング応用に向けた材料開発を支援します。

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作者はバレンシア ・ カトリカ大学サン ビセンテ サンペドロマルティル山脈 2017 231 001UCV を通じてこの仕事のための金融支援を認識したいし、2018-231-001UCV を与えます。

1. サンプル準備
<ol><li>円筒パンチ直径 10 mm の 10 mm 径ディスクに物質的なサンプルをカットします。 注: 脆性材料することができます 1 時間適切な無菌溶剤で軟化し、ディスクにカットします。たとえば、亜鉛アルギン酸など親水性材料はこのプロトコルを次にテストされた、サンプルの破壊を避けるためにそれらを切断する前にオートクレーブ処理した水で潤った。ただし、poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) など他の疎水性材料には正しくカットするために以前腫れの任意の種類の必要はありません。</li>
	<li>真空オーブンで 60 ° C でサンプル素材ディスクを乾燥 (&lt; 10-2 Torr) 24 時間。 注: いくつかの材料は、高い乾燥温度を必要があります。ただし、材料が低下する可能性があります熱温度に達することが重要です。</li>
	<li>デジタル ノギスで基材フィルムの厚さを測定します。 メモ: 異なる材料の抗菌活性を比較するとき、このプロトコルは定数と同様の厚みをもつ膜の利用を推奨します。</li>
	<li>各試験片をエタノール 10 分 70%、その後紫外線 (UV) 各側面ごとに 1 時間の浸漬で滅菌します。 注: 紫外線は UV-C 放射の 12.0 W ランプと層流フードの内部の滅菌シャーレに各試験片を置く実行できます。 注意: 研究者公開しないでください彼ら自身、紫外線に変異原性です。</li>
	<li>1.1、1.2、1.3 と 1.4 の手順に従います。制御材料ディスク。 注: ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット) または代わりとなる非抗菌材料は、拡散や接点方式で制御ディスクとして使用することができます。さらに、ナノ複合体または扱われた材料を特性評価する際、基材は制御材料として使用ください。</li>
</ol>2. 推奨微生物
注: 幅広い微生物に対してテスト済みの素材の抗菌能力を研究する 3 の異なる微生物の使用をお勧めします。
<ol><li>3 微生物の純粋培養を使用: グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌、大腸菌、グラム陰性の細菌、カンジダ酵母。 注: 他の微生物種もテストできますこのプロトコルで必要に応じて培養条件を変更することによって。 注意: このプロトコルで採用されている微生物の種類によって必要なバイオ計測を従う必要があります。</li>
	<li>あらかじめ滅菌またはオートクレーブ材料と無菌条件を確保する (必要に応じて) 微生物操作または生物学的安全キャビネットの全体のプロセスの中にはブンゼン バーナーの使用します。 注: 推奨されるオートクレーブ条件働き材料および生物学的残基の 20 分間文化媒体の 121 ° C 15 分間 121 ° C をします。</li>
</ol>3. 寒天ディスク拡散試験 (拡散法)
注: 抗菌化合物の液相拡散は、先端材料の主要な抗菌メカニズムかもしれない場合は、これらの材料の抗菌能力について非常に有用な情報が拡散法で提供できます。寒天プレートの中央にある材料のディスクは、微生物に対する増殖阻害が文化の 24 h 後発生します透明リング ゾーン (ハロー) を形作ることができる (図 1参照)。
<ol><li>
拡散テストの手順
	<ol>
<li>準備とオートクレーブ トリプシン大豆寒天 (TSA) を製造元の指示に従って。</li>
		<li>TSA をブンゼン バーナーまたは層流フードを用いた無菌条件下で滅菌シャーレに注ぎ。 注: TSA プレートは 4-6 mm の厚さである必要があります。</li>
		<li>37 ° C でインキュベーターで TSA ペトリ皿で 18-24 h 好をテストする別の微生物を文化します。</li>
		<li>準備とオートクレーブ トリプシン大豆スープ (TSB) 製造元の指示に従います。</li>
		<li>TSB をブンゼン バーナーまたは層流フードを用いた無菌条件下で殺菌済み血清ピペット 50 mL 殺菌済みの遠心管に注ぐ。</li>
		<li>滅菌綿棒と渦を使用して滅菌遠心管に含まれる TSB の 3.1.3 で 25 mL のステップからの少数のコロニーを再停止しなさい均一な混合を達成するために 1 分のためにそれら。</li>
		<li>吸光度を調整 (540 nm) mL あたり単位 (CFU) を形成するコロニーの適切な数を分光光度計と文化の: 約 1.5 × 108 CFU/mL の細菌と 1 x 106 5 × 106 CFU/mL 酵母から。 注: 吸光度を測定する文化とキュベット ボリュームは、分光光度計活用の種類に応じて選択する必要があります。</li>
		<li>渦を 5 秒間微生物分散を改善し、簡単にこの菌懸濁液の滅菌綿棒を水没微生物のスープ。綿棒の文化を含む管壁に対してそれを押すことによって液体の超過分を削除します。</li>
		<li>微生物と彼らの全体の表面をカバーし、接種後 5 分で乾燥させる 3 平面で TSA プレートの表面に滅菌綿棒で微生物液懸濁液を均等に連勝します。 注: する水分を除去する、TSA プレート必要があります配置するオープン接種前に 10-15 分の 37 ° C で逆位置に。</li>
