Name: マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのAAV展開 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶマウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo AAV展開法。rAAVベースのレポーターアッセイにより、エンハンサー活性と局在を迅速に可視化し、神経科学における遺伝子制御メカニズムの理解を深める。

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シーケンシングは、UC Davis DNA Technologies Coreで実施されました。カリフォルニア大学デービス校のLin Tianの研究室には、rAAVパッケージングに関するトレーニングを提供し、AAVヘルパーとrep/capプラスミドを惜しみなく贈ってくれたことに感謝します。この作業はNIH/NIGMS R35GM119831の支援を受けた。

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

このプロトコルは、出生後マウスの脳におけるエンハンサー駆動型導入遺伝子の展開のためのrAAVベースの方法を記載している。この一般化プロトコルでは、候補エンハンサー、最小プロモーター、レポーター遺伝子、および任意のバーコード配列がAAVプラスミド骨格にクローニングされます。これらの実験は、単一の候補エンハンサー配列を用いて、または多数の配列を並行して行うことができる。プラスミドはrAAVにパッケージ化され、生後マウスの脳に送達されます。ウイルスの形質導入を可能にする期間の後、脳が収集され、レポーター遺伝子発現のために画像化されます。構成的に発現したレポーターウイルス(CAG-mRuby3)が注射対照として含まれています。このアッセイを用いて、エンハンサーエレメントがマウス脳におけるEGFPの転写を促進することが示され、 in vivoでのエンハンサー活性が実証されます。
このアッセイのトラブルシューティングと最適化の主なターゲットには、ウイルス力価、注射技術、および形質導入時間枠が含まれます。異なるウイルス力価は、形質導入細胞の密度に強い影響を与える可能性があります...

