バイオ エンジニア リング アプリケーション用先端材料の抗菌特性

この方法は、多くのバイオエンジニアリングアプリケーションにとって非常に望ましい抗菌特性など、材料工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法は、ラボ間で一貫したプロトコルとして利用することができ、正確な結果を得るために詳細なステップバイステップの手順を必要とする経験の浅い研究者を支援します。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、抗菌薬のプロトコルを探し始めたときで、文献にこれに関する詳細なプロトコルがないことに気づきました。

この研究では、化学的性質の異なる4つの先端材料と対照材料について、抗菌活性について試験します。各材料を直径10mmの円盤に切断して準備します。次に、各試料を70%エタノールに10分間浸漬し、続いて紫外線を片側1時間浸して滅菌します。

3つの異なる微生物を使用して、先端材料の抗菌活性をテストします。グラム陽性菌は黄色ブドウ球菌、グラム陰性菌は大腸菌、酵母はカンジダ・アルビカンスです。滅菌綿棒を使用して、滅菌遠心チューブに含まれる25 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)に各微生物のいくつかのコロニーを再懸濁します。

1分間渦巻き、均一な混合を実現します。分光光度計を使用して、各微生物培養物の540nmでの吸光度を測定します。各微生物の濃度を適切なコロニー形成単位数、またはミリリットルあたりのCFU数に調整します。

微生物懸濁液を5秒間ボルテックスして微生物の分散を改善し、滅菌綿棒をこの微生物懸濁液に短時間浸します。培養物を含むチューブ壁に綿棒を押し付けて、綿棒から余分な液体を取り除きます。滅菌綿棒を使用して各微生物ブロス懸濁液をトリプシン大豆寒天培地またはTSAプレートの表面に均等に縞模様にして、表面全体を微生物で覆います。

接種後5分間プレートを乾燥させます。微生物ブロス懸濁液をベンチトップに置いておき、後で微生物懸濁液の濃度と純度を確認します。ピンセットを96%エタノールの入ったビーカーに浸し、アルコールバーナーで火をつけて滅菌します。

滅菌ピンセットを使用して、テストするサンプルディスクをTSAプレートの中央に配置します。TSAプレートを逆さまにして摂氏37度で24時間インキュベートします。拡散試験結果を解析するには、デジタルキャリパーで阻害ゾーンの直径とサンプルディスクの直径を測定するか、写真を撮って適切な画像処理ソフトウェアを使用します。

この手順は、先に決定した微生物濃度が正しいことを確認し、微生物環境汚染がないことを確認するために必要です。適切なオートクレーブ処理されたチップと無菌条件を備えたマイクロピペットを使用して、滅菌TSBを滅菌マイクロ遠心チューブに分注します。ネガティブコントロールとして利用されるサンプルを含めます。

TSAプレートのストリーキングに以前に使用した微生物ブロス懸濁液を使用して、6つの小数点以下の段階希釈を実行します。滅菌済みのDrigalskiスパチュラを使用して、選択した各希釈液をTSAプレート上に100 l広げます。ネガティブコントロールとして、微生物を含まないTSB培地100 lをTSAプレートに広げます。

TSAプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、コロニーの数を数えて、ミリリットルあたりのCFUが以前に決定したものと類似していることを確認します。ネガティブコントロールプレートをチェックして、微生物による環境汚染がないことを確認します。

この手順は、TSBで試験するさまざまな微生物を、摂氏37度のオービタルシェーカーで一晩培養することから始めます。翌日、各一晩培養物のOD540を測定し、次いで、50mLの滅菌済み遠心分離管内の20mLのTSBで各培養物を1ミリリットルあたり約10〜6CFUの濃度に希釈する。各タイプの材料を4枚のディスクと4枚のコントロールディスクを、滅菌済みの48ウェルプレートの別々のウェルに入れます。

150リットルの微生物懸濁液を各ディスク表面にピペットで固定します。プレートを摂氏37度のインキュベーターで24時間インキュベートします。48ウェルプレートを24時間インキュベートした後、4つのサンプルディスクと4つのコントロールディスクの各表面に850 lの滅菌PBSをピペットで移し、微生物懸濁液と混合します。

各PBS微生物懸濁液混合物と各ディスクを48ウェルプレートから収集し、15 mLの滅菌済みチューブに移します。PBS微生物懸濁液混合物とディスクを1分間ボルテックスします。50Hzで5分間超音波処理し、再び1分間ボルテックスして、生存可能な微生物が材料表面に付着していないことを確認します。

超音波処理された培養物およびTSBを含む滅菌微量遠心チューブの10進数連続希釈を行います。各希釈液100 lをTSAプレート上に広げ、プレートを摂氏37度で24時間好気的にインキュベートします。24時間後、コロニーの数を数え、この数をミリリットルあたりのCFUで表します。

次に、接触方法の結果は、テキストプロトコルに記載されているように分析されます。寒天円盤拡散試験の結果は、最初の材料で非抗菌活性を示し、他の3つの材料で黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する抗菌活性が増加していることを示しています。このグラフは、インキュベーションの24時間後の黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する各材料ディスクの正規化されたハローを示しています。

接触法の結果は、最初の材料に対する非抗菌活性、および他の3つの材料に対するグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する抗菌活性の増加も示しています。Cは、インキュベーションの24時間後にコントロールディスクから回収された生菌です。このグラフは、材料表面上の黄色ブドウ球菌および大腸菌に対する4つの材料の生存率の損失を示しています。

サンプルM1は抗菌活性を示さなかった。ここには示されていませんが、4つの材料のいずれも、他の方法で酵母であるカンジダ・アルビカンスの成長を阻害することはできません。このビデオを見れば、これら2つの補完的な方法による抗菌活性の測定方法について十分に理解できるはずです。