Name: 自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぼう、自由に動くマウスの運動皮質におけるマルチチャンネル細胞外記録の手法。軽量マイクロドライブシステムを用いて局所電位とスパイク活動を記録し、行動と神経活動の相関を解析する効率的なプロトコルを習得できます。

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本研究は、中国国家自然科学基金会(31871170、32170950、31970915)、広東省自然科学基金会(2021A1515010804および2023A1515010899)、広東省自然科学基金会大規模栽培プロジェクト(2018B030336001)、広東省助成金:脳疾患治療のための主要技術(2018B030332001)の助成金を受けて行われました。

すべてのマウスを商業的に入手し、室温22〜25°C、相対湿度50%〜60%で12時間の明/12時間の暗サイクル(現地時間午前8:00に点灯)で維持した。マウスは、餌と水を継続的に供給することができた。すべての実験は、華南師範大学の実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って実施され、施設動物倫理委員会によって承認されました。生後3-5ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを用いた。
1. マイクロドライブシステム組立
<ol><li>2つのスタルと可動マイクロドライブを固定するネジを使用して、2つのコンピュータ設計ボードを接続し、コネクタを1つのボードに取り付けます(図1A、Bi-iii)。ネジ(0.5 mm/円)をひねってマイクロドライブを駆動します。</li>
	<li>マイクロドライブがMC領域の両側に8本のガイドチューブ(長さ~3 cm、内径~50 μm、外径~125 μm)を2セット搭載できることを確認し、同じ長さ(少なくとも15 mm; 図1Biv, v)。</li>
	<li>直径35μmのNiクロム線(~5cm)を16本切断し、ガイドチューブに連続して装填し、接着剤を塗布して固定します(図1Bi、vi、vii)。</li>
	<li>ワイヤの絶縁体を剥がし、チャネル マップに従ってコネクタから各ピンに露出した各ワイヤ、基準電極、および接地電極を連続的に撚り合わせ、各ピンに導電性塗料をゆっくりとコーティングします(図 1Bviii-x)。</li>
	<li>エポキシ樹脂を使用してピンを覆い(図1Axi、xii)、インピーダンステスターを介して金メッキを行い、電極チップのインピーダンスを~350kΩに低減します(図1Bxiii、xiv)。インピーダンステスターのパラメータを次のように設定します:-10.08 μAの直流、1秒間、金めっき溶液、5 mM PtCl4を含む。</li>
	<li>最後に、ネジをひねってマイクロドライブを上部に移動します。 図1A に示すように変更したマイクロドライブシステムの全体的なサイズを確認します(長さ約15 mm、幅10 mm、高さ20 mm、重量~1 g)。コンピュータ設計基板と可動部品の詳細な仕様を 図1Ai、ii.で確認する。</li>
</ol>2. 電極アレイの埋め込み
<ol><li>手術キットを滅菌し、滅菌手袋を着用し、手術開始前に医師の滅菌白衣を着用してください。</li>
	<li>痛みを管理するには、誘導チャンバー内のマウスにメロキシカム注射剤(5 mg / kg)の皮下注射を使用します。.次に、誘導チャンバー18,19でペントバルビタール(80 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけます。つま先のつまみ反射がまだ存在する場合は、ペントバルビタール(20 mg / kg / h)の追加用量を適用します。.</li>
	<li>マウスを脳定位固定装置に固定し、温度コントローラーを使用して直腸温度を37°Cに保ちます。</li>
	<li>テトラサイクリン眼軟膏をマウスの両眼に塗布し、手術前に滅菌手袋を再度交換します。</li>
	<li>マウスの毛皮を剃り、先端が滅菌した綿のアプリケーターを使用して、中心から外側に向かって同心円状にベタジンスクラブとアルコールを交互に3回交互に手術部位を消毒します(図2i、ii)。頭蓋骨を露出させるために、小さな正中線切開(~15 mm)を行います。すぐに、痛みを和らげるために1%リドカインを首の筋肉に局所的に塗布します。.次に、ハサミを使用して残存組織を取り除き、生理食塩水でコーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨を洗浄します(図2iii)。</li>
	<li>インクを充填したガラス微小電極を使用して、両側MCの埋め込みに必要な位置に印を付けます(図2iv、v)。以前の研究20に基づくと、両側MCの位置は次のとおりです:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側1.25 mm。</li>