		<li>96% のエタノールをビーカーでそれらを浸すと、ブンゼン バーナー、アルコール バーナーとそれらを燃えるようなピンセットのペアを滅菌します。</li>
		<li>テストを行い、滅菌ピンセットのペアを使用して TSA プレートの中央にディスクを制御するサンプル ディスクを配置します。</li>
		<li>24 h の 37 ° C で倒立位置で TSA プレート好孵化させなさい。 注: 任意の汚染のリスクを避けるためにお勧め倒立位置で TSA プレートをインキュベートします。ただし、サンプル ディスク TSA プレートから切り離すと場合、この手順を逆位置に実行しないでください。この場合、層流フードの版を乾燥することをお勧めします。この抗菌性試験は再現性を確保するため別の日に quadriplicate で少なくとも実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
菌懸濁液濃度・純度の確認 注: 次の手順がステップ 3.1.7 に分光光度計での微生物濃度が正しいことを確認し、微生物汚染がないことを確認するために必要です。文化の 24 h 後各種微生物コロニーの出現によって、微生物汚染を簡単に検出できます。さらに、否定的な TSB コントロール プレート シリアル希釈操作中に TSB 培地の微生物汚染を保障されなければなりません。<ol>
<li>無菌条件で適したオートクレーブ ヒントにマイクロ ピペットを使用して滅菌マイクロ遠心チューブ用に滅菌 TSB (3.1.4 の手順で準備) を調剤します。それらの 1 つは否定的な TSB コントロールとして使用されます。</li>
		<li>TSB を含む滅菌マイクロ遠心チューブ用のステップ 3.1.9 利用微生物スープ サスペンションを 10 進数のシリアル希薄を実行します。</li>
		<li>TSA プレート殺菌済み発病ヘラまたは代替手段を使用して各希釈の 100 μ L を広めます。また否定的な TSB コントロール プレートとして TSA 皿の上 (3.2.1 の手順で準備) 微生物なし TSB 培地の 100 μ L を広げます。</li>
		<li>24 h の 37 ° C で好気的 TSA プレート好孵化させなさい。</li>
		<li>CFU/mL が類似 3.1.7 の手順で決定することを確認するコロニーの数をカウントします。</li>
		<li>コロニーの 1 種類のみで TSA プレートの微生物汚染がないことを確認してください。</li>
		<li>コロニーを示さない TSB ネガティブ コントロール プレートの微生物汚染がないことを確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 部材表面 (連絡方法) の抗菌活性の測定
 注: いくつかの材料の主要な抗菌メカニズム面接触かもしれないが場合、は、これらの材料の抗菌能力について非常に有用な情報が連絡方法で提供できます。この方法では微生物は材料の表面に直接配置され、一定の時間後、成長阻害を定めることができます。
<ol><li>
最初の手順
	<ol>
<li>準備とオートクレーブ TSB の製造元の指示に従います。</li>
		<li>TSB をブンゼン バーナーまたは層流フードを用いた無菌条件下で殺菌済み血清ピペット 50 mL 殺菌済みの遠心管に注ぐ。</li>
		<li>好気的テストに異なる微生物が 37 ° C で軌道シェーカー (140 rpm) で TSB のチューブで一晩文化</li>
		<li>希釈濃度約 10 の 50 mL 殺菌済み遠心管で TSB の 20 mL で一晩かけて培養6 CFU/mL (540 で分光光度計で nm)。 注: 吸光度を測定する文化とキュベット ボリュームは、分光光度計活用の種類に応じて選択する必要があります。</li>
		<li>TSB を含む滅菌マイクロ遠心チューブ用のこの文化の 10 進数のシリアル希薄を実行します。TSA プレート上のカルチャの 100 μ L を広がり、24 h の 37 ° C 好気的でそれを孵化させなさい。</li>
		<li>約 1 × 106 CFU/mL の初期細胞濃度を確保するためコロニー数をカウントします。</li>
		<li>24 h、24 h 滅菌 48 ウェル プレートの井戸を分離後、生菌数計測のためのテスト材料の種類ごとの 4 つのサンプル ディスク後生菌数計測の場所 4 コントロール ディスク。</li>
		<li>各ディスクの表面に菌懸濁液の 150 μ L をピペットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
微生物制御と供試材料を頼り (24 h) 後
	<ol>
<li>4.1.6 のステップの後 24 h 37 ° C で 48 ウェル プレートで残り 4 のサンプル ディスク孵化させなさい好気性。 注: この 24 時間の培養時間は、短いまたは長い時間に成長阻害を研究するために変更できます。</li>
		<li>培養 24 時間後 4 のサンプル ディスクの表面に滅菌 PBS の 850 μ L をピペットし、菌懸濁液の 150 μ L でそれをミックスします。</li>
		<li>48 ウェル プレートから PBS/微生物懸濁液の混合物と各ディスクを収集し、10 mL 滅菌済みチューブにそれらを転送します。</li>
		<li>渦 PBS/微生物懸濁液の混合物および 1 分の各ディスク超音波それ 50 hz 5 分と 1 分実行可能な微生物が残っていないか確認するために再度それは材料の表面に付着する渦。</li>