エンハンサーは、転写因子結合部位として機能するゲノムシス調節要素であり、時空間的に特異的な方法で標的遺伝子の発現を駆動することができます1,2。それらは、異なる細胞型、組織、および発生段階で差動的に活性であり、疾患リスク関連のゲノム変異の基質となり得る3,4。したがって、エンハンサー機能のダイナミクスを理解する必要性は、ゲノミクス内のトランスレーショナルサイエンスアプリケーションと基礎科学アプリケーションの両方で進歩するために重要です。インシリコエンハンサー活性の予測は、エンハンサー能力に関する仮説を生成するための優れたリソースとして役立ち得る5、6。そのような予測されたエンハンサー活性は、機能的活性を完全に理解するために追加の検証および尋問を必要とし得る。エンハンサーレポーターアッセイは、細胞から動物まで、さまざまなシステムでこの目的のために価値があることが証明されています7、8、9。柔軟で費用対効果の高い一過性のin vivoコンテキストでこれらの研究を拡張するために、このプロトコルは、生後マウス脳における異所性レポーター遺伝子の発現を促進する能力について推定エンハンサー配列をテストするためのin vivoAAVベースの方法の使用について説明しています。この一連の方法は、単一の候補配列または並行ライブラリスクリーニングを調べるための有用性があり、基礎研究およびトランスレーショナル研究に関連しています。
この方法は、レポーター遺伝子(ここではEGFP)を有する推定エンハンサー候補DNA配列を単一のプラスミド中で組み合わせ、単独では有意な発現を駆動しない最小限のプロモーターの制御下にある。プラスミドは組換えAAV(rAAV)にパッケージされ、動物モデルに注入されます。ここでの応用は脳へのものであるが、様々なrAAV血清型は、異なる組織型にわたる感染を可能にするので、このアプローチを他のシステムに拡張することができる10。一定期間後、脳を収集し、レポーター遺伝子の発現についてアッセイすることができる。強い発現は、対照と比較して、試験された候補配列が遺伝子の発現を「増強」することができたことを示す(図1)。このシンプルなデザインは、脳内のin vivo でのエンハンサー活性のシーケンスをテストするための簡単で明確なアプローチを提供します。
配列のエンハンサー能力の試験に加えて、この方法は、細胞型エンハンサー活性を決定するための技術と組み合わせることができる。差次的エンハンサー活性を決定するための配列ベースのアプローチでは、DNAおよびRNAシーケンシングの前に細胞型特異的マーカーで細胞を選別することで、Gisselbrechtら11に記載されているように、異なる細胞型が異なるエンハンサー活性を示すかどうかを研究者が判断できます。イメージングベースのアプローチでは、細胞型特異的マーカーと画像を共標識することで、エンハンサー駆動蛍光を示す細胞が目的の細胞型マーカーも表示するかどうかを調べることができます12、13、14、15、16。エンハンサーレポーターアッセイは、エンハンサー能力への影響について、エンハンサーのリスク関連対立遺伝子変異を直接試験することができます。ゲノムワイド関連研究(GWAS)で同定されたリスク遺伝子座の大部分は、ゲノム17の非コード領域にあります。これらのリスク遺伝子座の機能的アノテーション研究は、大部分がエンハンサーとして作用する可能性が高いことを示している18、19、20。インビボでのMPRA展開は、脳におけるエンハンサー活性についてのこれらのリスク関連変異体の試験を可能にすることができる12、21。最後に、異なる時点での送達および収集は、エンハンサーが活性である発達段階への洞察を提供することができる。
エンハンサーレポータープラスミドの設計は多様であり、実験目標に合わせてカスタマイズできます。エンハンサー研究で使用されてきた最小プロモーターには、ヒトβグロビン最小プロモーター22やマウスHsp68最小プロモーター23など、いくつかのオプションがあります。これらのプロモーターは、それらを活性化するためにエンハンサー要素と結合しない限り、低レベルの発現を駆動することが知られている。対照的に、構成的プロモーター要素は導入遺伝子の強い発現を駆動し、ポジティブコントロールまたは堅牢な発現の背景に対するエンハンサー機能の試験に有用である。構成的プロモーターの一般的な選択肢には、CAG、ニワトリβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス即時早期エンハンサー24に由来するハイブリッドプロモーター、またはヒトEF1α25が含まれる。