	<li>マイクロドライブシステムを保護するために4本のステンレス鋼ネジ(直径0.8 mm)を埋め込み、すべてのネジを基準電極と接地電極でリンクし、次に混合歯科用セメントで覆って壁を形成します(図2vi-xi)。</li>
	<li>MC領域の調整された頭蓋骨の左側と右側の両方に頭蓋骨ドリルを使用して、2つの小さな穴(~1.5 mm2)を慎重に開けます(図2xii)。左右MCの脳定位座標を使用します:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側1.25 mm、硬膜の腹側0.5 mm。</li>
	<li>細かい鉗子で硬膜を穴から慎重に取り外します(図2xiii)。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロドライブシステムを10 μm/sで穴の中央に挿入します(図2xiv-xvii)。</li>
	<li>マイクロドライブシステムの挿入が終わったら、ワセリンを歯科用セメントの壁に充填します(図2xviii)。</li>
	<li>マイクロドライブシステムの底板と歯科用セメントの壁を混合歯科用セメントで接合します(図2xix)</li>
	<li>切開部を生理食塩水で洗浄した後、リンコマイシン塩酸塩と塩酸リドカインを含むゲルで局所処理を行い、術後の痛みを和らげます。</li>
	<li>導電性銅箔テープを埋め込み型マイクロドライブシステムに巻き付けます(図2xx)。</li>
	<li>マウスを31〜33°Cに保たれたケージに移動し、麻酔からの回復をモニターします。</li>
	<li>マウスを1週間回復させ、別々の給餌を行います。塩酸リンコマイシンと塩酸リドカインを含むゲルを3日間連続して塗布して切開部を確認し、治療します。</li>
</ol>3. 自由動マウスの両側MCにおけるマルチチャンネル記録
<ol><li>目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。少なくとも1日前に、マイクロドライブシステム(図1Aii)の可動部分のネジをひねって、電極アレイ(~0.1mmの深さ)を下に移動します。</li>
	<li>目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。ヘッドステージの中央とヘリウムバルーン(約0.02Lのヘリウム充填)をネジでリンクして、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺します(図3A、B)。</li>
	<li>録音ソフトウェアで30kHzでサンプリングすることにより、記録電極とマルチチャンネルシステムを使用して生信号をキャプチャし、マルチチャンネルシステムからデジタルアナログ(DA)コンバーターを使用してデジタル化します。</li>
	<li>録音ソフトウェアで 10 kHz でリサンプリングして生データから LFP 信号を抽出し、録音ソフトウェアのノッチ フィルターを使用して 50 Hz のライン ノイズを除去します。</li>
	<li>自由に動くマウスから安定した状態で生データを少なくとも60秒間記録します。記録が終了したら、ヘッドステージとマイクロドライブシステム間の接続をゆっくりと取り外し、マウスをホームケージに戻します。</li>
	<li>記録したデータをコンピュータに保存し、オフラインで解析します(図4 、 図5)。</li>
	<li>実験終了後、研究所のガイドラインに従って安楽死を行い、3V出力の電源で電極の位置を確認し、1分間の電解病変を行い、その後組織学的解析を行います。凍結ミクロトームを用いてマウスの脳を30μmのスライスに切断し、MC切片を採取した後、顕微鏡で画像を撮影します(図3C、D)。</li>
</ol>4. スパイクの選別と分析
<ol><li>スパイクソーティングソフトウェアで [File]>[Open > Nev files ]をクリックして、30 kHzでサンプリングされたスパイクデータを開きます(図4Ai)。</li>
	<li>「情報」をクリックしてソートされていないチャネルを選択し、「 ソート」>「ソート方法の変更」>「K-Meansの使用」を選択します。 K-Means Sorting>Valley-Seeking Sorting ボタンを押して、ソートされたユニットを取得します(図4Aii、iii)。</li>
	<li>[File] > [Save as] をクリックし、ソートされたスパイク データをファイル名拡張子 .nev で保存し、[File] > [Export Per-Waveform Data] を選択して、.txtファイル名拡張子で PCA 結果をエクスポートします(図 4Aiv)。</li>
	<li>神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File]>[Import Data > Blackrock File ]をクリックして、ソートされたスパイクファイルを開きます(図4Bi)。</li>