		<li>TSB を含む滅菌マイクロ遠心チューブ用の熱量の各カルチャの 10 進数のシリアル希薄を実行し TSA プレート上のカルチャの 100 μ L を広げるし、24 h の 37 ° C 好気的でそれを孵化させなさい。</li>
		<li>各サンプルとコントロール ディスク表面に実行可能な微生物の数のコロニーの数を数えます。この数 (CFU/mL) 中の生菌数を表現します。</li>
		<li>サンプルやコントロール ディスクの最終的な微生物文化の写真を撮る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 抗菌結果分析
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> 図 1: 抗菌"halo"の正規化された幅の値。このパネルには、抑制帯 (diz) の直径とディスク直径 (d) が表示されます。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol><li>
拡散解析の結果
	<ol>
<li>抑制帯 (diz) の直径とディスク直径 (d) を測定 (図 1参照) デジタル ノギスで。 注: 抑制ゾーンまたは抗菌「ハロー」が抗菌素材ディスクによって生成される微生物の増殖抑制の結果として形成される (図 1参照)。それは、微生物が正常に成長しているプレートの残りの部分と比較してサンプルに近い透明リング ゾーンがあることを観察することが可能 (不透明帯)。</li>
		<li>式 (1) を適用することによって抗菌各ディスクの"halo"(nwhalo) の正規化された幅を決定します。 (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>各サンプルの抗菌"halo"4 決定nwハロー値の正規化された幅の標準偏差と平均を決定します。</li>
		<li>材料のディスクと最終的な微生物文化の写真を撮る。 注記: 抑制ゾーン (diz) の直径とディスク直径 (d) も測定できます 5.1.4 の手順で適切な画像処理ソフトウェアを使用して撮影した写真から。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
接触解析結果
	<ol>
<li>式 (2) によると回復可能な微生物の数を決定します。 (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> メモ: ここでは、 Nは試料; あたり cm2あたり回復可能な微生物の数Cはプレート カウント;Dは希釈係数;サンプル ディスク径決定 cm2で試験片の表面積です。</li>
		<li>式 (3) を適用することによって細胞の成長の抑制を反映するように生存 (LV) の損失を決定します。 (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> 注: ここでは、C 実行可能な微生物 (N) の数の平均値にある CFU/mL•cm2、24 h; 後コントロール標本から回復S は、CFU/mL•cm2, 24 時間後に試験片から回復可能な微生物 (N) の数です。</li>
		<li>平均値と標準偏差の各サンプルの 4 決定LV(%)値を持つ実行可能性の損失を決定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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2 既存手法に基づく 2 補足のプロシージャから成るこの容易に続くプロトコルによって分析できる新しい材料の抗菌性: 寒天ディスク拡散テスト38と抗菌活性測定ISO 22196:2007 ノルム39によると材料の表面。
この研究分野の文献で報告されている抗菌テストの多くは試金に強く依存しています。したがって、それは非常に詳細を持っていることが重要と一貫性のあるプロトコルが研究室。この記事は、その方向にステップです。さらに、多くの研究者がこの分野で経験の少ない、正確な結果を得るのために詳細なステップバイ ステップの手順を必要とするため非常に参考になるかも。
このプロトコルは、10 mm 径のディスク形状に切断材料の多くの種類で使用できます。脆性材料は、1 h 切削加工を容易にするための適当な溶剤で腫れすることができます。したがって、アルギン酸など親水性材料をオートクレーブ蒸留水で水和することができます。それらを切断する前に、1 h の疎水性材料をうねりにエタノール、ケトン、ジクロロ メタンなどの他の溶媒を用いることができます。ただし、poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) などのいくつかの材料を必要はありません、彼らは直接切ることができます。その後、真空オーブンでサンプル素材ディスクを乾燥し、エタノールと紫外線 1 h 汚染危険を避けるために各試料を滅菌することが重要です。
このプロトコルでは、微生物の広い範囲に到達する 3 微生物の純粋培養の培地使いとして TSA と TSB をお勧めします: グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌、大腸菌、グラム陰性の細菌カンジダ酵母。ただし、代替文化メディアと異なる培養条件を必要と他の微生物もこのプロトコルで使用する。時に、新素材の抗菌活性の最初のアイデアを持っているだけ 1 微生物がテストされます。