エンハンサーは双方向に働くことが知られているので26、最小プロモーターに対するエンハンサーの向きおよび位置は柔軟である(図2A)。従来のエンハンサー−レポーターアッセイは、エンハンサーをプロモーターの上流に配置し、ライブラリー送達において、シーケンシングリードを試験されたエンハンサー27に関連付けるために、レポーター遺伝子の下流にバーコード配列を含む。しかしながら、エンハンサーは、STARR-seq28で行われているように、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームに配置し、それら自身のバーコード配列として機能することもできる。ここで説明するプロトコルは、STARR-seqアッセイデザインを利用し、候補エンハンサー配列をレポーター遺伝子の3' UTRに配置します。STARR-seqオリエンテーションは、より合理化されたクローニングの利点を提供しますが、従来のアプローチよりもよく理解されておらず、コンストラクト間の可変RNA安定性を誘導する可能性があります。記載された方法は、他の箇所に記載されているクローニングプロセスにわずかな変更を加えるだけで、STARR−seqまたは従来のオリエンテーションのいずれかに容易に適合させることができる27、29。
AAV送達のさまざまな方法を採用して、実験目標に合わせてこの手法をさらにカスタマイズできます(図2B)。このプロトコールにさらに記載される直接頭蓋内注射は、高濃度のウイルスを脳30に直接送達する。これにより、注入部位を中心とした高い形質導入効率が得られ、組織の領域にわたって形質導入細胞の密度を最大化しようとする実験に最適な技術となります。定位注射は、再現性のある局所形質導入のために動物全体の注射部位を標準化するのに役立ちます。頭蓋内注射は、出生後初期の動物で最も簡単です。代替技術として、全身注射は、血液脳関門31を通過することができる血清型を有するAAVを用いて導入遺伝子を送達することができる。尾静脈注射は、ウイルスが体中を循環することを可能にし、多くの組織にわたる一般的な送達を可能にします10。眼窩後注射は、眼の後ろのウイルスを眼窩後洞32に送達する別の全身注射技術である。これは、静脈系から脳へのAAVのためのより直接的な経路を提供し、より多くの末梢血管への注射よりも脳内の形質導入細胞のより高い濃度をもたらす33。
この技術のもう一つの柔軟な側面は、読み出しの方法です。大まかに言えば、オプションはレポーターベースまたはシーケンシングベースとして説明できます(図2C)。GFPなどの蛍光レポーターをコンストラクトのオープンリーディングフレームに組み込むと、候補エンハンサーが発現を促進した形質導入細胞において蛍光タンパク質が発現します。免疫組織化学などの標識およびイメージング技術により、シグナル増幅が可能になります。シーケンシングベースの読み出し技術は、組織から収集されたRNA中の送達された構築物から配列を同定することを含む。最初に送達されたウイルスDNAの量を定量することにより、発現されたRNAと送達されたDNAの比較を使用して、例えば超並列レポーターアッセイ(MPRA)の状況において、試験されたエンハンサー配列が導入遺伝子の発現増加をどの程度促進できるかを決定することができる。MPRAは、これらの技術の強力な拡張を提供して、最大数千の候補エンハンサーの活性を同時にテストし、ゲノミクス研究で広く説明されています12、27、34、35、36。候補エンハンサーのクローニング、パッケージング、デリバリー、およびシーケンシングのステップを個別にではなくバッチで実行することにより、より高いスループットスクリーニングが実現されます。
候補エンハンサーの選択は、柔軟性のための別の機会を提供する(図2D)。例えば、このアッセイは、特定の遺伝子のエンハンサーの同定、目的の非コードDNA領域の機能の確認、またはエンハンサーが活性である特定の細胞型または発生段階の決定に使用できます。一般に、候補エンハンサーの選択は、エンハンサー活性の インシリコ 予測によって駆動される。一般に、 インシリコ 予測には、H3K27ac37 やクロマチンアクセシビリティマッピング38などのエンハンサーの可能性を示すヒストン修飾のChIP-seqが含まれます。最後に、成長している研究分野は、合成的に設計されたエンハンサー要素の機能ベースのスクリーニングであり、エンハンサー配列が機能39 をどのように指示するかの研究と、特定の特性を持つエンハンサーの設計を可能にします40。