	<li>[ 解析]>[オートコレログラム ]をクリックして、選択したユニットのオートコレログラムを取得し、パラメータを-0.05秒のX最小値、0.05秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bii、iii)。</li>
	<li>ソートされたスパイクデータをロードし、[ Analysis] > Interspike Interval Histograms をクリックしてスパイク間隔ヒストグラムを取得し、パラメータを0秒の最小間隔値、0.1秒の最大間隔値、0.001のBin値に設定します(図4Biv、v)。</li>
	<li>Analysis > Crosscorrelogramsをクリックして、ソートされた2つの単位事象間のクロス相関図を取得し、参照事象とパラメータを-0.1秒のX最小値、0.1秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bvi、vii)。</li>
	<li>[結果] > [数値結果] をクリックして、オートコレログラム、スパイク間間隔ヒストグラム、およびクロス相関図の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図 4Bviii、ix)。データを解析し、グラフを描画します。</li>
</ol>5. LFP分析
<ol><li>神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File][Import Data > Blackrock File ]をクリックして、10 kHzでサンプリングされた連続信号データを開きます(図5Ai)。</li>
	<li>[ Analysis > Spectrum for Continuous ] をクリックして、選択したチャネルからの LFP のパワー スペクトルを解析します。パラメータを次のように設定します:8,192の周波数値の数、3-5の複数のテーパー値、総パワースペクトル密度(PSD)のパーセンテージの正規化、および1Hzから100Hzまでの周波数範囲(図5Aii、iii)。</li>
	<li>[ Analysis > Coherence for Continuous ] をクリックして、MC の左側と右側から 2 つの LFP のコヒーレンスを解析します。 リファレンスチャンネルとパラメータを次のように設定します。 コヒーレンス値、周波数値の数を8,192、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hzから100Hzで計算します(図5Aiv、 v).</li>
	<li>MC の左側と右側から 2 つの LFP 間の相関関係を分析するには 、[Analysis > Corr. with Cont. Variables ] をクリックします。 基準チャンネル(LFPデータ)とパラメータを、X最小値を-0.1秒、X最大値を0.1秒、ビン値を0.001に設定します(図5Avi、 vii)。</li>
	<li>[結果]>[数値結果]をクリックして、PSD、コヒーレンス、および相関の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Aviii、ix)。</li>
	<li>各周波数帯域について代表的なトレースを抽出する必要があるチャンネルを選択し、[連続変数のデジタルフィルタリング>編集]をクリックして各周波数帯域を取得し、パラメータを[Filter Freq. Response as Bandpass]、[Filter Implementation]を無限インパルス応答(IIR)Butterworth、[Filter Order]の値を2に設定します。最後に、対象となる周波数範囲を設定します(図5Bi-iv)。 注:ここで使用された周波数範囲は、デルタ(δ、1-4 Hz)、シータ(θ、5-12 Hz)、ベータ(β、13-30 Hz)、低ガンマ(低γ、30-70 Hz)、および高ガンマ(高γ、70-100 Hz)の発振です。</li>
	<li>データを分析してグラフを描画します。</li>
</ol>6. スパイクとLFPの相関関係
<ol><li>神経生理学的データ解析用のソフトウェアで 、>データのインポート>ブラックロックファイルの ファイルをクリックして、連続信号データとスパイクデータを開きます。</li>
	<li>[Analysis] > [Coherence Analysis] をクリックして 、選択したチャネルのスパイクと LFP の間のコヒーレンスを解析します。参照変数(スパイクタイミング)とパラメータを次のように設定します:コヒーレンス値、周波数値の数を512、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hz〜100Hzで計算します(図5Ci、ii)。</li>
	<li>[結果]>[数値結果]をクリックして、スパイクフィールドの一貫性の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Ciii、iv)。</li>
	<li>データを分析してグラフを描画します。</li>
</ol>