微生物の種類は、メチシリン耐性表皮ブドウ球菌(MRSE) などの抗生物質耐性病原体に対してテストすべき異なる推奨 3 に対して強い抗菌活性を示す物質をこのプロトコルで正常に利用されています。多くの懸念を引き起こしている他の重要な耐性菌、グラム陰性菌のとバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)、グラム陽性のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)緑膿菌40,41。
このプロトコルでは、バイオ フィルム抑制と他の種類のウイルスや寄生虫などの微生物に対する材料の抗菌性をテストできません。ただし、このプロトコルは、先端材料の新しい抗菌薬の研究のための非常に有用な出発点を提供します。
抗菌寒天ディスク拡散テストの重要なステップは、サンプル ディスクが寒天メディアとの接触を得るとすぐいくつかの材料を折るためにプレートのセンターに配置する必要がある場合に発生します。この場合、慎重にこのサンプルを展開する滅菌ピンセットのペアを使用することをお勧めします。その一方で、連絡方法コントロールを洗浄することが重要、サンプル ディスク非常によく続いて活発なボルテックスと超音波がない実行可能な微生物を確保するために 4 回それらをピペッティングで PBS で残ります材料に付着表面。
このビデオのプロトコルは、バイオ プロセス工学、組織工学、ドラッグデリバリー制御、包装材、排水処理、農業、生体材料を使用するなど、多くの工学アプリケーションで活用できる、高望ましいの抗菌能力。
このプロトコルにより得られた結果は定性的な (画像) ・定量 (抗菌「ハロー」と実行可能性の損失の正規化された幅) (平均 ± 標準偏差) の再現性の良い分析。異なる材料を比較すると、拡散と接触解析結果で得られたこれらの平均値は続いてトルコのホックの記事の分析、場合は、統計学的に有意を検討するために一方向の分散分析によって分析されなければなりません。異なる (p < 0.01)。

インプラントの失敗はしばしば抗菌薬の予防投与と無菌作業条件にもかかわらず発生する微生物の感染症の結果です。この問題は非常に高い医療費を引き起こして、患者1の間で悲惨です。黄色ブドウ球菌などの細菌現在カテーテルと他の医療用インプラントに関連する院内感染に非常に危険な病原体と見なされると、医療機器2の主な汚染物質が重要。したがって、新規抗菌戦略の開発は、毎日、医療用途のため緊急必要です。
抗生物質3、4アンモニウム化合物、酸化物5、抗菌ペプチド (アンペア)6などの抗菌剤。抗生物質は、細菌の抵抗7、抗生物質の過剰使用8上昇上にあるために効率が徐々 に。第四級アンモニウムは、ため微生物抵抗9のみ短期使用のため非常に効率的です。金属イオン ・酸化は非常に効果的な抗菌剤として長い間利用されてきた、包帯、水フィルター、塗料など10、11,12を含む多くの一般的な商用製品で使用されます。ただし、これらの種類の化合物が哺乳類細胞13のいくつかのタイプに有毒であることが実証されています。
アンプは、優れた抗菌、免疫調節特性14,15, を示し細菌16それらに対して抵抗を開発する非常に困難に見つけるように見えます。ただし、純粋なアンプを生成するプロセスは高価です;そのため、大量生産ではありません。このように、アンプの生産に問題がされているカウンターに戦略開発 (例えば、小さな分子抗菌 peptoid 模倣17、ペプチド18α-ペプチド19および β-ペプチド20)。メタクリル酸終わったポリペプチドおよび polypeptoids は、抗菌、防汚のコーティングのための21の合成されています。
純粋に材料などの新規抗菌薬の開発やハイブリッド フォーム、予防し、多剤耐性感染症を治療することがますます必要です。組織やバイオ エンジニア リングなど多くの工学分野のための新しい先端材料の広い範囲は、いくつかの方法を通じて最後の十年に化学と物理性の向上と開発されている: プラズマ重合の接ぎ木疎水性基材22,23,24、架橋密度25,26の仕立て、ソリューション27,28,29の重合,30、ポロジェン解散31,32, グラフェン酸化物 (GO)33,34,35,36などのナノ材料の採用によって、炭素ナノファイバー (Cnf)37。
これらの新しい材料の抗菌能力の研究の潜在的なバイオ エンジニア リングの適用性を高めることができる指数関数的に不可欠となっています、したがって、.このような新しい材料の抗菌性を定量化する容易に続くプロトコルを提案します。ここでは、サンプル準備の後 2 つの相補的な方法を続いている: 最初は寒天ディスク拡散テスト38 (拡散法) に基づいて、2 番目の抗菌活性を測定する ISO 22196:2007 ノルム39に基づいて材料表面 (連絡方法)。

<table><tbody><tr><td>円筒形パンチ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>直径10mm</td></tr>の<tr><td>シャーレ</td><td>ソリアgenlab</td><td>P101</td>、<td>直径90mm、滅菌</td></tr><tr><td>トリプシン大豆寒天培地(TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>脱水培地500g(粉末)</td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス(TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>脱水培地500g(粉末)</td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td>EUTOTUBO300200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機チューブ</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, 