三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス
2019年5月7日
腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro 三次元スフェロイドの侵襲アッセイの改善を導入する。このプロトコルは、コンピュータベースの細胞浸潤解析も導入している。
すでにご存知のように、腫瘍微小環境はがんの増殖と浸潤に不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するには、生物学的に関連するヒト腫瘍マトリックスが必要です。これは、インビトロ浸潤アッセイに基づく唯一のヒト腫瘍マトリックスである。
古典的なスフェロイドアッセイと比較して、この方法は温度感受性ではなく、スフェロイド伝達を必要としない。この技術は、頭頸部癌などの患者由来の固形癌サンプルに適しており、化学放射線療法を含む個別化医療に向けて拡張することができる。このヒト腫瘍ベースのマトリックスは、ハイスループット薬物検査、生細胞分析、創傷治癒、転写アッセイなど、いくつかの用途に既に使用されています。
最も技術的に敏感なステップは、フィブリノーゲンのメソッドの取り扱いが追加されるので、最初に空の井戸でこのステップを練習することができます。行列の適切な処理を示すことは重要であり、メソッドを視覚的に表示することで分析が容易です。多細胞腫瘍スフェロイド生成の場合、完全培地の50マイクロリットルの細胞株から目的の細胞株から3番目の細胞に1回10回分配し、96ウェル超低付着ラウンドボトムプレートの各ウェルに入れます。
その後、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素細胞培養インキュベーターに4日間置き、反転顕微鏡で腫瘍回転楕円体形成を視覚的に確認します。3次元スフェロイド浸潤アッセイを設定するには、氷の上にヒトマイマ由来マトリックスを解凍し、37°Cの水浴でフィブリノーゲンストック溶液を解凍します。試薬が温まったら、完全な培地、ヒトマイマ由来マトリックス、トロンビン、アプロチニン、フィブリノーゲンの適切な量を混合し、マトリックス混合物を細胞に分配する直前にフィブリノーゲンを添加します。
得られたゲルの50マイクロリットルを直ちにスフェロイド培養板の各ウェルに加え、先端を各ウェルの内壁に向け、細心部から回転楕円体を動かさずにピペットを減速させる。フィブリノーゲンは数分後にゲル化し始めるので、堅牢だが正確なリバースピペット化と一度に少数の井戸の治療が必要です。プレートを細胞培養インキュベーターに30分間戻し、ヒトマイマ由来マトリックスフィブリンゲルを固化させてから、各ゲルの上部に完全な培地の100マイクロリットルを静かに添加します。
その後、毎日スフェロイドの侵入を画像化します。ilastik によるイメージセグメンテーションの場合は、オープンソースの画像分類およびセグメンテーションソフトウェアを開き、ピクセル分類ワークフローを選択します。ilastik プロジェクトをコンピューターに保存します。
ピクセルは、ユーザーが作成した注釈に基づいて分類されます。[入力データ]および[新規追加]をクリックして、解析対象の画像を選択します。機能を選択するには、[機能の選択] および [フィーチャの選択] をクリックします。
該当するボックスをクリックして、対象のフィーチャを選択します。選択したボックスが緑色に変わります。トレーニングの場合は、[トレーニング] をクリックします。
[トレーニング] セクションには、ラベル 1 とラベル 2 の 2 つのラベルが表示されます。いずれかのラベルで背景をマークし、セルにもう一方のラベルを付けます。最初の画像内のすべてのセルと背景にラベルが付いている場合は、現在のビューから次の画像を選択し、画像の 10% がマークされるまでセルと背景をマークし続けます。
次に、[ライブ更新] を選択して、すべての画像を分析します。トレーニングが完了し、ilastik がすべての画像を分析したら、[予測エクスポート] をクリックして[ソース] から [単純なセグメンテーション] を選択します。次に、[エクスポートイメージ設定を選択]から目的の出力ファイル形式を選択し、[すべてエクスポート]をクリックしてラベリングの結果をエクスポートします。
ファイルは元のイメージと同じフォルダにエクスポートされます。エリア解析では、まず元の画像をフィジー ImageJ のスケール バーで開き、解析された画像と同じサイズとサイズを持つ画像を使用します。線の選択ツールを使用して、既知の長さの線を描画し、[解析してスケールを設定]をクリックします。