マウスの運動皮質における細胞外電気生理学的記録

<ol><li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+cortical+activity+and+its+putative+role+in+information+processing+and+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning.</a> Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).</li>
<li>Arroyo-García, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spike-gamma+coupling+of+area+CA3+fast-spiking+interneurons+as+the+earliest+functional+impairment+in+the+App%28NL-G-F%29+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease.</a> Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).</li>
<li>Ozawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+resonance+in+amygdalo-cortical+circuits+supports+fear+memory+retrieval+following+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction.</a> Nature Communications. 11 (1), 4358(2020).</li>
<li>Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arousal+and+locomotion+make+distinct+contributions+to+cortical+activity+patterns+and+visual+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding.</a> Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).</li>
<li>Beck, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+dopamine+depletion+causes+enhanced+beta+oscillations+in+the+cortico-basal+ganglia+loop+of+parkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats.</a> Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).</li>
<li>Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+activity+in+the+subthalamic+nucleus-globus+pallidus+network+to+cortical+electroencephalogram%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram.</a> Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).</li>
<li>Magill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+functional+connectivity+within+the+rat+striatopallidal+axis+during+global+brain+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).</li>
<li>Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+brain+machine+interfaces%3A+First-in-human+studies%2C+technology+challenges+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends.</a> Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).</li>
<li>Tort, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cross-frequency+couplings+of+local+field+potential+oscillations+in+rat+striatum+and+hippocampus+during+performance+of+a+T-maze+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).</li>
<li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li>
<li>Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+microdrive+arrays+for+chronic+neural+recordings+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50470(2013).</li>
<li>Vandecasteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neurons+by+movable+silicon+probes+in+behaving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3568(2012).</li>
<li>Lansink, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+split+microdrive+for+simultaneous+multi-electrode+recordings+from+two+brain+areas+in+awake+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).</li>
<li>Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multi-electrode+array+design+for+chronic+neural+recording%2C+with+independent+and+automatic+hydraulic+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning.</a> Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).</li>
<li>van Daal, R. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Neuropixels+probes+for+chronic+recording+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats.</a> Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).</li>
<li>Unakafova, V. A., Gail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+open-source+toolboxes+for+processing+and+analysis+of+spike+and+local+field+potentials+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57(2019).</li>
<li>Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Nrf2+enhances+the+upregulation+of+nuclear+factor-kappaB+activity%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+and+matrix+metalloproteinase-9+after+spinal+cord+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice.</a> Mediators of Inflammation. 2010, 238321(2010).</li>
<li>Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-linked+irisin+prevents+mortality+and+enhances+cognition+in+a+mice+model+of+cerebral+ischemia+by+regulating+Klotho+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070(2021).</li>
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<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+oscillation+dysfunction+in+mPFC+leads+to+social+deficits+in+neuroligin+3+R451C+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice.</a> Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

自由に動くマウスのマルチチャンネル記録は、神経科学研究において有用な技術であると考えられてきましたが、初心者が信号を記録して解析することはまだ非常に困難です。本研究では、マイクロドライブシステムの作成と電極注入の簡易ガイドラインと、スパイクソーティングソフトウェアと神経生理学的データ解析用ソフトウェア を介して 電気信号を捕捉および分析するための簡略化された手順を提供します。
自作のマイクロドライブシステムの品質は、自由に動くマウス14,15,16,17の安定で定性的な信号の獲得に大きく貢献することから、本研究では、マイクロドライブシステムのために、より頑丈で軽量な構造を設計・用い、初心者でもマイクロドライブシステムを構築するための製造手順を簡単かつ明確に理解することができる。さらに、設計されたマイクロドライブ...

