三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

すでにご存知のように、腫瘍微小環境はがんの増殖と浸潤に不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するには、生物学的に関連するヒト腫瘍マトリックスが必要です。これは、インビトロ浸潤アッセイに基づく唯一のヒト腫瘍マトリックスである。

古典的なスフェロイドアッセイと比較して、この方法は温度感受性ではなく、スフェロイド伝達を必要としない。この技術は、頭頸部癌などの患者由来の固形癌サンプルに適しており、化学放射線療法を含む個別化医療に向けて拡張することができる。このヒト腫瘍ベースのマトリックスは、ハイスループット薬物検査、生細胞分析、創傷治癒、転写アッセイなど、いくつかの用途に既に使用されています。

最も技術的に敏感なステップは、フィブリノーゲンのメソッドの取り扱いが追加されるので、最初に空の井戸でこのステップを練習することができます。行列の適切な処理を示すことは重要であり、メソッドを視覚的に表示することで分析が容易です。多細胞腫瘍スフェロイド生成の場合、完全培地の50マイクロリットルの細胞株から目的の細胞株から3番目の細胞に1回10回分配し、96ウェル超低付着ラウンドボトムプレートの各ウェルに入れます。

その後、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素細胞培養インキュベーターに4日間置き、反転顕微鏡で腫瘍回転楕円体形成を視覚的に確認します。3次元スフェロイド浸潤アッセイを設定するには、氷の上にヒトマイマ由来マトリックスを解凍し、37°Cの水浴でフィブリノーゲンストック溶液を解凍します。試薬が温まったら、完全な培地、ヒトマイマ由来マトリックス、トロンビン、アプロチニン、フィブリノーゲンの適切な量を混合し、マトリックス混合物を細胞に分配する直前にフィブリノーゲンを添加します。

得られたゲルの50マイクロリットルを直ちにスフェロイド培養板の各ウェルに加え、先端を各ウェルの内壁に向け、細心部から回転楕円体を動かさずにピペットを減速させる。フィブリノーゲンは数分後にゲル化し始めるので、堅牢だが正確なリバースピペット化と一度に少数の井戸の治療が必要です。プレートを細胞培養インキュベーターに30分間戻し、ヒトマイマ由来マトリックスフィブリンゲルを固化させてから、各ゲルの上部に完全な培地の100マイクロリットルを静かに添加します。

その後、毎日スフェロイドの侵入を画像化します。ilastik によるイメージセグメンテーションの場合は、オープンソースの画像分類およびセグメンテーションソフトウェアを開き、ピクセル分類ワークフローを選択します。ilastik プロジェクトをコンピューターに保存します。

ピクセルは、ユーザーが作成した注釈に基づいて分類されます。[入力データ]および[新規追加]をクリックして、解析対象の画像を選択します。機能を選択するには、[機能の選択] および [フィーチャの選択] をクリックします。

該当するボックスをクリックして、対象のフィーチャを選択します。選択したボックスが緑色に変わります。トレーニングの場合は、[トレーニング] をクリックします。

[トレーニング] セクションには、ラベル 1 とラベル 2 の 2 つのラベルが表示されます。いずれかのラベルで背景をマークし、セルにもう一方のラベルを付けます。最初の画像内のすべてのセルと背景にラベルが付いている場合は、現在のビューから次の画像を選択し、画像の 10% がマークされるまでセルと背景をマークし続けます。

次に、[ライブ更新] を選択して、すべての画像を分析します。トレーニングが完了し、ilastik がすべての画像を分析したら、[予測エクスポート] をクリックして[ソース] から [単純なセグメンテーション] を選択します。次に、[エクスポートイメージ設定を選択]から目的の出力ファイル形式を選択し、[すべてエクスポート]をクリックしてラベリングの結果をエクスポートします。

ファイルは元のイメージと同じフォルダにエクスポートされます。エリア解析では、まず元の画像をフィジー ImageJ のスケール バーで開き、解析された画像と同じサイズとサイズを持つ画像を使用します。線の選択ツールを使用して、既知の長さの線を描画し、[解析してスケールを設定]をクリックします。

次に、[既知の距離]フィールドに既知の距離を設定します。適切な単位を設定し、[グローバル]をクリックします。ilastik プラグインをインストールするには、「ヘルプと更新」をクリックし、ImageJ 更新ウィンドウで「更新サイトの管理」をクリックします。

[変更を終了]、[閉じる]、および [変更を適用] の横にある をクリックします。数分後に、情報ウィンドウが表示され、正常に更新されたことを示すメッセージが表示されます。[OK] をクリックして、ImageJ を再起動します。

次に、[プラグイン]、[マクロ]、および [インストール] をクリックして、カウンタを選択します。ijmファイル。次に、[開く] をクリックします。

エリア分析を完了するには、[プラグイン] をクリックしてスクロールして ilastik を選択します。[HDF5 のインポート] を選択し、h5 形式のファイルを選択します。[開く] をクリックし、ルックアップ テーブルを読み込んで適用します。

次に、キーボードの[A]ボタンをクリックすると、その領域がサマリーウィンドウに合計領域として表示されます。本代表的な実験では、転移性喉頭扁平上皮癌細胞株播種の4日後、形成されたスフェロイドにマトリックスを加え、逆顕微鏡で毎日浸潤を監視した。一度埋め込まれると、ヒトマイマ由来フィブリンマトリックス中の細胞は、1日後に急速に侵入し始め、次の2日間にわたってマトリックスに拡張された。

マウス肉腫由来マトリックス中の細胞は周囲のマトリックスに侵入せず、非対称構造を形成した。コラーゲン中の細胞はわずかに浸入したが、マトリックス収縮のために分析が困難になった。いくつかの井戸では、スフェロイドは3日後に消えました。

ここで、ヒトマイマ由来フィブリンマトリックスにおける一次および転移性喉頭扁平上皮癌細胞の浸潤の定量化が示されている。ヒトマイオマ由来フィブリンマトリクススフェロイド浸潤の生細胞解析は、時間の経過とともに他の細胞が続くマトリックス全体の鎖中の細胞の動きを明らかにする。マトリックスをウェルに追加する際には、回転楕円体を中央位置から移動しないように注意してください。

この手順は、照射および癌薬などの特定の分子が侵入に与える影響を研究するために使用することができます。細胞は、その後の研究のために固定され、染色することができる。古典的なマウス肉腫モデルでは、細胞は主に増殖し、浸潤態様は最小限である。

このヒト腫瘍ベースのマトリックスは、浸潤を誘発し、阻害研究をより効率的にする。