<table><tbody><tr><td>10x クエン酸バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A:</td><td>形質転換後のクローンを検証するためのカスタム設計フォワードプライマー。これらのプライマーは、使用したベクターに特異的であり、私たちの実験で使用した特定のベクター用に設計されました。</td></tr><tr><td>5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A:</td><td>形質転換後のクローンを検証するためのカスタム設計のリバースプライマー。これらのプライマーは、使用したベクターに特異的であり、私たちの実験で使用した特定のベクター用に設計されました。</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>VWR</td><td>VWRVN605-500G</td><td></td></tr><tr><td>アスピレーター チューブ アセンブリ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A5177-5EA</td> rAAV 細菌学ペトリ皿<td>の口駆動型送達用</td></tr><tr><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C1389-5G</td><td></td></tr><tr><td>チキン IgY 抗 GFP</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A10262</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM900</td><td>画像はLSM800モデルで撮影されましたが、ツァイスは近年、LSM800に代わるLSM900モデルを発売しました。</td></tr><tr><td>円錐形遠心分離管 15 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>クライオモールド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9806558</td><td>これらの型は、P28マウスの脳に適しています。他のサイズは、より大きな組織または小さな組織により適している場合があります。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>解剖はさみ、4.5インチ</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr>ロ<tr><td>バアンチチキンAlexaFlour-488</td>ジャ<td>クソン免疫研究</td><td>703-545-155</td><td></td></tr>ダル<tr><td>ベッコのPBS 1x</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr>エ<tr><td>ッペンドルフ微量遠心チューブ2.0mL</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>22431048</tr><tr><td>Falcon 丸底チューブ 14 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン染料</td><td>グレインジャー</td><td>F0099-1G</td><td></td></tr><tr><td>ファインディテールペイントブラシセット</td><td>アートブラシ タワー</td><td>B014GWCLFO</td><td></td></tr><tr><td>ギブソン アセンブリ マスターミックス</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed プラスミド マキシ キット</td><td>QIAGEN</td><td>12663</td><td>市販のプラスミド マキシ プレップ キット</td></tr><tr><td>HyClone HyPure 分子生物学グレード 水</td><td>VWR</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>IV バタフライ インフュージョン セット 12" チューブと 25G ニードル付き</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>リントフリーワイ</td></tr>プ <tr><td>LB 寒天</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1425-500</td><td>LB寒天培地用プレミックス</td></tr><tr><td>マクファーソン・バンナス・アイリス・シザー</td><td>インテグラ・ライフサイエンス</td><td>360-215</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>シグマ・ライフサイエンス</td><td>69794-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NEB 安定 コンピテント大腸菌</td><td>NEB</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ゲルとPCRクリーンアップ</td><td>タカラ</td><td>740609.5</td><td>酵素反応用キットクリーンアップとゲル抽出</td></tr><tr><td>OCT培地</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>コールパーマー</td><td>60-100</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>PCRストリップチューブ 0.2mL</td><td>VWR</td><td>490003-692</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ギルソン</td><td>F155005</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10x</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ホットスタート II ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>粉ミルク</td><td>サニーセレクト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロロング ゴールド 退色防止封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmartバッファー</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>PacI、AscI、XmaIによる制限酵素消化用バッファー</td></tr><tr><td>制限酵素:AscI</td><td>NEB</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素:PacI</td><td>NEB</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素:XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SOC伸長培地</td><td>NEB</td><td>B0920S</td><td>形質転換後の回復培地</td></tr><tr><td>ショ糖(RNase/DNase free)</td><td>Millipore Sigma</td><td>033522.5KG</td><td></td></tr><tr><td>TAEバッファー</td><td>Apex</td><td>20-194</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーチューブ</td><td>ギルソン</td><td>F1179941</td><td>蠕動ポンプ用</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1460</td><td>Plasmid mini prep kit</td></tr></tbody></table>

マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのaav展開

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

エンハンサーは、組織および細胞型特異的遺伝子の特異的発現パターンを駆動する多様な転写因子の結合プラットフォームです。ノンコーディングDNAとさまざまなクロマチン状態を評価する複数の手段は、ゲノム中のエンハンサー配列の存在を予測するのに有用であることが証明されていますが、これらの配列の活性を検証し、それらが活性である器官と発生段階を見つけることは労働集約的なプロセスです。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの最近の進歩により、マウス組織への導入遺伝子の広範な送達が可能になり、トランスジェニック動物を必要とせずに in vivo エンハンサー試験が可能になりました。このプロトコルは、それ自体では有意な発現を駆動しない最小限のプロモーターの制御下でEGFPを発現するレポーターコンストラクトを使用して、マウス脳内の候補エンハンサー配列の活性パターンを研究する方法を示しています。AAVパッケージレポーターコンストラクトをマウスの脳に送達し、1〜4週間インキュベートした後、動物を屠殺し、脳切片を顕微鏡で観察します。EGFPは、試験されたエンハンサーが遺伝子発現を開始するのに十分である細胞に現れ、エンハンサーが脳内で活性である位置および発生段階を特定する。標準的なクローニング法、低コストのAAVパッケージング、および拡張AAV血清型と in vivo 送達および標準的なイメージング読み出しのための方法により、これは脳内で遺伝子発現がどのように調節されるかを研究するためのアクセス可能なアプローチになります。

これらの方法を用いて、遺伝子CACNA1C19、49、50の精神医学的リスク関連第3イントロンにおける915bp配列を、出生後マウス脳におけるエンハンサー活性について試験した。この配列は、精神医学的および神経学的リスクSNPs12を中心とした345の候補エンハンサー配列のMPRAで発見され、ここでは一般的な例として特性評価実験について説明します。C57BL/6マウスに、Hsp68最小プロモーターおよび単一の候補エンハンサー配列の制御下でEGFPを含む自己相補性ベクター51としてパッケージ化されたAAV9コンストラクトをP0に注射した(図3A)。追加のマウスに、調節活性を有さないと予測された陰性対照配列を含む構築物を注射した(図3B</str...