細胞外シグナルの重要な構成要素である局所電界電位(LFP)は、複数の行動の神経コードを形成するニューロンの大きな集団のシナプス活動を反映しています1。ニューロンの活動によって生じるスパイクはLFPに寄与すると考えられており、ニューラルコーディング2にとって重要である。スパイクとLFPの変化は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患や、恐怖などの感情を媒介することが証明されています3,4。多くの研究で、動物の覚醒状態と麻酔状態の間でスパイク活性が大きく異なることが強調されていることは注目に値します5。麻酔をかけた動物での記録は、高度に定義された皮質同期状態で最小限のアーチファクトでLFPを評価する機会を提供しますが、結果は覚醒した被験者に見られるものとはある程度異なります6,7,8。したがって、脳に埋め込まれた電極を用いて、覚醒した脳状態で様々な疾患の神経活動を長い時間スケールと大きな空間スケールで検出することは、より有意義です。この原稿では、記録と分析を開始するために、スパイク信号とLFP信号を迅速かつ簡単に計算するための一般的なソフトウェアを使用して、マイクロドライブシステムを作成し、パラメータを設定する方法に関する初心者向けの情報を提供します。
頭皮から記録された脳波(EEG)やイベント関連電位(ERP)などによる脳機能の非侵襲的記録は、ヒトやげっ歯類の研究で広く使用されてきましたが、EEGおよびERPデータは空間的および時間的特性が低いため、特定の脳領域内の近くの樹状突起シナプス活動によって生成される正確な信号を検出することはできません1.現在、意識のある動物のマルチチャンネル記録を利用することで、霊長類やげっ歯類の脳にマイクロドライブシステムを移植することで、脳の深層部の神経活動を慢性的かつ漸進的に記録することができます1,2,3,4,5,6,7,8,9 .簡単に言うと、研究者は、脳の異なる部分を標的とするために、電極または四極管の独立した位置決めに使用できるマイクロドライブシステムを構築することができる10,11。例えば、Changらは、軽量でコンパクトなマイクロドライブ12を組み立てることによって、マウスのスパイクおよびLFPを記録する技術を記述した。さらに、行動課題中のげっ歯類における複数の単一ニューロンおよびLFPを記録するために、カスタムメイドの付属部品を備えた微細加工されたシリコンプローブが市販されている13。マイクロドライブシステムの組み立てにはさまざまな設計が使用されてきましたが、マイクロドライブシステム全体の複雑さと重量の点で、これらの成功はまだ限られています。例えば、Lansinkらは、単一の脳領域から記録するための複雑な構造を有するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを示した14。佐藤らは、自動油圧位置決め機能15を表示するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを報告した。これらのマイクロドライブシステムの主な欠点は、マウスが自由に動くには重すぎることと、初心者には組み立てが難しいことです。マルチチャンネルの細胞外記録は、行動テスト中の神経活動を測定するのに適しており効率的な技術であることが示されていますが、複雑なマイクロドライブシステムによって取得された信号を初心者が記録および分析することは容易ではありません。自由に動くマウス16,17では、マルチチャンネルの細胞外記録とデータ解析の全操作プロセスを開始することが困難であることを考慮し、本稿では、簡略化されたガイドラインを提示し、一般的に入手可能なコンポーネントと設定を使用してマイクロドライブシステムを作成する詳細なプロセスを紹介します。また、スパイク信号とLFP信号を高速かつ簡単に計算するための共通ソフトウェアのパラメータも提供されています。さらに、このプロトコルでは、ヘリウムバルーンの使用によりマウスを自由に動かすことができ、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺することに貢献します。本研究では、マイクロドライブシステムを簡単に構築し、記録とデータ解析のプロセスを最適化する方法について概説する。