滅菌</td></tr><tr><td>済み エタノール</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>無菌エタノール</td></tr><tr><td>滅菌済み 48ウェルプレート</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>蓋付き平底、組織培養処理済み、非発熱性、ポリスチレン</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>ブラウン</td><td>24612036</td><td>歯なし</td></tr><tr><td>滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)。</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ接続式真空オーブン</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W ランプ UV-C 放射線</td></tr><tr><td>クラス II 生物学的安全キャビネット</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Macherey-Nagel, ドイツ</td><td>ナノカラー UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>アルコールバーナー</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>クラスIIの生物学的安全キャビネット内で滅菌が必要な場合</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ザルトリウス・ステディム</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>デジタルキャリパー</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>セロジカルピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11</td><td>25 mL、滅菌血清</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL、滅菌セ</td></tr><tr><td>ロジカルピペット</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL、滅菌</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L、プラスチック 20-200 &micro;L</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000, 200-1000 &micro;L</td></tr><tr><td>マイクロピペット&nbsp;</td><td>ギルソン</td><td>FA10016</td><td>ピペットマンL P12X300L、20-300&micro;L</td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &L</td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &micro;L</td></tr><tr><td>滅菌済みチューブ&nbsp;</td><td>インスラブ</td><td>301402</td><td>10mL&nbsp;</td></tr><tr><td>フォトカメラ</td><td>キヤノン EOS 5D</td><td></td><td>高解像度のカメラも活用できます</td></tr><tr><td>グラム陽性菌 黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus</td><td></td><td>&nbsp;V329</td><td>Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),&nbsp; 2888&ndash;2896 (2001)</td></tr><tr><td>グラム陰性菌 Escherichia coli</td><td>Colecci&oacute;n エスパ&ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 101</td><td></td></tr>酵母<tr><td>カンジダアルビカンス</td><td>Colecci&oacute;n エスパ&ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 