バイオ エンジニア リング アプリケーション用先端材料の抗菌特性
August 4th, 2018
先端材料の抗菌性の特性のためのプロトコルを提案します。お互いを補完する 2 つの方法によって材料表面に抗菌活性を測定するここでは、: 1 つは寒天ディスク拡散テストに基づいており、他の ISO 22196:2007 ノルムに基づく標準的な手順です。
この方法は、多くのバイオエンジニアリングアプリケーションにとって非常に望ましい抗菌特性など、材料工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法は、ラボ間で一貫したプロトコルとして利用することができ、正確な結果を得るために詳細なステップバイステップの手順を必要とする経験の浅い研究者を支援します。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、抗菌薬のプロトコルを探し始めたときで、文献にこれに関する詳細なプロトコルがないことに気づきました。
この研究では、化学的性質の異なる4つの先端材料と対照材料について、抗菌活性について試験します。各材料を直径10mmの円盤に切断して準備します。次に、各試料を70%エタノールに10分間浸漬し、続いて紫外線を片側1時間浸して滅菌します。
3つの異なる微生物を使用して、先端材料の抗菌活性をテストします。グラム陽性菌は黄色ブドウ球菌、グラム陰性菌は大腸菌、酵母はカンジダ・アルビカンスです。滅菌綿棒を使用して、滅菌遠心チューブに含まれる25 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)に各微生物のいくつかのコロニーを再懸濁します。
1分間渦巻き、均一な混合を実現します。分光光度計を使用して、各微生物培養物の540nmでの吸光度を測定します。各微生物の濃度を適切なコロニー形成単位数、またはミリリットルあたりのCFU数に調整します。
微生物懸濁液を5秒間ボルテックスして微生物の分散を改善し、滅菌綿棒をこの微生物懸濁液に短時間浸します。培養物を含むチューブ壁に綿棒を押し付けて、綿棒から余分な液体を取り除きます。滅菌綿棒を使用して各微生物ブロス懸濁液をトリプシン大豆寒天培地またはTSAプレートの表面に均等に縞模様にして、表面全体を微生物で覆います。
接種後5分間プレートを乾燥させます。微生物ブロス懸濁液をベンチトップに置いておき、後で微生物懸濁液の濃度と純度を確認します。ピンセットを96%エタノールの入ったビーカーに浸し、アルコールバーナーで火をつけて滅菌します。
滅菌ピンセットを使用して、テストするサンプルディスクをTSAプレートの中央に配置します。TSAプレートを逆さまにして摂氏37度で24時間インキュベートします。拡散試験結果を解析するには、デジタルキャリパーで阻害ゾーンの直径とサンプルディスクの直径を測定するか、写真を撮って適切な画像処理ソフトウェアを使用します。
この手順は、先に決定した微生物濃度が正しいことを確認し、微生物環境汚染がないことを確認するために必要です。適切なオートクレーブ処理されたチップと無菌条件を備えたマイクロピペットを使用して、滅菌TSBを滅菌マイクロ遠心チューブに分注します。ネガティブコントロールとして利用されるサンプルを含めます。
TSAプレートのストリーキングに以前に使用した微生物ブロス懸濁液を使用して、6つの小数点以下の段階希釈を実行します。滅菌済みのDrigalskiスパチュラを使用して、選択した各希釈液をTSAプレート上に100 l広げます。ネガティブコントロールとして、微生物を含まないTSB培地100 lをTSAプレートに広げます。
TSAプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、コロニーの数を数えて、ミリリットルあたりのCFUが以前に決定したものと類似していることを確認します。ネガティブコントロールプレートをチェックして、微生物による環境汚染がないことを確認します。
この手順は、TSBで試験するさまざまな微生物を、摂氏37度のオービタルシェーカーで一晩培養することから始めます。翌日、各一晩培養物のOD540を測定し、次いで、50mLの滅菌済み遠心分離管内の20mLのTSBで各培養物を1ミリリットルあたり約10〜6CFUの濃度に希釈する。各タイプの材料を4枚のディスクと4枚のコントロールディスクを、滅菌済みの48ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
150リットルの微生物懸濁液を各ディスク表面にピペットで固定します。プレートを摂氏37度のインキュベーターで24時間インキュベートします。48ウェルプレートを24時間インキュベートした後、4つのサンプルディスクと4つのコントロールディスクの各表面に850 lの滅菌PBSをピペットで移し、微生物懸濁液と混合します。
各PBS微生物懸濁液混合物と各ディスクを48ウェルプレートから収集し、15 mLの滅菌済みチューブに移します。PBS微生物懸濁液混合物とディスクを1分間ボルテックスします。50Hzで5分間超音波処理し、再び1分間ボルテックスして、生存可能な微生物が材料表面に付着していないことを確認します。
超音波処理された培養物およびTSBを含む滅菌微量遠心チューブの10進数連続希釈を行います。各希釈液100 lをTSAプレート上に広げ、プレートを摂氏37度で24時間好気的にインキュベートします。24時間後、コロニーの数を数え、この数をミリリットルあたりのCFUで表します。
次に、接触方法の結果は、テキストプロトコルに記載されているように分析されます。寒天円盤拡散試験の結果は、最初の材料で非抗菌活性を示し、他の3つの材料で黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する抗菌活性が増加していることを示しています。このグラフは、インキュベーションの24時間後の黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する各材料ディスクの正規化されたハローを示しています。
接触法の結果は、最初の材料に対する非抗菌活性、および他の3つの材料に対するグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する抗菌活性の増加も示しています。Cは、インキュベーションの24時間後にコントロールディスクから回収された生菌です。このグラフは、材料表面上の黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する4つの材料の生存率の損失を示しています。
サンプルM1は抗菌活性を示さなかった。ここには示されていませんが、4つの材料のいずれも、他の方法で酵母であるカンジダ・アルビカンスの成長を阻害することはできません。このビデオを見れば、これら2つの補完的な方法による抗菌活性の測定方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、寒天ディスク拡散試験とISO 22196:2007標準手順という2つの補完的な方法を用いて、先進材料の抗菌特性を評価するためのプロトコルを提示します。この研究は、研究者が抗菌特性を効果的に評価するための一貫したプロトコルを提供することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 材料工学
- バイオエンジニアリング
- 微生物学
背景
- 抗菌特性は多くのバイオエンジニアリング応用にとって重要です。
- 既存の文献には、材料の抗菌活性をテストするための詳細なプロトコルが不足しています。
- この研究は標準化された方法の必要性に対応しています。
- 4つの先進材料と対照材料について、その抗菌活性がテストされました。
研究目的
- 材料の抗菌活性を評価するための信頼できるプロトコルを開発すること。
- 経験の浅い研究者に段階的な手順を支援すること。
- 特定の微生物に対する異なる先進材料の効果を比較すること。
使用した方法
- 材料ディスクの準備と滅菌。
- 微生物懸濁液による寒天プレートへの接種。
- 阻害ゾーンのインキュベーションと測定。
- 連続希釈による微生物の生存能の分析。
主要な結果
- 結果は、テストされた材料間で抗菌活性のレベルが異なることを示しました。
- 最初の材料は抗菌活性を示しませんでした。
- 他の材料は黄色ブドウ球菌と大腸菌に対する抗菌活性が増加しました。
- 接触法の結果は、寒天ディスク拡散試験の結果を確認しました。
結論
- 開発されたプロトコルは、抗菌試験のための体系的なアプローチを提供します。