<table><tbody><tr><td>2.54 mmピン</td><td>ヘッダーYOUXIN Electronic Co.、Ltd.</td><td>1 x 5</td> ス<td>トゥルでスライドできる可動式マイクロドライブを申請します。</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>GraphPadから画像を最適化します。</td></tr><tr><td>BlackRock Microsystems</td><td>Blackrock Neurotech</td><td>Cerebus</td><td>このシステムには、ヘッドサッチ、DA変換、アンプ、コンピュータが含まれます。</td></tr><tr><td>真鍮ナット</td><td>東莞Gaosi Technology Co.、Ltd.</td><td>M0.8真鍮ナット</td><td>ナットはネジの位置を固定します。</td></tr><tr><td>真鍮ネジ</td><td>東莞Gaosi Technology Co.、Ltd。</td><td>M0.8 x 11 mm 真鍮ネジ</td><td>可動式マイクロドライブを固定するネジです。</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>広東Zhiyuanバイオメディカルテクノロジー株式会社</td><td>N/A</td><td>生後12週。</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>Biosharp</td><td>15 mL;BS-150-M</td><td>スクロース液を持つマウスの脳を保存します。</td></tr><tr><td>塗料</td><td>の伝導性 Structure Probe, Inc.</td><td>7440-22-4</td><td>コネクタピンとNi線間のリード線接続品質を向上させる。</td></tr><tr><td>導電性銅箔テープ</td><td>3M</td><td>1181</td>干渉<td>を減らすため。</td></tr><tr><td>コネクタ</td><td>YOUXIN Electronic Co., Ltd.</td><td>2 x 10P</td><td>ヘッドテージをマイクロドライブシステムに接続します。</td></tr><tr><td>DC電源</td><td>Maisheng</td><td>MS-305D</td><td>電解病変用の電源装置。</td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>移植終了後、マウスの頭蓋骨に電極アレイを固定します。</td></tr><tr><td>デジタルアナログコンバーター</td><td>Blackrock</td><td>128-Channel</td><td>デジタルデータをアナログ信号に変換するデバイス。</td></tr><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>Alteco</td><td>N/A</td><td>ピンを覆うため。</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>分析後にデータを集計します。</td></tr><tr><td>アイハサミ</td><td>JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.</td><td>N/A</td><td>手術やニッケルクロム線の切断に。</td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>JiangXiYuyuan医療機器有限公司</td><td>N/A</td><td>手術用。</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>JiangXi YuYuan医療機器有限公司</td><td>N/A</td><td>手術やミルコドライブシステムの組み立てに。</td></tr><tr><td>冷凍ミクロトーム</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td>&nbsp;マウスをカットする」スライスに</td></tr><tr><td>脳 溶融シリカ毛細管</td><td>鄭州INNOSEPサイエンティフィック株式会社</td><td>TSP050125</td><td>To&nbsp;は、Ni-chromeワイヤーのガイドチューブとして機能します。</td></tr><tr><td>ガラス微小電極</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>BF100-50-10</td><td>充填されたインクを使用して、注入の目的の場所をマークします。</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>結果を分析して視覚化します。</td></tr><tr><td>ガイドチューブ</td><td>Polymicroの技術</td><td>1068150020</td><td>Niクロムワイヤーをロードするため。</td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>ブラックロック</td><td>N/A</td><td>信号を送信するツール。</td></tr><tr><td>ヘリウムバルーン</td><td>Yili Festive products Co., Ltd.</td><td>24インチ</td><td>ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺するため。</td></tr><tr><td>インク</td><td>セーラーペン(株)</td><td>13-2001</td><td>移植のための望ましい位置を印にするために。</td></tr><tr><td>ヨウ素チンキ剤</td><td>広東Hengjian製薬有限公司</td><td>N/A</td><td>マウスの頭皮を消毒します。</td></tr><tr><td>塩酸塩およびリドカインのリンコマイシン&nbsp; 塩酸塩ゲル</td><td>湖北kangzheng薬剤co.、ltd.</td><td>10g</td><td>炎症を抑えるために使用される薬。</td></tr><tr><td>メロキシカム</td><td>ヴィッキーバイオテクノロジー株式会社</td><td>71125-38-7</td>マウス<td>の術後の痛みを軽減するため。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サイエンティフィカ</td><td>サイエンティフィカ IVM トリプル</td><td>電極アレイの移植用。</td></tr><tr><td>顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ni-E</td><td>&nbsp;脳切片の画像取得</td></tr><tr><td>nanoZ インピーダンステスター</td><td>Plexon</td><td>nanoZ</td><td>マルチチャンネル微小電極アレイのインピーダンス測定や電極インピーダンス分光法(EIS)の実施に。</td></tr><tr><td>NeuroExplorer</td><td>Plexon</td><td>NeuroExplorer</td><td>電気生理学的データを解析するためのツール。</td></tr><tr><td>ニューロエクスプローラー&nbsp;</td><td>Plexon、米国</td><td>N / A</td><td>ソフトウェア。</td></tr><tr><td>Niクロム線</td><td>カリフォルニアファインワイヤー株式会社</td><td>M472490</td><td>35 &mu;m ニッケルクロム線。</td></tr><tr><td>オフラインソーター</td><td>プレクソン</td><td>オフラインソーター</td><td>記録されたマルチユニットをソートするためのツール。</td></tr><tr><td>PCBボード</td><td>杭州Jiepei情報技術有限公司</td><td>N/A</td><td>コンピュータ設計のボード。</td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>シグマ</td><td>P3761</td>マウス<td>を麻酔します。</td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>シグマ</td><td>57-33-0</td>マウス<td>を麻酔します。</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td></td><td>Longer BT100-1F</td><td>灌流用装置</td></tr><tr><td>ポリホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A500684-0500</td><td>マウス脳固定用固定液の主成分&nbsp;</td></tr><tr><td>PtCl4</td><td>天津金博蘭精化学有限公司</td><td>13454-96-1</td><td>金メッキ液の調製。</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>広東Hengjianファーマシューティカル株式会社</td><td>N / A</td><td>マウスの頭蓋骨をクリーニングします。</td></tr><tr><td>銀線</td><td>蘇州Xinye電子有限公司</td><td>直径2mm</td><td>の接地電極と基準電極に適用します。</td></tr><tr><td>スカルドリル</td><td>RWD Life Science</td><td>78001</td><td>マウスの頭蓋骨に2つの小さな穴を慎重に開けます。</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ネジ</td><td>YOUXIN Electronic Co.、Ltd.</td><td>M0.8 x 2</td><td>マイクロドライブシステムを保護し、グランド電極と基準電極をリンクします。</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>68513</td><td>両側運動野の脳位固定装置の座標を行います。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>ダマオ</td><td>57-50-1</td><td>灌流後のマウスの脳を脱水する。</td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>Henkel AG & Co.</td><td>PSK5C</td><td>ガイドチューブとニクロム線を固定します。</td></tr><tr><td>温度調節器</td><td>ハーバード装置</td><td>TCAT-2</td><td>マウスの直腸温を37°Cに維持するため。C</td></tr><tr><td>テトラサイクリン眼軟膏</td><td>広東Hengjian Pharmaceutical Co.、Ltd.</td><td>N/A</td><td>手術中にマウスの目を保護するため。</td></tr><tr><td>スレッドラ</td><td>パラ</td><td>N/A</td><td>バルーンとヘッドステージをリンクします。</td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>ユニリーバplc</td><td>N / A</td><td>電極アレイとマウスの頭蓋骨の間のギャップを覆うため。</td></tr></tbody></table>