1394</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計-キュベット</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>ドリガルスキーヘラ</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>滅菌済み、使い捨て&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラス球(直径2mm)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>オートクレーブ可能、Drigalskiスパチュラの代替装置</td></tr><tr><td>オートクレーブバッグ</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>微生物残留物や汚染された材料を滅菌するには</td></tr><tr><td>電子ピペット充填装置</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>ISOスレッド付きラボボトル、目盛り付き、ホウケイ酸 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL、オートクレーブ用培養培地</td></tr><tr><td>ISOスレッド付きラボボトル、目盛り付き、ホウケイ酸 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL、オートクレーブ</td></tr>用、<tr><td>ISOスレッド付きラボボトル、目盛り付き、ホウケイ酸 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL、オートクレーブ用培養培地</td></tr><tr><td>ISOスレッド付きラボボトル、目盛り付き、ホウケイ酸 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL、オートクレーブ培養培地用</td></tr><tr><td>ラテックス手袋</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>滅菌用インジケーターテープ</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>含浸紙を含浸させた粘着テープで、滅菌プロセスにさらされると色に変わります。</td></tr><tr><td>万能試験管ラック</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>遠心分離管を保持するため</td></tr><tr><td>微量遠心管ラック</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>微量遠心チューブを保持するため</td></tr><tr><td>滅菌ループ</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 & マイクロ;微生物培養能力のL&nbsp;</td></tr><tr><td>材料 M1</td><td>Universidad Cat&oacute;リカ・デ・バレンシア・サン・ビセンテM&aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料タイプ 1&nbsp;</td></tr><tr><td>材料 M2</td><td>Universidad Cat&oacute;リカ・デ・バレンシア・サン・ビセンテM&aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料タイプ 2&nbsp;</td></tr><tr><td>材料 M3</td><td>Universidad Cat&oacute;リカ・デ・バレンシア・サン・ビセンテM&aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料 type3</td></tr><tr><td>材料 M4</td><td>Universidad Cat&oacute;リカ・デ・バレンシア・サン・ビセンテM&aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>材料タイプ 4&nbsp;</td></tr><tr><td>材料C</td><td>Universidad Cat&oacute;リカ・デ・バレンシア・サン・ビセンテM&aacute;rtir(UCV)</td><td></td><td>制御材料</td></tr></tbody></table>

バイオ エンジニア リング アプリケーション用先端材料の抗菌特性

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

強化されたプロパティを持つ新しい材料の開発バイオ エンジニア リング アプリケーションの広い範囲で重要となっています。したがって、医用生体組織工学、ドラッグデリバリー制御などに必要な特定の環境を模倣する多くの新規の生体材料をデザインされています。細胞や酵素の固定化のための改良された特性を持つ素材の開発は、バイオ プロセス工学の現在の研究テーマもです。ただし、これらのアプリケーションで材料の最も望ましい特性の 1 つは任意の望ましくない感染症を避けるために抗菌薬の容量です。これは、(i) 寒天ディスク拡散テスト (拡散法)、(ii) (接触部材表面の抗菌活性を測定する ISO 22196:2007 ノルムに基づく材料の抗菌性の特性の容易に続くプロトコルを提案します。メソッド)。このプロトコルは、微生物の広い範囲をカバーするグラム陽性およびグラム陰性の細菌と酵母を使用して実行する必要があります。例として 4 材料別の化学的性質は、カンジダ大腸菌、黄色ブドウ球菌に対してこのプロトコルを次テストされます。これらのテストの結果は、最初の材料と他の 3 材料のグラム陽性およびグラム陰性菌に対して抗菌活性を増加のため非抗菌活動を展示します。ただし、4 の材料のどれもカンジダの成長を阻害することができます。

