ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析
2011年8月1日
アン in vivoで方法が記載されている。 CREおよび/または蛍光タンパク質を発現する組換えAAVsは、新生児マウスの脳に注入されています。モザイク遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングは神経回路の発達に重要なプロセスで遺伝子機能の迅速な分析を可能にする、達成されています。
この手順の全体的な目標は、脳の発達の出生後の期間に遺伝子機能を操作することです。これは、まず適切なウイルスを選択して調製し、それらをシリンジに装填し、注射装置を準備することによって達成されます。次に、生まれたばかりのマウスの子犬の脳にウイルスを注入し、最後のステップは動物を犠牲にし、注入された領域を画像化することです。
最終的には、免疫蛍光顕微鏡法により、コントロール細胞とノックアウト細胞の異なる標識を示す結果を得ることができます。この方法は、出生後の発達期間が遺伝的にどのように制御されているかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。注射については、市販のアデノ随伴ウイルス溶液を全力価、典型的には1ミリリットル当たり10〜12番目のゲノムコピーで使用して、多数の細胞を操作することができる。
スパースまたはラベリングが必要な場合は、1〜10の希釈から始めます。氷上でウイルスを解凍した後、直ちに希釈前の容量を滅菌済みの250マイクロリットルPCRチューブに移します。希釈液は氷の上に置いておきます。今。
適切なシリンジを選択し、ローディングニードルに接続して、インジェクションポンプを準備します。次に、シリンジに非常に小さな気泡が見られるまでウイルス溶液を静かに引き上げ、不活性ローディング色素を使用してこのステップを容易にすることができます。次に、シリンジをリテーナーでポンプに固定します。
次に、シリンジとニードルホルダーの間に接続チューブをそっと取り付けます。注射針がニードルホルダーの内側の接続チューブに直接接触していることを確認してください。次に、針の先端に溶液の小さな滴が見えるまで、溶液を結合チューブを通してゆっくりと動かします。
プランジャーをポンプのブラケットでプッシャーブロックの隣に慎重に固定します。注入速度を毎分8マイクロリットルに設定し、注入量を1〜2マイクロリットルに設定します。次に、使用しているシリンジの直径に合わせてポンプのシリンジの直径設定を調整します。
最後に、回復段階で子犬を保護するために、ホットプレートを摂氏38度に設定し、ペーパータオルで覆います。IACUC承認のプロトコルを使用して、P zeroまたはP oneマウスの子犬を冷麻酔にかけることにより、注射用に準備します。数枚のペーパータオルを水で湿らせ、氷の上に置きます。
次に、4〜5匹の子犬をペーパータオルの上にしっかりと分離して置きます。ペーパータオルを子犬の上に折り、ペーパータオルの上に砕いた氷を少量そっと置き、子犬を約5分間孵化させます。子犬は最大15分間氷の上に安全に保管でき、それでも順調に回復します。
次に、麻酔をかけた子犬を取り付けブロックに配置して、注射部位へのアクセスを最適化します。たとえば、皮質は、動物を腹の上に平らに置くことによって最も簡単にアクセスできます。子犬はバンドエイドを使用して所定の位置に固定され、子犬の頭を手動で安定させ、皮膚をしっかりと引っ張って動かないようにすることができます。
次に、ラムダ縫合糸のように頭蓋骨の解剖学的ランドマークをナビゲートし、もう一方の手で再現可能な注入ポイントを選択し、頭蓋骨に針をそっと挿入します。針が頭蓋骨を貫通しにくい場合は、強く押さないでください。代わりに、針の位置を変えて、ゆっくりと再試行してください。
注射の深さは、皮質の個々の動物や株によってわずかに異なり、通常は半分から1ミリメートルの深さで機能します。次に、同僚にポンプを作動させてウイルス溶液を注入し、手の動きを最小限に抑えます。理想的には、注入後にフットペダルを使用してポンプを始動できます。