自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

プロトコルは自発的および/または特定の行動と電気生理学的な信号を関連付けることによって特定の仕事を遂行するマウスをすることのニューロンの発火およびネットワークローカル電界電位(LFP)の特性を明らかにすることを向ける。この手法は、これらの行動の根底にあるニューロンネットワーク活動を研究する上で貴重なツールとなります。本稿では、自由に動く意識のあるマウスにおける電極の埋め込みとそれに伴う細胞外記録の詳細かつ完全な手順について解説しています。この研究には、微小電極アレイを埋め込むための詳細な方法、マルチチャンネルシステムを使用して運動皮質(MC)内のLFPとニューロンスパイク信号をキャプチャし、その後のオフラインデータ分析が含まれます。意識のある動物におけるマルチチャンネル記録の利点は、より多くのスパイクニューロンおよびニューロンサブタイプを取得して比較できることであり、これにより、特定の行動と関連する電気生理学的信号との関係を評価できる。特に、本研究で説明したマルチチャンネル細胞外記録技術およびデータ解析手順は、行動マウスの実験を行う際に、他の脳領域にも適用できる。

ハイパス(250Hz)フィルタを適用して、生の信号からマルチユニットスパイクを抽出しました(図6A)。さらに、PCAでソートした正常マウスのMCから記録された単位を検証し(図7A-D)、マウスのMCにおける単位の谷幅と波形持続時間を記録した。その結果、マウスのMC推定錐体ニューロン(Pyn)の谷幅と波形持続時間の両方が、推定介在ニューロン(IN)の谷幅と波形持続時間の両方が高いことが示されました(図7E、F;2サンプルのMann-Whitney検定;谷幅、推定Pyn:0.636 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.614 ms ± 0.001 ms、p = 0.002; 波形の持続時間については、 推定Pyn:0.095 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.054 ms ± 0.002 ms、p = 1.402 ...

プロトコルは自由に動く意識のマウスの細胞外の電気生理学的な特性を明らかにするための運動皮質(MC)の細胞外記録の方法論を、またローカル視野の潜在性(LFPs)および興味の行動の根底にあるネットワークの神経活動を評価するために有用であるスパイクのデータ分析記述する。

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by ...