例として、このプロトコルを用いて、微生物を推奨、3 に対して異なる化学的性質を持つ 4 材料の抗菌能力をテストするため:黄色ブドウ球菌大腸菌カンジダ ・ アルビカンス.それはコントロール ディスク (C、イメージ表示されません) で発生した、寒天ディスク拡散実験 (拡散法) の結果展示 (M1) の最初の物質の非抗菌活性とグラム陽性およびグラム陰性菌に対して抗菌活性を増加M2、M3 および M4 (図 2参照) 他の 3 材料の細菌。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> 図 2: 抗菌拡散メソッドの結果。このパネルは培養 24 時間後 4 材料 (M1、M2、M3、および M4) ディスクの (x 1 mm 厚さ 10 mm 径) S の黄色ブドウ球菌と大腸菌に対して抗菌拡散メソッドを示しています。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
図 3では、正規化された幅が異なる抗菌"halo"(nwハロー) 材料のため別の例 M1、M2、M3、および M4 グラム陽性およびグラム陰性菌に対して式 (1) で計算を示しています。ただし、4 の材料のどれもは酵母カンジダ(画像表示されません) の成長を阻害することができた。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> 図 3: 抗菌拡散"halo"結果。このパネルは培養 24 時間後ディスクごとに材料 (M1、M2、M3、および M4) (厚さ 1 mm x 直径 10 mm) S の黄色ブドウ球菌と大腸菌に対して正規化された"halo"(nwhalo) を示しています。違いが統計的に有意 (p &lt; 0.01)。しかし、M1 のサンプルは、抗菌活性を起こしません。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
連絡方法の結果はまた、コントロール ディスク (C) で陽性や他の 3 材料 (参照のグラム陰性菌に対する抗菌活性の増加に発生した (M1) の最初の物質の非抗菌活動を展示図 4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> 図 4: 抗菌メソッドの結果を連絡します。このパネルでは、黄色ブドウ球菌と大腸菌(希釈率 10-4) 培養 24 時間後 4 材料 (M1、M2、M3、および M4) 表面の抗菌活性アッセイの ISO 22196:2007 によるとそれぞれ 90 mm 平板を示しています。Cは培養 24 時間後コントロール ディスクからリカバリを実行可能な細菌です。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
このプロトコルで示されているように、生存率 (%) の損失は式 (2) と (3) によって決定された (図 5参照)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> 図 5: 接触法による生存率の損失。このパネルは、材料の表面に、M1、M2、M3、および M4黄色ブドウ球菌と大腸菌に対しての生存率 (%) の損失を示しています。サンプルの M1 は、抗菌活性を起こしません。<a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ただし、4 材料のどれもはどちらか (画像表示されません) 接触法による酵母カンジダの成長を抑制することができた。したがって、これらの 4 材料の 3 グラム陽性およびグラム陰性菌に対して抗菌陽性を示した、従って非常に高い抗菌活性要件を持つ多くのバイオ エンジニア リング アプリケーションの役に立つかもしれない。ただし、4 材料のどれもは、酵母の成長を阻害することができた。

先端材料の抗菌性の特性のためのプロトコルを提案します。お互いを補完する 2 つの方法によって材料表面に抗菌活性を測定するここでは、: 1 つは寒天ディスク拡散テストに基づいており、他の ISO 22196:2007 ノルムに基づく標準的な手順です。

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

この方法は、多くのバイオエンジニアリングアプリケーションにとって非常に望ましい抗菌特性など、材料工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法は、ラボ間で一貫したプロトコルとして利用することができ、正確な結果を得るために詳細なステップバイステップの手順を必要とする経験の浅い研究者を支援します。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、抗菌薬のプロトコルを探し始めたときで、文献にこれに関する詳細なプロトコルがないことに気づきました。この研究では、化学的性質の異なる4つの先端材料と対照材料について、抗菌活性について試験します。各材料を直径10mmの円盤に切断して準備します。次に、各試料を70%エタノールに10分間浸漬し、続いて紫外線を片側1時間浸して滅菌します。3つの異なる微生物を使用して、先端材料の抗菌活性をテストします。グラム陽性菌は黄色ブドウ球菌、グラム陰性菌は大腸菌、酵母はカンジダ・アルビカンスです。