- これは結果の一貫性を確保するために、様々な実験室で利用できます。
- この研究は、バイオエンジニアリング応用における材料特性の重要性を強調しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Antimicrobial characterization of advanced materials is critical for bioengineering applications where infection risk must be mitigated, such as tissue engineering and implantable devices. This protocol provides a standardized, reproducible method to evaluate antimicrobial activity against relevant bacterial strains, supporting early-stage material screening and de-risking. By enabling consistent assessment across laboratories, it aids in the selection of materials with appropriate functional properties for downstream development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of material-induced antimicrobial effects to support hypothesis testing in biomaterial design.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for comparing antimicrobial performance across material candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative inhibition zone and viability loss data for comparative material screening.
- Operational Value: Establishes reproducible assay conditions using standardized microbial suspensions and incubation parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports evaluation of material biocompatibility by assessing resistance to microbial colonization.
- Operational Value: Delivers data to inform go/no-go decisions in material advancement based on infection risk profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling early evaluation of material properties that influence biological interactions, particularly in antimicrobial performance, before progressing to more complex preclinical models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of material properties affecting microbial growth and survival.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for ranking material candidates by antimicrobial efficacy.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as inhibition zone diameter and percent viability loss for comparative analysis.
- Translational Research: Connects material screening to infection risk assessment in biomedical applications.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for antimicrobial evaluation across multiple material development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in material selection by reducing ambiguity in antimicrobial performance.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across research sites and material batches.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted material prioritization, reducing late-stage failure due to infection-related complications.
- Portfolio Impact: Enables data-driven advancement decisions based on infection mitigation potential.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for sterile handling, culture preparation, and CFU quantification.
- Dependent on access to incubators, spectrophotometers, and imaging or caliper tools for zone measurement.
- Necessitates standardized protocols for microbial suspension preparation and dilution to ensure comparability.
- Must account for material-specific variables such as thickness, porosity, and surface chemistry that may affect diffusion or contact efficacy.
- Limited to bacterial and yeast models; does not assess activity against viruses, fungi beyond Candida albicans, or biofilms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Sample Preparation
1:16
Agar Disk Diffusion Test (Diffusion Method)
3:27
Checking of Microbial Suspension Concentration and Purity
4:40
Measurement of Antimicrobial Activity on Material Surfaces (Contact Method)
6:44
Results: The Diffusion Method and the Contact Method Can Test Anti-microbial Activities of Advanced Materials
7:51
Conclusion