私たちは、電気生理学的信号と行動を相関させることにより、特定のタスクを実行する行動マウスのニューロン発火とネットワーク局所電位の特性を明らかにすることを目指しています。マイクロドライブシステムによるマルチチャンネル細胞外記録は、行動テスト中の神経活動に適しており、効率的な技術であることが示されています。自由に動くマウスのマルチチャンネル記録は、神経科学研究において有用な技術であると考えられていますが、初心者が信号を取得して分析することはまだ非常に困難です。自由に動き回るマウスのマルチチャンネル細胞外記録を、より安定して軽量なマイクロドライブシステムで行う方法と、記録とデータ解析のプロセスを初心者向けに最適化する方法を紹介しました。新しいバージョンでは、チャネル数を増やし、マイクロドライバーシステムのボリュームを減らす予定です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この記事では、我々は手術の手順を説明し、マウスモデルにおける高密度脳造影法（EEG）の買収のためのマウスの頭蓋骨で、極薄ポリイミドベースの微小電極アレイ（PBM...

ポリイミドベースのマイクロ電極を用いて自由に動くマウスの高密度脳波録音

このビデオは、メッシュエレクトロニクスプローブをマウスの脳に注入し、単一ニューロンレベルでの安定した長期記録を示しています。頭蓋骨が露出した麻酔マウスを脳定位固定装置フレームに固定し、プローブのメッシュデバイス領域をドリル穴から脳に注入します。プローブの入出力パッドは回路に接続されており、データ・アクイジション・システムを使用して記録が取得されます。...

マウス脳における安定した単一ニューロン記録のための注射可能なメッシュエレクトロニクス

このビデオは、マウスの脳の特定の領域で聴覚刺激を処理するニューロン活動の研究を示しています。この手法では、抑制性神経伝達遮断薬を塗布し、薬物を局所的な脳領域に適用する前後で、聴覚刺激に対するニューロンの反応を比較します。...

抑制性神経伝達物質ブロッカーの存在下での覚醒マウスにおける聴覚ニューロン応答の調査

このプロトコルは、警戒心の強いラットの皮質下脳構造のニューロン活動を監視するための頭部拘束機構の設計と外科的移植を説明しています。...

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。...

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

覚醒マウスにおいて、細胞外神経活動を同時に記録し、記録部位付近で複数の神経活性物質を放出する電極の構築方法を提示します。この技術により、目的のニューロンへの推定される局所シナプス入力の詳細な分析が可能になります。...

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

ワイヤレス、マルチ チャンネル記録と自由行動下ラットにおける刺激の双方向システムを導入します。システムは軽量でコンパクトなこのように animal´s...

ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタ フェース

ここでは、脳を記録し、心臓の同時ビデオを用いたマウスで計測される生体信号プロトコルを提案脳波 (EEG) や心電図 (ECG)。また発作、パワー スペクトル、心機能および心拍変動の結果として得られる脳波心電図の分析手法について述べる.

てんかんのマウス ・ モデルにおける Neurocardiac 機能障害を識別するために監視同時ビデオ脳波心電図

ミリサイズのコイルと組み合わせた低コスト脳波記録システムにより、マウス脳をin vivoで経頭的に刺激する

このプロトコルは、自由に動くげっ歯類の脳波を記録するための信頼性が高く、簡単にアクセスできるシステムを作成するために開発されました。...

自由に動くマウスにおける慢性マルチサイト脳波記録のための費用対効果が高く低侵襲なプロトコル

このプロトコルは、マウスに大きくて再封閉可能で硬膜を温存する頭蓋窓を作るための二段階の外科的手法を説明しています。この技術により、デフォルトモードネットワークのような分散型深部脳ネットワークから数週間にわたる慢性的かつ多モーダルな電気生理学的記録が可能になります。...

マウスデフォルトモードネットワークの縦方向多モーダル電気生理学記録を可能にする大型再封閉可能な頭蓋窓の手術プロトコル

学ぼう、自由に動くマウスの運動皮質におけるマルチチャンネル細胞外記録の手法。軽量マイクロドライブシステムを用いて局所電位とスパイク活動を記録し、行動と神経活動の相関を解析する効率的なプロトコルを習得できます。

自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

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