腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成

ヒト脳腫瘍細胞の培養を取ります。

解離酵素で処理して細胞結合を破壊し、凝集した細胞を分離します。

酵素活性を停止するためにバッファーで洗浄し、細胞生存率を維持するために培地を追加します。

懸濁剤であるメチルセルロースを導入します。

懸濁液を丸底マイクロプレートに移し、インキュベートします。

粘性のあるメチルセルロースは細胞を懸濁状態に保ち、細胞間相互作用を促進してスフェロイドに凝

スフェロイドを生理学的細胞外環境を模倣するコラーゲンマトリックスと混合します。

懸濁液をマイクロプレートに移してインキュベートし、マトリックスがスフェロイドをトラップするゲルを形成できるようにします。

ゲルの上に増殖培地を追加します。

スフェロイド周辺では、腫瘍細胞は細胞間接着を失い、浸潤性表現型を採用します。

これらの細胞はプロテアーゼを分泌してマトリックスを分解し、突起を伸ばして自分自身を固定し、前進してマトリックスに侵入します。

腫瘍浸潤を示すスフェロイドモデルは、分析の準備が整いました。

均一なサイズの腫瘍スフェロイドを生成するには、まず目的の腫瘍細胞培養物を5ミリリットルのPBSで洗浄し、細胞を0.5〜1ミリリットルの解離酵素で処理します。摂氏37度で5分後、4〜4.5ミリリットルのPBSで反応を停止し、分離した細胞を10ミリリットルの完全増殖培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

カウント後、細胞を1×10で再懸濁し、完全増殖培地8ミリリットルあたり6細胞に再懸濁し、2ミリリットルの2%メチルセルロース濃度を添加し、懸濁液を滅菌システム容器に移します。次に、96ウェルの丸い底板の各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加え、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーターに3〜4日間入れます。

浸潤アッセイを実行するには、腫瘍細胞が均一なサイズのスフェロイドを形成したら、各細胞構造を500マイクロリットルのチューブに移し、スフェロイドを200マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。2回目の洗浄後、スフェロイドを100マイクロリットルの新しく調製したコラーゲンマトリックスに注意深く移し、各スフェロイド懸濁液を平底96ウェルプレートの各ウェルの中心に加えます。

摂氏37度で30分間インキュベートした後、各ウェルのゲルの上に100マイクロリットルの完全増殖培地を加えます。

腫瘍細胞浸潤の最良のイメージングのために、すべてのスフェロイドを各ウェルの中心に配置してください。