このプロトコルは、新規rAAVベースの一過性エンハンサー-レポーターアッセイを記載しています。このアッセイは、マウス脳において in vivo でエンハンサー駆動発現を誘導するために使用することができる。

マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのAAV展開

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

このプロトコルは、エンハンサー配列が発現を駆動できるかどうかだけでなく、身体の特定の部分で発現を駆動できる場所を視覚化できるため、重要です。それは速いです。注入は完了するのに10分もかからず、レポーター遺伝子が発現しているかどうか、どこで発現しているかは、サンプル収集からわずか数日以内に確認できます。クローン作成を開始するには、レポーター構造を選択または設計します。ここで使用される構築物は、hsp68最小プロモーターの制御下で発現されるEGFPレポーター遺伝子の3つの主要な非翻訳領域にエンハンサー候補を配置する。目的の配列を増幅してベクターにクローニングするためのPCRプライマーを設計するには、ギブソンクローニング用の適切な相同性アームをプライマーの5つのプライムエンドに追加します。設計したプライマーを用いて、DNAサンプルからPCRを行う。必要なクローニング反応の数に応じて、Pac1とAsc1を使用して1〜10マイクログラムのベクターDNAを消化します。0.7〜1%ゲル電気泳動を用いて、100ボルトで30〜60分間、制限ダイジェストフラグメントを分離します。直鎖化ベクターのバンドを抽出し、市販のゲル抽出キットで精製します。ギブソンのクローニングと細胞の形質転換が完了したら、細胞を選択培地にプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。レポーター構築物のクローニングが成功したことを確認した後、グリセロールストックを使用して5ミリリットルのスターター培養液を接種します。摂氏30度、毎分180回転の振とうインキュベーターで8〜16時間培養物を成長させます。ブロスが濁ったら、スターターカルチャーを250〜300ミリリットルの新鮮な選択的LBブロスで1, 000倍に希釈し、摂氏30度、毎分180回転で振とうインキュベーターで一晩インキュベートします。市販のプラスミドマキシキットを用いて、プラスミドを精製する。ITRの再結合をテストするには、Xma1消化を実行します。バンドを視覚化します。ダイジェストに予想されるバンド数が表示されていることを確認します。組み換えにより、バンドが予想よりも少なくなります。組換えAAV混合物を送達用に調製する。複数のエンハンサーレポーターウイルスの発現パターンを比較する場合は、各ウイルスを希釈して、ウイルス力価を最も濃度の低いウイルスと同等にします。エンハンサーレポーターウイルスと構成的に発現したコントロールレポーターウイルスを2対1または3対1の比率で混合する。最終濃度0.06%の少量の高速緑色染料を追加しますマイクロリットル目盛り付きキャピラリーチューブから作られたプルドガラスピペットの先端を、繊細で糸くずの出ないワイプにそっと突き刺して壊します。マイクロキャピラリーピペットを保持するためのゴム製ガスケットに接続された圧力適用装置を備えたアスピレーターアセンブリにピペットを挿入します。アスピレーターを通して負圧を加えることにより、約0.2〜0.5マイクロリットルの少量の鉱油をピペットに引き込みます。アスピレーターアセンブリを脇に置き、注入する準備ができるまでウイルスを氷の上に置きます。新生児マウスを凍結麻酔した後、アスピレーターアセンブリを使用して陰圧を加え、半月板が2マイクロリットルの目盛りを通過するまでウイルス混合物をプルドガラスピペットに引き込みます。マウスをコールドチャンバーから離し、ベンチトップに置きます。ラムダとブレグマの中間にある両側注射部位、および矢状縫合糸と各眼を見つけます。アルコールワイプを使用してそれらを消毒します。プルドグラスピペットを使用して新生児マウスの頭蓋骨に穴を開けます。針が頭蓋骨に入ったら、アスピレーターアセンブリを通して陽圧を加えます。1マイクロリットルのウイルスを側脳室に分注し、ピペットを引き出します。マウスを加熱パッドまたは加温室に置いて回復します。目覚めたら、動物を家のケージに戻します。低倍率5倍の主観レンズを使用して脳切片を横断する蛍光画像を記録します。注射部位を特定することにより、赤色蛍光細胞の密度と強度に応じて、ウイルス形質導入の程度を評価します。同様に形質転換された動物を比較します。25倍以上の高倍率対物レンズで蛍光画像を記録します。次に、解析ソフトウェアを開き、3×3のメディアンフィルタを適用してノイズを低減します。[プロセス]メニューをクリックし、[ノイズ]をクリックして、[スペックル除去]オプションを選択します。次に、画像から背景蛍光を差し引くには、マルチチャンネル画像のチャンネルを分離することから始めます。[画像]メニューをクリックし、[カラー]をクリックして、[チャンネルの分割]オプションを選択します。長方形または円の選択ツールを使用して、蛍光セルのない画像の領域に小さな形状を描画します。[分析]、[測定]の順にクリックして背景の平均ピクセル強度を測定し、繰り返して複数回サンプリングします。5 から 8 の背景領域の平均グレー値を平均し、10 進値を削除します。「処理」メニューを選択して画像内の各ピクセルから値を減算し、「数学と減算」をクリックします。次に、減算する背景値を入力し、[OK] をクリックします。必要に応じて、画像メニューを選択してチャンネルをマルチチャンネル画像にマージし直し、「カラー」をクリックして、「チャンネルを結合」を選択します。緑色蛍光細胞の数をカウントするには、緑色チャンネルを非表示にし、自由形状選択ツールを使用して赤色蛍光を発現する脳領域の周囲に形状を描画します。測定機能をクリックして、選択したゾーンの赤チャンネルの面積、積分密度、および平均グレー値を測定します。多点選択ツールを使用して緑色のセルの数をカウントし、赤色のチャネルの積分強度によって緑色のセルの数を正規化します。マウスが陽性のAAV構築物と共にP0で頭蓋内注射したエンハンサーレポーターを形質導入した後、注射後28日目に皮質の中層下層でエンハンサー駆動EGFP発現を示した。P0に陰性対照コンストラクトを注射したマウスは、注射後28日目にEGFPの発現を示さず、エンハンサー要素がマウス脳におけるEGFPの転写を促進することが見出されたことを示している。形質導入に成功した領域と潜在的な変動性の制御を視覚化するために、異なる力価のAAV送達エンハンサーレポーターライブラリを調べました。候補エンハンサーの高力価ライブラリは幅広いEGFP発現を促進し、候補エンハンサーの低力価ライブラリはP7マウス脳におけるまばらなCGFP発現を促進します。活性のないエンハンサーと失敗した送達を区別するために、すべての注射でエンハンサーレポーターAAVとポジティブコントロールを混合することが重要です。この手順は、免疫組織化学、RNA FISH、またはシングルセルRNAシーケンシングと組み合わせて、エンハンサーが活性である細胞タイプを決定することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。...

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

ここでは、脈絡叢の遺伝子発現を選択的に変化させながら、他の脳領域への影響を回避する方法について説明します。...

脈絡叢における遺伝子の標的ノックダウン

ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。...

HEK293浮遊細胞を用いた高収率アデノ関連ベクターバッチの作製(英語)

このプロトコルは、皮質虚血性脳卒中後のNeurod1のウイルス媒介性異所性発現を説明しています。Neurod1は、(1)脳卒中後の亜急性期(7日間)に野生型マウスにCre-Flex...

虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル

本プロトコルは、遺伝子治療のために間葉系幹細胞(MSC)由来の細胞外小胞バイオミメティクスを製造・精製する方法を導入することを目的としています。ナノ小胞はMSC由来の脂質二重層に閉じ込められ、目的遺伝子を保持する組換えAAVを腔内に封じ込めています。このナノベシクルは生 体内...

遺伝子送達の強化を目的とした間葉幹細胞膜包覆ナノ小胞の開発

学ぶマウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo AAV展開法。rAAVベースのレポーターアッセイにより、エンハンサー活性と局在を迅速に可視化し、神経科学における遺伝子制御メカニズムの理解を深める。

マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのAAV展開

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