滅菌綿棒を使用して、滅菌遠心チューブに含まれる25 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)に各微生物のいくつかのコロニーを再懸濁します。1分間渦巻き、均一な混合を実現します。分光光度計を使用して、各微生物培養物の540nmでの吸光度を測定します。各微生物の濃度を適切なコロニー形成単位数、またはミリリットルあたりのCFU数に調整します。微生物懸濁液を5秒間ボルテックスして微生物の分散を改善し、滅菌綿棒をこの微生物懸濁液に短時間浸します。培養物を含むチューブ壁に綿棒を押し付けて、綿棒から余分な液体を取り除きます。滅菌綿棒を使用して各微生物ブロス懸濁液をトリプシン大豆寒天培地またはTSAプレートの表面に均等に縞模様にして、表面全体を微生物で覆います。接種後5分間プレートを乾燥させます。微生物ブロス懸濁液をベンチトップに置いておき、後で微生物懸濁液の濃度と純度を確認します。ピンセットを96%エタノールの入ったビーカーに浸し、アルコールバーナーで火をつけて滅菌します。滅菌ピンセットを使用して、テストするサンプルディスクをTSAプレートの中央に配置します。TSAプレートを逆さまにして摂氏37度で24時間インキュベートします。拡散試験結果を解析するには、デジタルキャリパーで阻害ゾーンの直径とサンプルディスクの直径を測定するか、写真を撮って適切な画像処理ソフトウェアを使用します。この手順は、先に決定した微生物濃度が正しいことを確認し、微生物環境汚染がないことを確認するために必要です。適切なオートクレーブ処理されたチップと無菌条件を備えたマイクロピペットを使用して、滅菌TSBを滅菌マイクロ遠心チューブに分注します。ネガティブコントロールとして利用されるサンプルを含めます。TSAプレートのストリーキングに以前に使用した微生物ブロス懸濁液を使用して、6つの小数点以下の段階希釈を実行します。滅菌済みのDrigalskiスパチュラを使用して、選択した各希釈液をTSAプレート上に100 l広げます。ネガティブコントロールとして、微生物を含まないTSB培地100 lをTSAプレートに広げます。TSAプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、コロニーの数を数えて、ミリリットルあたりのCFUが以前に決定したものと類似していることを確認します。ネガティブコントロールプレートをチェックして、微生物による環境汚染がないことを確認します。この手順は、TSBで試験するさまざまな微生物を、摂氏37度のオービタルシェーカーで一晩培養することから始めます。翌日、各一晩培養物のOD540を測定し、次いで、50mLの滅菌済み遠心分離管内の20mLのTSBで各培養物を1ミリリットルあたり約10〜6CFUの濃度に希釈する。各タイプの材料を4枚のディスクと4枚のコントロールディスクを、滅菌済みの48ウェルプレートの別々のウェルに入れます。150リットルの微生物懸濁液を各ディスク表面にピペットで固定します。プレートを摂氏37度のインキュベーターで24時間インキュベートします。48ウェルプレートを24時間インキュベートした後、4つのサンプルディスクと4つのコントロールディスクの各表面に850 lの滅菌PBSをピペットで移し、微生物懸濁液と混合します。各PBS微生物懸濁液混合物と各ディスクを48ウェルプレートから収集し、15 mLの滅菌済みチューブに移します。PBS微生物懸濁液混合物とディスクを1分間ボルテックスします。50Hzで5分間超音波処理し、再び1分間ボルテックスして、生存可能な微生物が材料表面に付着していないことを確認します。超音波処理された培養物およびTSBを含む滅菌微量遠心チューブの10進数連続希釈を行います。各希釈液100 lをTSAプレート上に広げ、プレートを摂氏37度で24時間好気的にインキュベートします。24時間後、コロニーの数を数え、この数をミリリットルあたりのCFUで表します。次に、接触方法の結果は、テキストプロトコルに記載されているように分析されます。寒天円盤拡散試験の結果は、最初の材料で非抗菌活性を示し、他の3つの材料で黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する抗菌活性が増加していることを示しています。このグラフは、インキュベーションの24時間後の黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する各材料ディスクの正規化されたハローを示しています。接触法の結果は、最初の材料に対する非抗菌活性、および他の3つの材料に対するグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する抗菌活性の増加も示しています。Cは、インキュベーションの24時間後にコントロールディスクから回収された生菌です。このグラフは、材料表面上の黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する4つの材料の生存率の損失を示しています。サンプルM1は抗菌活性を示さなかった。ここには示されていませんが、4つの材料のいずれも、他の方法で酵母であるカンジダ・アルビカンスの成長を阻害することはできません。このビデオを見れば、これら2つの補完的な方法による抗菌活性の測定方法について十分に理解できるはずです。

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バイオエンジニアリングアプリケーション用先端材料の抗菌特性

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