次に、[既知の距離]フィールドに既知の距離を設定します。適切な単位を設定し、[グローバル]をクリックします。ilastik プラグインをインストールするには、「ヘルプと更新」をクリックし、ImageJ 更新ウィンドウで「更新サイトの管理」をクリックします。
[変更を終了]、[閉じる]、および [変更を適用] の横にある をクリックします。数分後に、情報ウィンドウが表示され、正常に更新されたことを示すメッセージが表示されます。[OK] をクリックして、ImageJ を再起動します。
次に、[プラグイン]、[マクロ]、および [インストール] をクリックして、カウンタを選択します。ijmファイル。次に、[開く] をクリックします。
エリア分析を完了するには、[プラグイン] をクリックしてスクロールして ilastik を選択します。[HDF5 のインポート] を選択し、h5 形式のファイルを選択します。[開く] をクリックし、ルックアップ テーブルを読み込んで適用します。
次に、キーボードの[A]ボタンをクリックすると、その領域がサマリーウィンドウに合計領域として表示されます。本代表的な実験では、転移性喉頭扁平上皮癌細胞株播種の4日後、形成されたスフェロイドにマトリックスを加え、逆顕微鏡で毎日浸潤を監視した。一度埋め込まれると、ヒトマイマ由来フィブリンマトリックス中の細胞は、1日後に急速に侵入し始め、次の2日間にわたってマトリックスに拡張された。
マウス肉腫由来マトリックス中の細胞は周囲のマトリックスに侵入せず、非対称構造を形成した。コラーゲン中の細胞はわずかに浸入したが、マトリックス収縮のために分析が困難になった。いくつかの井戸では、スフェロイドは3日後に消えました。
ここで、ヒトマイマ由来フィブリンマトリックスにおける一次および転移性喉頭扁平上皮癌細胞の浸潤の定量化が示されている。ヒトマイオマ由来フィブリンマトリクススフェロイド浸潤の生細胞解析は、時間の経過とともに他の細胞が続くマトリックス全体の鎖中の細胞の動きを明らかにする。マトリックスをウェルに追加する際には、回転楕円体を中央位置から移動しないように注意してください。
この手順は、照射および癌薬などの特定の分子が侵入に与える影響を研究するために使用することができます。細胞は、その後の研究のために固定され、染色することができる。古典的なマウス肉腫モデルでは、細胞は主に増殖し、浸潤態様は最小限である。
このヒト腫瘍ベースのマトリックスは、浸潤を誘発し、阻害研究をより効率的にする。
概要
本研究では、ヒト平滑筋腫由来のマトリックスを利用した新しいin vitro 3次元スフェロイド浸潤アッセイを提示し、癌の進行の模倣性を向上させました。この手法により、腫瘍細胞の浸潤分析の改善が可能となり、患者由来の固形癌サンプルへの適用が可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- がん生物学
- 腫瘍微小環境
- in vitro アッセイ
背景
- 腫瘍微小環境は、癌の増殖と浸潤において重要な役割を果たします。
- 癌の進行を正確にモデル化するには、生物学的に適切なヒト腫瘍マトリックスが不可欠です。
- 本手法は、従来のスフェロイドアッセイと比較して、温度感受性が低くなっています。
- 化学放射線療法を含む、個別化医療への応用に適しています。
研究目的
- がん細胞の浸潤を研究するための、ヒト腫瘍マトリックスに基づいたアッセイを開発すること。
- 従来の手法に伴う技術的な課題を最小限に抑えるプロトコルを提供すること。
- ハイスループットな薬剤試験および生存細胞解析を可能にすること。
使用方法
- 超低接着プレートを用いた多細胞腫瘍スフェロイドの作製。
- 浸潤アッセイのためのヒト筋腫由来マトリックスおよびフィブリノゲンの調製。
- 倒立顕微鏡を用いたスフェロイド浸潤の定点観察。
- ilastikを用いたセグメンテーションおよび面積定量化による画像解析。
主な結果
- ヒト筋腫由来のマトリックスにおける細胞は急速に浸潤し、腫瘍挙動の効果的なモデリングが実証された。
- 他のマトリックスとの比較により、明確な浸潤パターンの違いが示され、ヒト由来マトリックスの優位性が浮き彫りとなった。
- 生存細胞解析により、時間経過に伴う動的な細胞移動と浸潤が明らかになった。
- 本手法は、さまざまな治療法が腫瘍浸潤に及ぼす影響を研究するために適応させることが可能である。
結論
- ヒト筋腫由来マトリックスは、がん細胞の浸潤を研究するための強力なプラットフォームを提供します。
- 本アッセイは、がんに対する治療的介入の研究を促進させることができます。
- 本アッセイを正常に実施するためには、適切な取り扱いと手法が極めて重要です。
よくある質問
産業界における重要性