針を数秒間所定の位置に保持し、その後、子犬の頭を滑らかに保ちます。針を引き出します。次に、蓋付きのホットプレートで子犬を5〜10分間回復させます。
この間、他の子犬に注射を続けてください。子犬がすべてピンク色を取り戻し、動き始めたら、家の寝具の一部で子犬を優しくこすります。そうして初めて、彼らは母親の元に戻ることができます。
そうでなければ、彼らはなじみのない子犬として扱われる可能性があり、子犬が母親に戻された後に母親が殺す可能性が高くなります。シリンジにアセトンまたは70%エタノールを完全に装填して、注入セットアップを清掃します。.サノ、アキュレート、接着剤などのアセトンに敏感な成分を使用している場合は、毎回新しい溶液を使用して、注入セットアップで溶液を数回洗い流します。
これにより、残っているウイルス溶液が除去され、沈殿物、溶媒が蒸発します。セットアップを洗い流した後、漂白剤の作業領域を消毒して、次の実験者の準備を整えます。メンター。成功した技術は、注射部位で強力なニューロン感染症を引き起こします。
皮質や上丘などの特定の領域への注射は、通常、隣接する領域への広がりを最小限に抑えて局所感染を引き起こします。高力価のウイルス溶液を使用すると、海馬などの隣接領域に感染し、低力価のウイルス溶液を注射する可能性が高くなります。正中線での小脳注射のような注射部位の近くに通常、まばらな感染をもたらすため、感染した細胞の数は注射されたウイルス溶液の力価と相関する必要があります。
例えば、異なる蛍光タンパク質を発現する2つのR AAV 8ウイルスの高力価溶液を混合して小脳に注入すると、標識差のある多くのキンジ細胞に感染します。逆に、低力価のウイルス溶液を注入すると、単一細胞の視覚化に役立つまばらな感染が発生する可能性があります。蛍光標識されたニューロンは、新鮮な切断された生体組織で直接観察することも、免疫染色にかけることもできます。
これにより、広視野または共焦点蛍光顕微鏡による後の画像取得のために、内因性蛍光シグナルが増強されます。最後に、RAAV 8は、皮質のさまざまなニューロンタイプに感染し、微細なプロセスの強力な標識を持つことができます
。完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、新生児脳の発達中に遺伝子機能をテストするためのin vivo法について説明しています。これらウイルスを新生子マウスの脳に注入することで、研究者はモザイク遺伝子不活性化と希疎ニューロンラベリングを実現し、神経回路発達における遺伝子機能の分析を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝子機能
- 神経回路の発達
背景
- 新生児脳の発達中の遺伝子機能を理解することは重要です。
- 組換えAAVsは遺伝子発現を操作するのに使用できます。
- この方法は、重要な発達期間中の遺伝子調節の研究を可能にします。
- 免疫蛍光顕微鏡は、コントロール細胞とノックアウト細胞を区別できます。
研究の目的
- 脳の発達の新生児期間に遺伝子機能を操作すること。
- 遺伝的要因が新生児の神経発達をどのように調節するかを調査すること。
- 神経回路形成のメカニズムについての洞察を提供すること。
使用した方法
- 適切な組換えAAVsの選択と準備。
- 新生子マウスの子へのウイルス注入。
- 注入領域のイメージングのための免疫蛍光顕微鏡。
- コントロール細胞とノックアウト細胞の差異ラベリングの分析。
主な結果
- 遺伝子の成功的な不活性化とニューロンのラベリングが達成されました。
- 結果は新生児の発達の遺伝的調節を示しています。
- この方法は将来の神経科学研究のフレームワークを提供します。
- 得られた洞察は神経回路力学の理解に貢献できます。
結論
- この方法は発達中の脳における遺伝子機能の研究に効果的です。
- 結果は神経回路の発達の理解に貢献します。
- 将来の研究は、このアプローチを基に行動への遺伝的影響を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