本アッセイは、動物由来の代替品と比較してin vivoの微小環境をより正確に再現するヒト腫瘍由来マトリックスを提供することで、前臨床がん研究における重要なギャップを埋めるものです。これにより、癌浸潤のより予測性の高いモデリングが可能となり、初期創薬におけるターゲットの検証およびメカニズム的なリスク低減を支援します。本プラットフォームは、スクリーニングへの応用やトランスレーショナルな継続性に適しており、特に頭頸部癌や患者由来サンプルに有用です。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ヒトに関連する細胞外マトリックスのコンテキストにおいて標的の機能的な検証を可能にすることで、治療仮説を検証できる。
- 運用の価値：生物学的に適切なシステム内で浸潤表現型を直接観察することにより、メカニズムの曖昧さを軽減する。
- 予測的価値：ヒト腫瘍の挙動を予測するモデルにおいて浸潤を調節する化合物を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物が細胞浸潤に及ぼす影響を定量的に評価するための、標準化され再現性のある3Dシステムを提供します。
- 運用的価値： 温度感受性の低下およびスフェロイドの移送が不要であることから、技術的なばらつきを最小限に抑え、ハイスループットな薬剤試験を可能にします。
- 拡張性： 96ウェル超低接着プレートに対応しており、アッセイの小型化および多条件スクリーニングをサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：ヒト平滑筋腫由来のマトリックスを使用することで、基礎研究で見出された知見を、疾患に関連したシステムでの前臨床検証へと繋げることができます。
- バイオマーカーの整合性：浸潤ダイナミクスの生細胞解析を容易にし、分子シグネチャーや治療反応との相関付けを可能にします。
- リスク調整済みの進展：転移予防における重要な表現型エンドポイントである浸潤抑制を定量化することで、go/no-go決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床有効性試験に至るドラッグディスカバリーの連続的なプロセスに適合しており、特に転移に焦点を当てたプログラムに有用です。
- 探索生物学：ヒト腫瘍微小環境における浸潤因子および経路修飾因子の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：自動解析および化合物プロファイリングに適した、定量的でイメージングベースの読み取り結果を提供します。
- アナリティクス：ilastikおよびImageJを用いて浸潤面積の測定を行い、条件間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒト由来マトリックスを用いて転移の重要なステップをモデル化することで、前臨床研究へと繋げます。
- 企業での再利用：化学放射線療法を含む、さまざまな固形がん種や治療法に適用可能な再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ヒトの腫瘍ストロマを十分に模倣できない非ヒトマトリックスへの依存を減らすことで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：定義されたマトリックス調製プロトコルおよびイメージングワークフローを通じて、再現性と標準化を改善します。
- 戦略的価値：臨床転用性の早期予測を改善し、不十分な転移モデル化による後期段階での失敗を減らすことで、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響：ヒトに関連するシステムにおける浸潤抑制能に基づいた、リスク調整後のリード化合物の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- フィブリンゲルの調製には、3D細胞培養、マトリックス操作、および無菌操作の専門知識が必要です。
- イメージングと解析には、倒立顕微鏡、ilastik、およびFiji ImageJへのアクセスが必要です。
- 位置的なアーティファクトを避けるため、スフェロイド形成とマトリックス分注に関してチーム間での標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適応させる場合は、マトリックスの適合性と浸潤キネティクスの検証が必要です。
- 実用上の制限：フィブリノゲンは急速にゲル化を開始するため、スフェロイドの完全性を維持するには、正確なタイミングでのピペッティングが求められます。
